扩充显微镜：使用传统显微镜进行高分辨率荧光成像
2025年12月19日
本文介绍了结合冷冻固定与膨胀显微镜方法（Cryo-ExM）的详细方案，实现高分辨率成像和结构保存，适应各种生物样本。生物样本被冷冻，嵌入膨胀聚合物中，进行变性、扩孔和免疫标记，使得用标准光学显微镜实现超分辨率成像。
我们是细胞生物学家，研究微管在不同模式生物中的作用及其相关功能。我们旨在研究它们在细胞组织、形态发生、纤毛生成和分裂中的作用。在过去五年中，我们通过扩充显微镜技术，促进了对环状分子组成的理解。
由此，我们揭示了它们组装和功能的关键特征。通过结合扩容显微镜与低温凝视，我们的方案实现了高分辨率成像，同时保留了细胞元素的近乎原生结构，克服了超分辨率显微镜的主要局限。扩容显微镜是一种低成本且易于实施的技术，能够让所有实验室都能获得超高分辨率。
首先，用注射器和针头在化学罩下，将每根5毫升管子注入一毫升多干丙酮。把管子竖立放在金属架上，放入液氮中冷冻。将半个30乘30厘米厚壁的聚苯乙烯盒装满干冰，然后用液氮填充Vitrobot型的杜瓦尔，直到蒸发停止。
现在，把蜘蛛从下垂装置上取下，往金属下沉腔室里注入液态乙烷。等待10分钟，让乙烷达到平衡。然后，拿出12毫米厚的封面套，用细镊子轻拍在纸上，吸走盖片上的多余介质。
用装有与低温活塞兼容夹环的镊子将盖套夹半。将镊子夹住盖片放入低温活塞夹，用Whatman纸吸干剩余介质。启动低温活塞，将盖片注入金属腔体内的乙烷溶液中。
然后，迅速将盖纸转移到装有冷冻丙酮的管子中。将装有盖套的管子以大约45度的角度在干冰中孵化。将密封容器放置在设定为50至100转/分钟的轨道摇动器上，并在4摄氏度搅拌过夜，让温度逐渐上升。
接着，取出大部分干冰盒中的干冰。继续在轨道震动器上搅拌45分钟，使温度从零下80摄氏度升至零下20摄氏度。短暂地打开和关闭每个管子以释放内压。
然后，将每个盖玻片转移到12孔板或预装冷藏的100%乙醇溶液的合适容器中。孵化五分钟后，将盖套通过分级乙醇系列重新水合。将封面转印到PBS后，放入显微镜下观察。
用细镊子轻轻划开表面，并将所有盖片朝上放置正确的一面。将盖层放入一个四孔板中，板内填充0.5至1毫升2%丙烯酰胺和1.4%甲醛溶液，浸于PBS中。然后在37摄氏度下将盖玻片在该溶液中孵育，且不搅拌。
接着，将10%APS和凝胶溶液在冰上解冻10分钟后再进行凝胶化。用薄薄的湿纸和防腐剂准备一个湿润的腔室。然后储存在四摄氏度。
10分钟后，将湿润腔体放在冷块上，用于凝胶化。现在，将蛋白固定液中的盖片取下，用纸巾连续两次吸干多余液体。将APS加入胶化溶液中，达到最终0.5%浓度，并进行涡旋2到3秒。
然后，在湿气腔体内滴入两滴35微升的液滴到Parafilm上，轻轻将每个盖片覆盖在一滴液上，细胞朝下进入凝胶溶液中。将湿气箱转移到37摄氏度的孵化箱中，浸泡30到60分钟。变性时，使用直径0.4厘米的活检冲孔工具提取凝胶片段，并将其放入装有一毫升变性缓冲液的六孔板中。
搅拌平板10至15分钟，直到凝胶从盖片上脱落，然后将脱落的凝胶片段转移到装有新鲜变性缓冲液的1.5毫升微离心管中。将凝胶在95摄氏度下孵育90分钟。孵化后，将凝胶放入双倍蒸馏水中清洗10分钟。
用毫米纸测量凝胶直径，以评估凝胶膨胀因子。用约200微升聚赖氨酸溶液清洁盖套。将盖玻片在室温下孵育一小时，然后用双倍蒸馏水清洗三次，以去除多余的聚赖氨酸。
盖片干后，保存在4摄氏度，等待进一步使用。将凝胶正确放置，细胞朝上，放在无绒毛的纸上，晾干以去除多余水分。最后，将干燥的凝胶装在涂有聚D-赖氨酸涂层的盖片上，使其细胞朝下。
冷冻固定比PFA固定更有效地保存了RPE1细胞中的线粒体网络，这一点通过NHS酯和ATP5A染色可见，并且线粒体嵴的分辨是PFA固定时无法看到的。与PFA固定相比，低温固定能更好地保存有丝分裂RPE1细胞中的动态微管，包括胞质和星体微管。布鲁氏锥虫的冷冻固定比PFA固定更好地保存了线粒体的结构和整体细胞结构，这与TDH和NHS酯染色相符。
此外，冷冻固定比基于BIP染色的PFA固定更好地保存了内质网。在冷冻RPE1细胞中观察到裂纹，但这些裂纹并未破坏线粒体或微管等细胞器的超结构。冷冻固定不良表现为气泡状结构和波浪状微管，伴有膜细胞器完整性丧失。
膨胀质量取决于丙烯酸钠溶液的透明度，可用溶液呈现无色或略呈黄色半透明，而不可用溶液则呈现浑浊橙色。
概述
本研究提出了一种结合低温固定和膨胀显微镜（Cryo-ExM）的协议，用于生物样品的高分辨率成像。该方法能够保留细胞元素的近乎原始结构，使标准光学显微镜能够实现超分辨率成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 显微镜技术
- 结构生物学
背景
- 微管在细胞组织和功能中起着至关重要的作用。
- 膨胀显微镜已用于研究分子组成。
- 与传统方法相比，低温固定能够更好地保留细胞结构。
- 超分辨率显微镜技术在结构保留方面常常面临限制。
研究目的
- 开发一种结合低温固定和膨胀显微镜的协议。
- 实现细胞结构的高分辨率成像。
- 改善成像过程中动态微管和细胞器的保留。
所用方法
- 使用低温固定法制备生物样品。
- 将样品嵌入可膨胀聚合物中以进行膨胀显微镜成像。
- 免疫标记以可视化特定细胞组分。
- 利用标准光学显微镜进行成像。
主要结果
- 低温固定法比PFA固定法更有效地保留了线粒体网络。
- 动态微管被更好地保留，允许详细成像。
- 细胞器的结构，包括线粒体和内质网，得以保持。
- 尽管低温固定的细胞中存在一些裂缝，但观察到结构完整性。
结论
- Cryo-ExM协议为高分辨率成像提供了一种可靠的方法。
- 它克服了传统超分辨率显微镜的局限性。
- 这种技术对各种实验室来说是可行且具有成本效益的。
常见问题
Executive Industry Relevance
