Name: 使用 LEXY 和 LINuS 光遗传学工具和自动图像分析来量化活细胞中的核质转运动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习使用光遗传学工具和自动图像分析技术来量化活细胞中的核质转运动力学。该方法为细胞生物学研究提供了高效的数据分析流程，有助于深入理解细胞运输机制。

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我们感谢成像设施MRI（法国生物成像国家基础设施France-BioImaging的成员，https://ror.org/01y7vt929），该设施得到了法国国家科研署（ANR-24-INBS-0005 FBI BIOGEN）的支持；特别感谢Marie-Pierre Blanchard、Julio Mateos-Langerak和Baptiste Monterroso在显微镜设置和FIJI分析方面的帮助。我们感谢Boumendil实验室所有成员提供的建议和富有成效的讨论，尤其感谢Parisa Nobari在项目启动阶段的帮助。我们感谢Joey Dufourd对稿件的校对。
CB研究组的工作得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家癌症研究所（Institut National du Cancer）/法国南部癌症研究中心（Canceropole Grand Sud-Ouest）（2023年新兴项目E07）、法国国家科研署（ANR-23-TERC-0015-01 和 ANR-21-CE12-0039）、法国国家癌症研究所（INCa PLBIO23-207-2023-180）以及蒙彼利埃大学（I-SITE计划，France 2030项目，NAChO项目和ChOICe项目）的资助。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

如实验方案中所述，构建稳定细胞系可显著提高分析质量。首先，所有细胞均表达探针，可增加被追踪和分析的细胞核数量，从而增强分析的稳健性。其次，可减少因探针过表达以及转染试剂毒性所导致的细胞死亡。最后，可降低细胞间荧光信号的强烈异质性。这一参数至关重要，因为信号饱和将无法准确检测光照后荧光强度的变化；同样，信号过弱也可能导致荧光淬灭，或无法对差异进行定量分析。因此，我们建议先通过瞬时转染测试探针功能是否正常，并设定成像采集参数，随后尽快构建稳定细胞系。我们已构建了携带 LEXY 和 LINuS 探针的慢病毒载体，可根据请求提供；同时，利用这些慢病毒构建的 NIH/3T3 LEXY 或 LINuS 稳定细胞系也可提供共享。
如果探针是通过转染引入的，或细胞密度较低，则建议的参数可能会减少检测到的轨迹数量，导致分析结果的稳健性降低。在这种情况下，用户可以适当放宽轨迹中遗漏斑点的筛选条件，即降低“轨迹中的斑点数”滤波器的阈值（我们建议至少保留50个斑点中的45个）。注意：如果降低此滤波器阈值，则需手动调整所提供的Excel文件（补充表S1）：因为从导入的CSV文件中粘贴的数值不会自动考虑缺失的数据点。用户需要根据TrackID编号找出缺失斑点的位置，并将其与细胞核编号相对应，这一过程通常需要进行数轮复制和粘贴操作。
确保实验成功的一个关键参数是将细胞保持在黑暗环境中。由于探针会对蓝光产生反应，用户必须确保在采集前至少将细胞在黑暗中运输30分钟。使用一个小型密闭盒子或用铝箔覆盖培养皿即可满足要求。同样，在显微镜下寻找细胞时，必须格外小心，仅使用mCherry光源，因为蓝光照射会激活细胞。如果在显微镜下意外发生了光照，应另选一个远离的视野进行图像采集。在步骤3.6中绘制Z轴轮廓图有助于判断细胞是否受到了光照影响，若曲线呈下降趋势而非平台状，则表明细胞可能已被光照激活。
成像序列设置为包含三个阶段。第一阶段为稳定期，用于评估可能发生的漂白现象，同时确保在未激活状态下 LEXY 的定位保持稳定（1）。第二阶段为激活期，通过脉冲式蓝光照射诱导 LEXY 从细胞核转位至细胞质（2）。最后是可选的恢复期，信号逐渐回到细胞核内的初始位置（3）。
所描述的采集序列可能具有细胞类型特异性19,20。在首次实验中，用户应测试并调整激光功率和时间参数，以观察系统在细胞核与细胞质之间逐步转位的过程。需要注意的是，若激光功率过高或暂停时间过短，可能无法观察到逐步转位现象，而会出现mCherry荧光强度在光照后突然下降或富集（取决于所用探针）的情况。
如果序列优化仍无法解决问题，则可能是核输出信号（NES）和/或核定位信号（NLS）不适用于所使用的细胞类型。用户可参考LINuS方法的相关文章8对探针进行设计和改造。用户也可查阅该文章以了解如何使用落射荧光显微镜对LINuS进行成像。
细胞核分割是分析中的关键步骤。对于探针的活细胞成像，应使用稳定且可靠的核标记物。由于蓝光照射会激活探针的转位，且探针通过mCherry荧光蛋白进行监测，因此该标记物必须能在远红光谱或相近波段被观察到。在本实验中，我们使用SiR-DNA，在孵育1至约24小时期间对细胞进行染色，但也可选用SPY-DNA 650（参见材料表&#160;Materials中的参考文献）。
最后，尽管StarDist分割与TrackMate的过滤追踪相结合已证明其高效性，但仍需注意，用户应始终对分割结果和定量结果进行目视检查。某些正在分裂或死亡的细胞可能被错误地纳入定量分析，而实际上不应包含在内。为降低分析此类事件的风险，所提供的Excel表格会对核相对强度进行颜色编码（蓝色表示低值，红色表示高值）。在使用GraphPad Prism绘图之前，通过检查颜色，用户应能够发现任何异常数值。例如，LEXY的核相对强度应在稳定期较高（红色，核内探针含量高），在光照期结束时降低（蓝色，核内探针含量减少），随后在恢复期再次升高至高值（红色）（如补充表S2所示）。
与先前提出的方法相比，本方案具有多种优势5,6。该半自动分析流程可促进对 LEXY 和 LINuS 核质转运的分析，并比先前提出的 manual 定量方法具有更高的准确性5,6。使用本方案不仅可使该领域的新手高效开展分析，还可为经验丰富的用户提供一种新工具，使其仅需一个开放获取的界面即可完成核质转运的半自动分析。
该方法的应用范围不仅限于研究NIH3T3细胞系中的全细胞核质运输速率。实际上，经过少量优化步骤后，该方法可被改造用于研究探针在多种细胞类型或活体动物中的运输速率8。此外，通过将目标蛋白与LEXY或LINuS融合，也可研究该蛋白的运输速率，或其在光诱导下进出细胞核转位所引发的下游效应。例如，可利用LEXY将蛋白滞留在细胞质中，或利用LINuS强制其定位于细胞核内5,6,21,22,23。最后，文中所述分析方法还可拓展应用于除LEXY和LINuS之外的更多研究场景，以追踪任何可在亚细胞区室之间发生转位且能够被分割识别的信号。

