Name: 一项用于准确可靠分析心肌损伤的显微镜2,3,5-三苯基四唑氯化物测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学习改进的TTC染色方法，通过冷冻切片和显微成像技术准确检测心肌缺血再灌注损伤。该方法利用Langendorff灌流装置和1%TTC溶液，可清晰区分存活心肌与坏死组织，显著提高心肌梗死评估的图像质量和准确性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由 FoKo 23/2013 和杜塞尔多夫心血管研究所（CARID）资助。

所有实验均经德国北莱茵-威斯特法伦州LANUV批准，并依照ARRIVE指南和《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行。所有必需的仪器和化学品均列于材料表中。
1. 建立Langendorff逆向灌流系统
注意：该系统由一个双联三通旋塞阀组成，该旋塞阀连接至一根主动脉插管，插管由20号钝化针头制成，并带有两个灌注端口，一个用于灌洗液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）端口），另一个用于TTC灌注（TTC端口）。通过切换三通旋塞阀的方向，可交替向心脏输送灌注液。
<ol>
	<li>使用一小段胶带将装置水平固定在150毫米的培养皿上，以防止后续步骤中发生不必要的移动。</li>
	<li>调节套管尖端，使其位于底部上方1毫米处，并与心脏平放时的主动脉根部水平对齐。</li>
	<li>通过PBS加样口，使用10 mL注射器将系统预先充满冰冷的PBS。</li>
	<li>配制新鲜染色液（1% TTC溶于PBS中）；每个心脏至少需要6 mL染色液。 
	注意：TTC通常被认为具有危害性，需谨慎操作，因其可能引起轻度皮肤刺激、严重眼刺激，吸入后有害。废弃物和残留物应按照当地主管部门的要求进行处置。</li>
	<li>使用3 mL注射器将染色液预先注入TTC加样口。</li>
	<li>确保系统内无意外气泡，因为气泡可能导致空气栓塞，干扰后续染色。大多数情况下，气泡在系统中可见；若存在气泡，可在垂直放置套管时，轻轻敲击三通旋塞，同时抽出并重新注入PBS以去除气泡。</li>
	<li>使用6-0丝线打一个松散的半结，并将其套在套管的远端，用于后续固定主动脉根部。</li>
</ol>
2. 心脏样本制备
注意：本研究使用 C57BL/6J 小鼠（20–25 g）。实验性心肌梗死（MI）通过外科手术结扎左前降支动脉（LAD）30–60 分钟诱导，具体方法如下所述。MI 诱导方法已有文献报道8，本文不再详述。除非另有说明，心脏样本均在 MI 后 24 小时采集。
<ol>
	<li>取出心肌梗死小鼠，置于深度异氟烷麻醉（3%，v/v）下，通过颈椎脱位法实施安乐死。 
	注意：所有安乐死操作必须按照当地法规进行适当记录和报告，包括安乐死的原因及所使用的方法。</li>
	<li>将已实施安乐死的动物转移至手术台，并用胶带固定四肢。</li>
	<li>使用显微解剖镊和剪刀去除从中腹部至前肢中部区域的毛皮。</li>
	<li>在膈肌下方稍作位置，于腹壁肌肉层做一条长约2 cm的横向切口，以便后续进行胸腔切开术。</li>
	<li>用精细剪刀剪开膈肌，暴露心脏，然后在皮肤、肌肉和肋骨上做双侧切口，打开胸腔。</li>
	<li>双侧向后剪除膈肌，并通过抬起胸骨充分暴露心脏。</li>
	<li>立即向心脏表面倾倒20 mL冰冻PBS，以停止心跳。</li>
	<li>连同周围组织（肺和食管）一起切除心脏，并将组织块转移至盛有冰冻PBS的50 mL烧杯中，约1分钟，使心跳完全停止。</li>
	<li>将心脏转移至150 mm培养皿中，在双目显微镜下使用精细镊子和剪刀去除主动脉根部周围的结缔组织。</li>
	<li>轻柔移除胸腺，暴露升主动脉。</li>
	<li>通过解剖结缔组织，修整主动脉根部。</li>
	<li>用精细镊子夹起主动脉残端，并将其套入已连接灌注装置的套管上，该装置预先充满PBS和TTC染色液。插入过程中使用精细镊子稳定主动脉根部管壁。</li>
	<li>使用套管上预先打好的松结固定主动脉。在用PBS逆行灌注时，仔细检查套管和心脏。随着进入心脏的PBS体积增加，心室膨胀可直观确认心脏灌注充盈情况。</li>
	<li>保留心外组织（肺和食管）于原位，以维持心脏处于自然且合适的位置。</li>
</ol>
3. TTC 染色
<ol>
	<li>固定插管后，用湿润的组织纸覆盖心脏。</li>
	<li>使用预先连接的、装有冰冻 PBS 的 10 mL 注射器，以 2–3 mL/min 的速度冲洗心脏 3 分钟，直至冠状静脉流出液变澄清。此步骤可确保心脏及冠状动脉内仅残留极少量血液。操作过程中应避免灌注压力过高，以免导致梗死区域心室破裂。</li>
	<li>在双目显微镜下检查心脏，确认主动脉根部无渗漏，并且在灌注压力下心脏能正常膨胀。</li>
	<li>将三通旋塞转向 TTC 溶液方向，通过 TTC 注入口在 30 秒内缓慢注入 1 mL 染色液。</li>
	<li>5 分钟后再次注入 1 mL TTC 溶液，并在再过 5 分钟后（即首次 TTC 灌注后 10 分钟）重复此步骤一次。整个过程共需 3 mL TTC 溶液，分三次灌注，总时长为 15 分钟。</li>
	<li>在双目显微镜下观察心脏表面，此时应已能清晰区分存活心肌（深红色）与坏死组织（浅灰色）。</li>
	<li>使用精细剪刀去除所有非心脏组织，将染色后的心脏转移至含有 3 mL TTC 溶液的 15 mL 锥形管中。</li>
	<li>将锥形管置于 4 °C 过夜，进行浸没式二次染色。</li>
</ol>
4. 组织块制备
<ol>
	<li>将心脏从锥形管中取出，并用纸巾小心擦干。此时，存活心肌的染色更加明显，而非灌注心肌（心外膜及可能的心内膜区域）也呈现淡红色染色。</li>