Expansion microscopy with cryo-fixation enables nanoscale imaging of cellular structures using standard fluorescence microscopes, overcoming the resolution and preservation limitations of conventional super-resolution methods. This capability supports early discovery and target validation by providing high-fidelity visualization of organelles and cytoskeletal elements in near-native states. The approach enhances predictive confidence in structural biology workflows and broadens access to advanced imaging for diverse R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of subcellular architecture relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by preserving dynamic structures such as microtubules and organelles.
- Facilitates mechanistic de-risking through artifact-minimized imaging of cellular assemblies.
- Improves predictive confidence for downstream biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, high-resolution biological systems for quantitative imaging assays.
- Standardizes sample preservation and expansion for reproducible assay outputs.
- Enables scalable imaging workflows using conventional confocal platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on cellular ultrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular phenotypes in preclinical models.
- Maintains translational continuity by minimizing fixation artifacts across sample types.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-resolution structural data.
- Provides mechanistic insights into organelle and cytoskeletal dynamics relevant to therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling high-resolution imaging without specialized nanoscopy infrastructure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing native cellular structures.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides measurable expansion factors and structural readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Ensures continuity of structural data from cell lines to whole organisms.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly accessible, cost-effective imaging capability for multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-fixation, hydrogel embedding, and fluorescence imaging.
- Needs access to confocal or widefield fluorescence microscopes and basic cryo-infrastructure.
- Demands cross-team standardization of fixation and expansion protocols for reproducibility.
- Adaptable to a range of model systems, from cultured cells to whole organisms.
- Expansion quality depends on reagent clarity and precise handling, as supported by source observations.