近年来，核质运输（NCT）在调控关键细胞通路和维持细胞稳态中的重要性已被广泛研究1。因此，已开发出多种工具用于研究NCT的动态过程2,3,4。其中，分别于2014年和2016年发表的光遗传探针LINuS5和LEXY6，为在活细胞中监测NCT提供了强有力的方法。这些工具可分别用于追踪荧光报告蛋白的可诱导出核（LEXY）或入核（LINuS）过程，其调控依赖于蓝光照射，并具有可逆性。
简而言之，这两种小型探针利用了植物Avena sativa光敏蛋白-1中LOV2结构域的特性7。在无蓝光条件下，LOV2结构域的Jα螺旋处于光封闭状态并嵌入蛋白核心中。由于Jα螺旋可响应光刺激，蓝光照射会诱导其发生构象变化，从而导致Jα螺旋从LOV2结构域解离。LEXY和LINuS的作者利用这种光敏感性，分别将核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）融合至Jα螺旋上（图1）。由此构建的探针可在蓝光照射下转入细胞核（LINuS）或细胞质（LEXY）。
为了通过荧光成像追踪探针，还在构建体中加入了mCherry荧光报告蛋白。最后，系统中添加了一个弱的核输出信号（NES，用于LINuS）或核定位信号（NLS，用于LEXY），以确保探针在蓝光照射前未处于最终的定位状态，从而避免无法观察到LEXY或LINuS在细胞核与细胞质之间的转位过程。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg" /> 
图1：LEXY 和 LINuS 探针的示意图。两种探针均由 mCherry 蛋白与光敏感的 LOV2 结构域融合而成。两者之间的差异在于被 Jα 螺旋隐藏的信号序列：LEXY 含有核输出信号（NES），而 LINuS 含有核定位信号（NLS）。此外，两种探针均具有一个弱信号序列以控制其初始定位：LEXY 含有一个弱 NLS，而 LINuS 含有一个弱 NES。因此，通过蓝光照射激活系统后，可分别诱导 LEXY 的核输出或 LINuS 的核输入，从而允许研究人员监测核输出或核输入过程。缩写：LEXY = 光诱导核输出系统；LINuS = 光诱导核定位信号；NLS = 核定位信号；NES = 核输出信号。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
mCherry荧光的定位可报告LEXY和LINuS探针在细胞核与细胞质之间的穿梭，因此可在活细胞成像中进行追踪，使用户能够监测核质运输（NCT）。除了作为简单的探针使用外，LEXY和LINuS还可被改造以调控目标蛋白的定位并对其进行研究。 体外5,6,8,9 或 体内10,11.
LEXY和LINuS出版物中提出的定量方法显示了探针的相对核强度。建议的分析需手动完成，依赖于对细胞核和细胞质中感兴趣区域（ROI）的测量。尽管该方法能够较好地反映探针信号随时间的变化，但过程非常耗时且繁琐，尤其是在重复进行实验和不同条件测试时。更重要的是，该方法的准确性有限，因为仅反映了所设计区室的一小部分。
本文提出了一种用于LEXY和LINuS荧光信号定量的新方案。我们采用了自动化技术，可简化分析过程并提高定量准确性。该方案将有助于新用户更便捷地使用这些工具，并提升实验通量。我们的定量方案仅使用一个界面，即开源软件FIJI中的TrackMate12插件。值得注意的是，为提高定量结果的可靠性，我们使用了一种适用于活体成像的远红光DNA标记物，结合经过训练的卷积神经网络StarDist13实现全细胞核分割，并利用TrackMate12对探针的荧光信号进行追踪和测量。
随后，可轻松将获得的数据导出至提供的即用型电子表格（补充表 S1），以计算每个已识别细胞核的相对核强度。本方案还说明了如何通过将获得的时间进程曲线拟合为单指数模型（如 Yoo 和 Mitchison14 所述），将所得数值汇总成图，并计算不同实验条件下物质的转运速率。借助本方案及所提供的分析用电子表格，即使不具备丰富的生物信息学技能，用户也能轻松定量分析活细胞成像数据。