	<li>使用1 mL注射器将最佳切割温度（OCT）包埋剂填充至钝头弯形20号套管中。</li>
	<li>用精细剪刀切除三尖瓣，并将套管插入右心室。</li>
	<li>向心腔内注入OCT包埋剂（约50–80 µL），当观察到回流时停止灌注。</li>
	<li>暴露二尖瓣，并将套管经左心房和二尖瓣插入左心室。</li>
	<li>轻柔地向心腔内灌注OCT包埋剂（约80 µL），当观察到主动脉有流出时停止灌注。</li>
	<li>准备一个由铝箔制成的小型圆柱形胶囊（直径1 cm），并加入300 µL OCT包埋剂。</li>
	<li>将心脏小心放入胶囊中，保持心尖朝下的位置，并调整为垂直方向。从顶部俯视时，心尖不应过度偏向任何一侧。</li>
	<li>将胶囊浸入预冷至-30 °C至-40 °C的2-甲基丁烷溶液中。</li>
	<li>让样本在溶液中停留5–10分钟，直至完全凝固形成组织块。</li>
	<li>标记组织块，并于-80 °C保存，以备后续组织学分析。</li>
</ol>
5. 冷冻切片与固定
<ol>
	<li>使用OCT包埋剂将组织块固定在冷冻切片机的样品夹头上。</li>
	<li>将样品夹头放入冷冻切片机中，并将温度设置为约 -24 °C。</li>
	<li>切片至可见组织块的尖端。</li>
	<li>将切片厚度设为 50 µm，并每隔一片收集一次，使相邻收集切片之间的间隔为 100 µm。 
	注意：避免冷冻切片过程中出现组织折叠。通过用OCT包埋剂填充空的脑室腔隙可显著减少此类问题（见步骤4.4–4.6）。</li>
	<li>将切片按顺序排列在玻璃载玻片上，每张载玻片放置八片。每颗心脏预计共需80个切片，即10张载玻片。</li>
	<li>用吹风机以最低档位、室温气流（无需加热）吹干载玻片，时间约为10分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入盛有Zamboni固定液（含2% 甲醛和0.4% 苦味酸，w/v）的染色缸中。 
	警告：Zamboni固定液可能引起皮肤过敏反应，并可能具有致遗传缺陷和致癌风险。废弃物和残留物应按照当地主管部门的规定进行处理。</li>
	<li>在4 °C下固定心脏组织过夜。长时间固定可确保心脏组织表面在固定过程中不产生气泡。</li>
	<li>固定完成后，将载玻片从固定液中取出，并用PBS冲洗三次。</li>
	<li>用封片剂封片，并加盖盖玻片。此步骤完成后，心脏切片即可用于图像采集。</li>
	<li>将样本置于载玻片盒中，于室温保存。 
	&#8203;注意：由于甲臜沉淀物不溶于水，染色结果可长期保存多年而不褪色。</li>
</ol>
6. 成像与处理
<ol>
	<li>使用1.25倍物镜设置光学显微镜，并运行CellSens软件进行成像。</li>
	<li>将心脏切片置于视野中央。</li>
	<li>根据需要调整相机的曝光时间、焦距和白平衡。</li>
	<li>采集每张切片的图像，并将同一心脏的所有图像保存至专用文件夹中。</li>
	<li>将R脚本（补充文件1）复制到RStudio平台，并运行基于R语言的自动化算法以评估心肌梗死（MI）。该算法计算每张切片的平面梗死面积，并进一步计算整个心脏的总梗死体积。</li>
	<li>将数据集导出为Excel文件，并根据需要进行数据分析。</li>
	<li>将每颗心脏的所有图像导入ImageJ平台，用于后续三维重建。</li>
	<li>通过ImageJ平台的弹出菜单，按一致且连续的顺序堆叠所有图像。</li>
	<li>使用表面图功能创建三维结构。</li>
	<li>打开体积查看器窗口，并调整所有参数以实现三维投影。 
	注意：免疫组织化学9的方法以及传统TTC染色的视频4,5已有先前报道，本论文中未予包含。</li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., Becker, L., Gross, G., Mentzer, R., Balshaw, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+protection+at+a+crossroads%3A+the+need+for+translation+into+clinical+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Myocardial protection at a crossroads: the need for translation into clinical therapy.</a> Circ Res. 95 (2), 125-134 (2004).</li>
<li>Murphy, E., Steenbergen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+acute+protection+from+cardiac+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury.</a> Physiol Rev. 88 (2), 581-609 (2008).</li>
<li>Bohl, S., Medway, D. J., Schulz-Menger, J., Schneider, J. E., Neubauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+approach+for+quantification+of+in+vivo+ischemia-reperfusion+injury+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Refined approach for quantification of in vivo ischemia-reperfusion injury in the mouse heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (6), H2054-H2058 (2009).</li>
