使用 LEXY 和 LINuS 光遗传学工具和自动图像分析来量化活细胞中的核质转运动力学
2025年7月22日
该协议描述了如何有效地设置和执行通过光遗传学工具跟踪核质运输获得的活细胞成像数据的自动分析。
我们的实验室研究核孔和染色质组织之间的相互作用。因此，我们研究核孔如何影响染色质组织，但反过来研究染色质组织是否影响核孔功能，特别是在核质运输中。核质转运是一个非常快的过程，因此一项挑战是检测活细胞中核质转运动力学的变化。
没有很多工具可用于监测活细胞中的核质转运。通过实施半自动化和改进的技术，我们希望促进这些工具的使用。我们的协议基于深度学习。
它限制了误差并大大减少了分析所需的时间。以前需要一天的时间现在只需要一两个小时。首先，在计算机系统上启动 FIJI 软件。
选择稳定阶段作为图像一，照明阶段作为图像二，选择恢复阶段作为图像三。将代表三个阶段的三个图像连接起来以生成单个图像。通过导航到文件并选择另存为 TIFF 来保存获取的合并图像以进行分割。
接下来，通过选择图像、颜色和拆分通道来拆分 mCherry 通道。然后通过转到文件、另存为和 TIFF 保存分割图像。要在采集过程中检查漂白情况，请依次选择图像、堆栈和绘图 Z 轴轮廓。
然后单击“数据”，然后单击“复制第一个数据集”，并将其粘贴到提供的电子表格中，在 Z 轴配置文件单元格下。现在，通过单击“分析”，然后单击“工具”，然后单击“ROI 管理器”，绘制一个圆形感兴趣区域，近似原子核的平均大小。添加投资回报率并通过导航到“更多”并单击“保存”来保存。
在延时期间将保存的 ROI 放置在无细胞区域。确保在分析和设置测量值下选择了平均灰度值“。然后单击更多、多度量。
选中“测量所有 50 个切片”和“每个切片一个 ROI”，然后单击“确定”记录强度。将所有测量的强度值复制并粘贴到 ROI 背景单元格下提供的电子表格中。然后关闭仅包含 mCherry 通道的图像，并选择具有合并通道的已保存图像。
现在，通过依次单击 插件、跟踪和 TrackMate 来打开 TrackMate 插件。确认时间点范围从 0 到 49，然后单击下一步。选择 StarDist 检测器，然后单击下一步。
选择通道二，SiR-DNA，进行细胞核分割，并等待该过程完成。在阈值设置窗口中保留默认参数，然后单击下一步。使用平均强度、通道一创建滤波器，以排除具有极端信号值的原子核。
创建一个过滤器以选择高于定义阈值的值，创建另一个过滤器以选择低于阈值的值。同样，添加两个区域过滤器以去除碎片或垂死的细胞，然后单击下一步。选择 Simple LAP 跟踪链接，然后点击下一步。
接下来，调整跟踪参数。将“连接最大距离”设置为 30 微米，将“间隙闭合最大距离”设置为 15 微米，将间隙闭合最大框架间隙“设置为 3。然后单击下一步。
计算完成后，单击“下一步”以设置轨道上的过滤器。要仅选择在整个时间过程中跟踪的原子核，请选择轨迹中最多的点数，然后单击下一步。然后勾选“显示点名称”以在进一步分析中回溯每个细胞核，并根据需要自定义其他显示功能。
在页面底部，单击“曲目”并选择“导出为 CSV”以保存测量表。关闭表格并单击下一步继续。现在单击“捕获叠加”作为作，然后按“执行”，然后按“确定”生成带有跟踪细胞核的图像。
通过依次单击“文件”、“另存为”并选择 TIFF 来保存图像。要将 TrackMate CSV 文件导入到提供的电子表格中，请单击“数据”选项卡。在“获取转换数据”组下，单击“从文本/CSV”，然后单击“导入”。
复制 Spot IDB、Track IDC、Frame I 和平均强度通道 1M 列，并粘贴到所提供电子表格的 A 至 D 列中。首先按单元格 B5 中的轨道 ID、单个细胞核，然后从单元格 C5 中按帧、时间点对结果的字母顺序排序。现在打开 GraphPad Prism，创建一个新工作表，然后从电子表格中复制粘贴时间列。然后将获得的相对核强度值粘贴到 GraphPad Prism 表中。
要生成相对核强度图，请导航到“图形”部分，然后选择“XY”作为图形族。然后选择“点和带误差线的连接线”作为图形类型。在绘图设置中，选择“均值和误差”和“SEM”，然后单击“确定”。接下来，要获取导出速率，请单击新建数据表并仅输入稳定阶段和照明阶段的小数点时间。
将获得的这些相的相对核强度值粘贴到表格中。在“结果”部分中，单击“XY 分析”，然后单击“指数”。然后选择非线性回归并单击确定。在参数下选择“Plateau followed then a phase decay”作为模型。
然后选择一个等于 2.25 的常数作为 X0，一个等于 1 的常数作为 Y0，以及一个等于零的常数作为平台。指示 K 应大于零，然后按确定。创建一个新表并粘贴转置获得的 K 值。在“图形”部分中，选择“列”作为图形族，然后选择小提琴图作为图形类型。
选择“显示所有点”作为绘图，然后单击“确定”。在活细胞成像中可视化了光遗传学探针lexy的核输出。在甲醇处理细胞的对照条件下，蓝光照射后核mCherry强度急剧下降，随后在照射后阶段逐渐恢复。用输出抑制剂钩霉素 B 处理导致核输出发生变化，因为探针信号在所有时间点始终保持核状态。
相对核强度的定量分析显示，随着时间的推移，核强度缓慢下降，直到在照明阶段结束时达到平台期。中间钩霉素 B 浓度应显示出温和的核输出。根据强度数据计算的输出率证实，甲醇处理细胞的输出率显着更高，0.5 纳摩尔钩霉素 B 的输出率要低得多，并且 1 纳摩尔钩霉素 B 几乎没有出口。
概述
该协议描述了活细胞成像数据的自动化分析的高效设置和执行，重点关注核质运输过程。在此方法中使用光遗传学工具提供了对细胞运输机制的洞察。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 活细胞成像
- 核质运输
背景
- 研究核质运输的重要性
- 光遗传学工具在细胞研究中的应用
- 活细胞成像分析的挑战
使用的方法
- 自动分析技术
- 活细胞成像系统
- 光遗传学操纵
主要结果
- 分析细胞运输动力学的效率提高
- 光遗传学工具在跟踪过程中的实用性得到证明
- 关于细胞运输机制的重大发现
结论
- 本研究展示了分析核质运输的新方法。