<table><tbody><tr><td>胶原蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 软件</td><td>FIJI</td><td></td><td>ImageJ 2.16.0/1,54p；Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>荧光培养皿</td><td>Dutscher</td><td>FD3510-100</td><td>替代品：Attofluor 培养室（Invitrogen #A7816）</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.4.1</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Importazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>LEXY 质粒</td><td>Addgene</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>LINuS 质粒</td><td>Addgene</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>无酚红 DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td>Spirochrome</td><td>SC007</td><td>替代品：SPY-DNA650（Spirochrome #SC501）</td></tr><tr><td>Stardist 2D 插件</td><td>StarDist</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>TrackMate 插件</td><td>TrackMate</td><td></td><td>TrackMate-7.14.0</td></tr></tbody></table>

利用 lexy 和 linus 光遗传学工具及自动化图像分析定量活细胞中核质运输动态

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

核质运输（NCT）对于维持细胞稳态至关重要，其功能障碍与多种疾病相关，包括神经退行性疾病和肌萎缩侧索硬化症。这凸显了开发用于监测和量化 NCT 的工具的必要性。在这些工具中，快速且可逆的光遗传学探针 LEXY（光诱导核输出系统）和 LINuS（光诱导核定位信号）能够实现活细胞中 NCT 动态过程的测量。
原始文献描述了在活细胞成像中转染LEXY和LINuS构建体后，对细胞核和细胞质中荧光探针信号进行手动分割和定量分析。然而，转染过程和手动分割均限制了可分析细胞的数量，并可能因操作者依赖性误差而引入不精确性。尽管光遗传学所提供的高速度和可逆性理论上应能实现对核质运输（NCT）动态变化的高灵敏度检测，但其效果仍依赖于采集参数以及足够数量细胞的分析。
因此，我们构建了表达 LEXY 和 LINuS 的慢病毒载体，以建立稳定的细胞系，测试了活细胞成像标记物和对照条件，并建立了一条半自动化的图像分析流程，可实现对数百个细胞的分析。该分析方法采用开源软件 FIJI，对生物信息学初学者友好，且无需复杂的计算机配置。本文提供了一步一步的操作方案，以 LEXY 为例展示如何使用这类光遗传学工具监测核输出，涵盖从样本制备、活细胞成像采集到自动化分析的全过程，同时说明如何在任何实验室中针对其他实验条件、对照或模型对方案进行调整。本方案中使用的所有质粒和细胞系都将向科学界公开，从而进一步提升该方法的可及性。