<li>Liepinsh, E., Kuka, J., Zvejniece, L., Vilskersts, R., Dambrova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+heart+and+brain+tissue+preparation+for+digital+macro+photography+after+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rodent heart and brain tissue preparation for digital macro photography after ischemia-reperfusion.</a> J Vis Exp. (180), e62942(2022).</li>
<li>Kim, S. -C., Boehm, O., Meyer, R., Hoeft, A., Knüfermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+closed-chest+model+of+myocardial+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion.</a> J Vis Exp. (65), e3896(2012).</li>
<li>Lindsey, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+experimental+models+of+myocardial+ischemia+and+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 314 (4), H812-H838 (2018).</li>
<li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+refined+TTC+assay+precisely+detects+cardiac+injury+and+cellular+viability+in+the+infarcted+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart.</a> Sci Rep. 14 (1), 25214(2024).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+coaxes+cellular+dedifferentiation+as+a+pro-regenerative+intermediate+that+contributes+to+pericardial+ADSC-induced+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">IL-6 coaxes cellular dedifferentiation as a pro-regenerative intermediate that contributes to pericardial ADSC-induced cardiac repair.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 44(2022).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp1+as+a+pivotal+paracrine+factor+in+the+trained+pericardial+stem+cells+that+foster+reparative+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Sfrp1 as a pivotal paracrine factor in the trained pericardial stem cells that foster reparative activity.</a> Stem Cells Transl Med. 13 (2), 137-150 (2023).</li>
<li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial reperfusion injury.</a> N Engl J Med. 357, 1121-1135 (2007).</li>
<li>Li, C., Chen, M., Zhang, D., Xu, T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+injury+induced+by+obstructive+jaundice%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Perioper+Precis+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac injury induced by obstructive jaundice: a comprehensive review.</a> Perioper Precis Med. 28 (1), 28-38 (2025).</li>