- 这些发现对理解生物学研究中的细胞机制具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of nucleocytoplasmic transport (NCT) dynamics is critical for understanding cellular homeostasis and disease mechanisms relevant to neurodegeneration. The integration of LEXY and LINuS optogenetic probes with automated image analysis enables high-throughput, reproducible measurement of NCT in live cells, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. This workflow enhances portfolio decision-making by providing scalable, standardized data on transport mechanisms implicated in disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nucleocytoplasmic transport as a disease-relevant pathway.
- Supports functional target validation by quantifying transport kinetics in live cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through reversible, optogenetic control of nuclear import and export.
- Provides predictive confidence for triaging targets linked to neurodegenerative disorders.
Screening & Assay Development
- Establishes stable cell lines for reproducible, scalable NCT assays.
- Automated image analysis increases throughput and reduces user-dependent variability.
- Quantitative readouts enable robust comparison of compound or genetic perturbations.
- Accessible analysis pipeline supports assay standardization across teams.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling live-cell measurement of transport defects.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation in neurodegeneration research.
- Provides quantitative endpoints for risk-adjusted advancement decisions.
- Facilitates biomarker development by linking transport dynamics to cellular phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling high-content, quantitative analysis of nucleocytoplasmic transport in live cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for NCT-related targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screens.
- Analytics: Provides automated, scalable measurements of nuclear-cytoplasmic signal ratios.
- Translational Research: Connects cellular transport phenotypes to disease models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, accessible workflow adaptable to diverse cell systems and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in NCT studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization of live-cell assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models in neurodegeneration pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and optogenetic probe handling.
- Needs access to fluorescence microscopy and FIJI-based image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters.
- Adaptable to various cell lines and experimental conditions with protocol modifications.
- Throughput may be limited by imaging speed and cell line generation timelines.