上述方案应能使用户在活细胞成像过程中观察到探针的定位及其转位情况。图4展示了利用LEXY可视化核输出所获得的典型图像示例。经过数轮蓝光照射后，应可观察到细胞核内信号迅速减弱，同时细胞质中信号增强。停止光照循环后，探针信号可逐步恢复。为验证系统有效性，可使用核输出抑制剂Leptomycin B作为对照，该抑制剂可阻止LEXY在蓝光照射下发生核输出，从而证明本分析方法能够可视化输出变化（图4）。
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg" /> 
图4：LEXY信号随时间变化的可视化。 通过活细胞成像获取的稳定期、光照期和恢复期代表性时间点的图像。甲醇处理组作为对照条件。在脉冲式蓝光照射（红色表示）下，mCherry荧光信号（LEXY定位的报告分子）从细胞核转移至细胞质。停止光照后，信号重新回到细胞核内。使用1 nM或0.5 nM的核输出抑制剂Leptomycin B处理后，当核输出被阻断时，LEXY的输出显著减少或完全消失。比例尺 = 30 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在分析过程中，稳定期的核内相对强度值应接近1；而在蓝光激活后，该值应缓慢下降，直至光照阶段结束时达到平台期（图5A）。如果下降速度过快或过慢，可对采集参数进行优化（参见讨论部分）。使用足够浓度的莱普托霉素B（Leptomycin B）处理可进一步验证分析方法和技术的灵敏度，此时应能显示核输出被完全抑制，整个实验过程中核内相对强度值稳定在约1的水平。然而，使用中等浓度的莱普托霉素B时，则应观察到轻微的核输出现象（图5A）。这些视觉观察结果应通过定量计算核输出速率加以验证（图5B）。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg" /> 
图5：LEXY的预期相对核强度与转运速率。（A）该图表示LEXY荧光信号的相对核强度随时间的变化，已归一化至稳定阶段的mCherry平均强度。甲醇处理组（对照组，红色）在光照后相对核强度下降一半，而经输出抑制剂Leptomycin B处理的细胞在0.5 nM（浅蓝色）或1 nM（深蓝色）浓度下则未出现此现象。误差线：标准误（SEM）。（B）通过将曲线拟合至单指数模型获得的对照组与Leptomycin B处理组的输出速率。Leptomycin B阻断输出时所得值显著低于对照组。甲醇组（红色）n = 18个细胞，Leptomycin B 0.5 nM组（浅蓝色）n = 19个细胞，Leptomycin B 1 nM组（深蓝色）n = 15个细胞。P值通过双侧Welch's t检验计算。***：P &#60; 1×10−4，****：P &#60; 1×10−5。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 S1：含预设计算的电子表格。 提供此电子表格以方便数据分析。使用 TrackMate 获得的强度值可直接复制并粘贴到该电子表格中，以获得归一化的相对核强度值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充表 S2：LEXY 分析对照条件下预期结果示例。 该电子表格展示了 LEXY 稳定细胞系在对照条件下获得结果的一个示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了如何高效地建立并执行活细胞成像数据的自动化分析，这些数据是通过光遗传学工具追踪核质运输获得的。