<li>Chang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9F-tubulin+contributes+to+Tongyang+Huoxue+decoction-induced+protection+against+hypoxia%2Freoxygenation-induced+injury+of+sinoatrial+node+cells+through+SIRT1-mediated+regulation+of+mitochondrial+quality+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">ß-tubulin contributes to Tongyang Huoxue decoction-induced protection against hypoxia/reoxygenation-induced injury of sinoatrial node cells through SIRT1-mediated regulation of mitochondrial quality surveillance.</a> Phytomedicine. 108, 154502(2023).</li>
<li>Li, Z., Hu, B., Zou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advances+in+understanding+the+role+and+mechanism+of+pyroptosis+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Perioper+Precis+Med%22%5BJournal%5D)">Research advances in understanding the role and mechanism of pyroptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Perioper Precis Med. 2 (2), 52-63 (2024).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunostaining-based+approach+for+assessing+myocardial+viability+in+the+infarcted+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts.</a> Front Cardiovasc Med. 12, 1598314(2025).</li>
<li>Benedek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TTC+staining+for+the+evaluation+of+tissue+injury+in+the+early+phases+of+reperfusion+after+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats.</a> Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).</li>
<li>Lindsey, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+in+vivo+mouse+models+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Guidelines for in vivo mouse models of myocardial infarction.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (6), H1056-H1073 (2021).</li>
<li>Lujan, H. L., Janbaih, H., Feng, H. -Z., Jin, J. -P., DiCarlo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia%2C+reperfusion%2C+and+infarction+in+chronically+instrumented%2C+intact%2C+conscious%2C+and+unrestrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia, reperfusion, and infarction in chronically instrumented, intact, conscious, and unrestrained mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 302 (12), R1384-R1400 (2012).</li>
<li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+and+area+at+risk+assessment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice.</a> Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

心肌梗死（MI）由持续的心肌缺血引起，仍是全球主要的健康问题，因为缺血性损伤常会损害心脏有效血液循环所必需的收缩功能。在过去的几十年中，人们已投入大量努力，致力于寻找能够增强心脏对缺血应激耐受性的干预措施或化合物1。尽管已探索了多种替代性替代终点指标，例如酶释放11、缺血后功能恢复情况，或培养细胞中的细胞存活性指标1213，但只有对组织坏死程度的直接定量才能明确证实抗梗死干预措施的有效性6。因此，一种能够在完整心脏中可靠且早期检测心肌细胞存活性及心肌梗死的方法，对于推动该领域的研究至关重要14。
在此背景下，四氮唑染色已成为检测心肌梗死（MI）最常用的方法。该技术基于活组织中存在的脱氢酶及辅因子所催化的酶促反应，可将无色的四氮唑盐（TTC）还原为深红色的甲臜色素1...

