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DOI: 10.3791/68589-v
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
This study introduces a co-culture model using bovine theca and granulosa cells, which effectively replicates the in vivo environment. This model facilitates analysis of paracrine signaling and substrate transport, providing insights into follicular dynamics and granulosa cell interactions.
本文介绍了牛鞘细胞和颗粒细胞的共培养模型。该方法有可能作为分析的可靠基础,重点研究卵泡内体细胞之间的旁分泌通讯和底物转运。
牛鞘细胞和颗粒细胞的共培养是分析卵泡类固醇生成细胞之间旁分泌信号传导和底物转运的可靠基础。该模型能够像体内环境一样对膜和颗粒细胞进行区室化,并且使用市售插入物可以实现可重复和标准化的细胞培养。我们可以创建一个生理相关环境来更详细地研究颗粒细胞的相互作用,例如卵泡发生过程中的底物交换或卵泡动力学。
首先,获取牛卵巢。在补充抗生素的PBS中清洗牛卵巢三次,以去除表面的血液和残留物。将卵巢放入玻璃杯中。
用 PBS 填充,刚好足以覆盖卵巢并丢弃溶液。然后添加更多 PBS。将一个卵巢放入玻璃盘中。
使用尺子测量并选择直径在 5 至 11 毫米之间的毛囊进行解剖。现在,用连接到三毫升注射器的 18 号针头刺穿选定的卵泡来吸出卵泡液。立即丢弃卵泡液。
在双目显微镜下转移卵泡。用剪刀在穿刺部位切开毛囊。使用镊子,从打开的毛囊的内表面抓住鞘内层。
从毛囊内壁轻轻剥离内膜。将theca细胞层转移到含有补充有抗生素的PBS的培养皿中,以洗掉剩余的颗粒细胞。然后用手术刀轻轻刮掉膜表面的颗粒细胞。
将膜放入装有新鲜PBS的新培养皿中进行洗涤。通过在缓冲液中轻轻旋转膜来冲洗膜,以去除任何残留的细胞。将 theca interna 转移到 12 孔板孔内的制备消化溶液中。
用手术刀将其切成一到三毫米大小的块。然后将组织碎片转移到准备好的 1.5 毫升反应管中。将试管在保温瓶摇动培养箱中孵育。
孵育 30 分钟后,将试管涡旋三到五秒,然后将它们放回培养箱。在剩余的孵育期内再重复此涡旋步骤三次。孵育完成后,使用移液器重悬消化的细胞。
将溶液通过放置在 50 毫升管上的 100 微米细胞过滤器,以去除任何未消化的组织。准备用于培养菌膜细胞的接种室。将包被的插入物倒置到更大的板中,例如 12 孔板。
将切割和高压灭菌管放在倒置的插入物顶部,确保其牢固安装以防止介质泄漏。将冷冻保存的鞘膜细胞在37摄氏度的水浴中快速解冻三到五分钟。立即将解冻的细胞悬液转移到预热的培养基中。
将膜瓣细胞悬液在500G下离心,在大约20摄氏度下离心三分钟。弃去上清液。然后将沉淀重悬于补充的 α 最小必需培养基中。
将 200 微升细胞悬液接种到接种室中。要关闭细胞培养皿,请使用放置在培养皿每个角落的 1.5 毫升反应管的切割和高压灭菌盖增加板和盖子之间的距离。小心地关闭孔板,不要移位插入物。
然后轻轻地将封闭的板转移到加湿的培养箱中。在每个所需孔中用 500 微升培养基填充 24 孔板。使用镊子轻轻地从插入物中取出腔室。
将含有附着的鞘膜细胞的插入物放入 24 孔板中,膜面朝下。为了接种颗粒细胞,在每个插入物内移液250微升细胞悬液。将共培养物与5%二氧化碳在37摄氏度下孵育六天。
颗粒细胞接种后每 48 小时更换一次培养基,更换 2/3 的培养基体积。Theca 细胞仅表达 CYP17A1,而颗粒细胞主要表达 CYP19A1。培养三天后,theca细胞在胶原蛋白包被膜上表现出扁平和细长的形态,表明附着成功。
当单独培养九天时,鞘细胞增殖并在第九天达到汇合。单独培养六天的颗粒细胞发育成纤维细胞样形态,并形成体外行为特征的簇。在共培养系统中,与各自的单培养相比,两种细胞类型均未观察到形态学差异。
颗粒细胞单培养和共培养的雌二醇水平相似。而 theca 细胞单培养仅产生可忽略不计的量。在单培养和共培养条件下,CYP17A1表达仍然局限于鞘细胞。
在单培养和共培养条件下,CYP19A1表达仍然局限于颗粒细胞。
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