利用 LEXY 和 LINuS 光遗传学工具及自动化图像分析定量活细胞中核质运输动态

核质运输（NCT）对于维持细胞稳态至关重要，其功能障碍与多种疾病相关，包括……

我们的实验室研究核孔和染色质组织之间的相互作用。因此，我们研究核孔如何影响染色质组织，但反过来研究染色质组织是否影响核孔功能，特别是在核质运输中。核质转运是一个非常快的过程，因此一项挑战是检测活细胞中核质转运动力学的变化。没有很多工具可用于监测活细胞中的核质转运。通过实施半自动化和改进的技术，我们希望促进这些工具的使用。我们的协议基于深度学习。它限制了误差并大大减少了分析所需的时间。以前需要一天的时间现在只需要一两个小时。首先，在计算机系统上启动 FIJI 软件。选择稳定阶段作为图像一，照明阶段作为图像二，选择恢复阶段作为图像三。将代表三个阶段的三个图像连接起来以生成单个图像。通过导航到文件并选择另存为 TIFF 来保存获取的合并图像以进行分割。接下来，通过选择图像、颜色和拆分通道来拆分 mCherry 通道。然后通过转到文件、另存为和 TIFF 保存分割图像。要在采集过程中检查漂白情况，请依次选择图像、堆栈和绘图 Z 轴轮廓。然后单击“数据”，然后单击“复制第一个数据集”，并将其粘贴到提供的电子表格中，在 Z 轴配置文件单元格下。现在，通过单击“分析”，然后单击“工具”，然后单击“ROI 管理器”，绘制一个圆形感兴趣区域，近似原子核的平均大小。添加投资回报率并通过导航到“更多”并单击“保存”来保存。在延时期间将保存的 ROI 放置在无细胞区域。确保在分析和设置测量值下选择了平均灰度值“。然后单击更多、多度量。选中“测量所有 50 个切片”和“每个切片一个 ROI”，然后单击“确定”记录强度。将所有测量的强度值复制并粘贴到 ROI 背景单元格下提供的电子表格中。然后关闭仅包含 mCherry 通道的图像，并选择具有合并通道的已保存图像。现在，通过依次单击 插件、跟踪和 TrackMate 来打开 TrackMate 插件。确认时间点范围从 0 到 49，然后单击下一步。选择 StarDist 检测器，然后单击下一步。选择通道二，SiR-DNA，进行细胞核分割，并等待该过程完成。在阈值设置窗口中保留默认参数，然后单击下一步。使用平均强度、通道一创建滤波器，以排除具有极端信号值的原子核。创建一个过滤器以选择高于定义阈值的值，创建另一个过滤器以选择低于阈值的值。同样，添加两个区域过滤器以去除碎片或垂死的细胞，然后单击下一步。选择 Simple LAP 跟踪链接，然后点击下一步。接下来，调整跟踪参数。将“连接最大距离”设置为 30 微米，将“间隙闭合最大距离”设置为 15 微米，将间隙闭合最大框架间隙“设置为 3。然后单击下一步。计算完成后，单击“下一步”以设置轨道上的过滤器。要仅选择在整个时间过程中跟踪的原子核，请选择轨迹中最多的点数，然后单击下一步。然后勾选“显示点名称”以在进一步分析中回溯每个细胞核，并根据需要自定义其他显示功能。在页面底部，单击“曲目”并选择“导出为 CSV”以保存测量表。关闭表格并单击下一步继续。现在单击“捕获叠加”作为作，然后按“执行”，然后按“确定”生成带有跟踪细胞核的图像。通过依次单击“文件”、“另存为”并选择 TIFF 来保存图像。要将 TrackMate CSV 文件导入到提供的电子表格中，请单击“数据”选项卡。在“获取转换数据”组下，单击“从文本/CSV”，然后单击“导入”。复制 Spot IDB、Track IDC、Frame I 和平均强度通道 1M 列，并粘贴到所提供电子表格的 A 至 D 列中。首先按单元格 B5 中的轨道 ID、单个细胞核，然后从单元格 C5 中按帧、时间点对结果的字母顺序排序。现在打开 GraphPad Prism，创建一个新工作表，然后从电子表格中复制粘贴时间列。然后将获得的相对核强度值粘贴到 GraphPad Prism 表中。要生成相对核强度图，请导航到“图形”部分，然后选择“XY”作为图形族。然后选择“点和带误差线的连接线”作为图形类型。在绘图设置中，选择“均值和误差”和“SEM”，然后单击“确定”。接下来，要获取导出速率，请单击新建数据表并仅输入稳定阶段和照明阶段的小数点时间。将获得的这些相的相对核强度值粘贴到表格中。在“结果”部分中，单击“XY 分析”，然后单击“指数”。然后选择非线性回归并单击确定。在参数下选择“Plateau followed then a phase decay”作为模型。然后选择一个等于 2.25 的常数作为 X0，一个等于 1 的常数作为 Y0，以及一个等于零的常数作为平台。指示 K 应大于零，然后按确定。创建一个新表并粘贴转置获得的 K 值。在“图形”部分中，选择“列”作为图形族，然后选择小提琴图作为图形类型。选择“显示所有点”作为绘图，然后单击“确定”。在活细胞成像中可视化了光遗传学探针lexy的核输出。在甲醇处理细胞的对照条件下，蓝光照射后核mCherry强度急剧下降，随后在照射后阶段逐渐恢复。用输出抑制剂钩霉素 B 处理导致核输出发生变化，因为探针信号在所有时间点始终保持核状态。相对核强度的定量分析显示，随着时间的推移，核强度缓慢下降，直到在照明阶段结束时达到平台期。中间钩霉素 B 浓度应显示出温和的核输出。根据强度数据计算的输出率证实，甲醇处理细胞的输出率显着更高，0.5 纳摩尔钩霉素 B 的输出率要低得多，并且 1 纳摩尔钩霉素 B 几乎没有出口。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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