在过去二十年中，心肌保护一直被视为在心脏遭受严重缺血性损伤后保护心肌细胞的关键策略1。无论是在实验研究还是临床实践中，心肌损伤的最终范围都是评估心肌保护干预措施有效性的关键指标2。因此，对梗死面积进行可靠且准确的评估具有重要价值且十分必要。
在啮齿类动物模型中，评估死后梗死面积的标准方案主要依赖于线粒体脱氢酶的活性，该酶可将无色化合物2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）在存活细胞中酶促转化为红色沉淀物，而在坏死组织中则保持浅灰色3。尽管基于TTC的染色方法简单且成本较低，但仍存在若干方法学上的挑战和内在局限性。这些问题包括心脏切片在TTC溶液中发生收缩，严重扭曲组织结构，导致切片无法平整展开以进行平面测量；样本处理过程中切片厚度不均；以及图像质量较差，难以准确界定梗死边界。近年来，样本制备过程已引入多种技术改进措施，例如使用丙烯酸心脏模具4或对心脏进行半冷冻处理以利于切片3。尽管这些改进显著提高了组织切片的可操作性，传统方法仍依赖于对较厚心脏切片进行宏观成像，常导致图像质量参差不齐且不理想5，颜色对比度不足可能使梗死面积测量引入较大主观性6。此外，传统方法需要使用完整心脏组织，从而无法在同一组织样本上进行多种用途的分析，例如对调控蛋白进行免疫共染色以鉴定参与心脏存活的关键信号通路。因此，通常需要大量实验动物才能充分回答不同的研究问题。
为了克服这些局限性5，我们开发了一种适用于TTC染色显微成像的实验方案。该方法结合了&#34;灌注+浸染&#34;染色步骤与心脏组织冷冻切片技术，将组织切成适合光学显微镜成像的薄片。尽管该方法已有近期报道7，但我们认为提供详细的实验操作流程可显著提升其实用性与可及性。此外，由于显微TTC方法可生成包含多个心脏切片层面的高分辨率图像，我们开发了一种稳健的、基于颜色的半自动分析算法，以应对大规模图像数据集分析耗时的问题。本方法可在数分钟内实现梗死区域的快速检测及全心梗死面积的定量分析。
总体而言，本文介绍的实验方案是一种有价值的工具，可帮助研究人员高效、简便且准确地实施该方法。

<table><tbody><tr><td>1.25倍物镜</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 1.25X/0.04</td><td>成像</td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>B.Braun</td><td>4617100V</td><td>逆行灌注</td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>Milipore</td><td>1.08380.0100</td><td>化学品</td></tr><tr><td>20 G 套管针</td><td>BD</td><td>305895</td><td>逆行灌注</td></tr><tr><td>3&amp;nbsp; mL 注射器</td><td>B.Braun</td><td>4617022V</td><td>逆行灌注</td></tr><tr><td>三通阀</td><td>B.Braun</td><td>16494C</td><td>逆行灌注</td></tr><tr><td>Aquamount&amp;nbsp;</td><td>BDH</td><td>362262H</td><td>冷冻切片</td></tr><tr><td>天平</td><td>Ohaus</td><td>N/A</td><td>称量化学品</td></tr><tr><td>双目解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>插管</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Janvier</td><td>N/A</td><td>实验动物</td></tr><tr><td>相机</td><td>Olympus</td><td>UC30</td><td>成像</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Epredia</td><td>BB02400500A113MN20</td><td>冷冻切片</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>M850</td><td>冷冻切片</td></tr><tr><td>双蒸水</td><td>Milipore</td><td>N/A</td><td>溶解化学品</td></tr><tr><td>精细解剖剪</td><td>AESCULAP</td><td>BC702R</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>精细显微解剖镊&amp;nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FM001R</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>玻璃载玻片</td><td>Engelbrecht</td><td>11102</td><td>冷冻切片</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.54g</td><td>图像处理</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal</td><td>14150097146754</td><td>化学品</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Roth</td><td>&amp;nbsp;0733.1</td><td>化学品</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX61</td><td>成像</td></tr><tr><td>显微解剖镊&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>11152-10</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>化学品</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td>逆行灌注</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td>化学品</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Posit Software</td><td>2024.09.0</td><td>图像处理</td></tr><tr><td>丝线缝合线</td><td>F.S.T</td><td>18020-60</td><td>逆行灌注</td></tr><tr><td>软件</td><td>Olympus</td><td>CellSens V3.2</td><td>成像</td></tr><tr><td>不锈钢解剖剪</td><td>AESCULAP</td><td>BC257R</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>Zamboni 固定液</td><td>Morphisto</td><td>12773.0050</td><td>化学品</td></tr></tbody></table>

一种用于心肌损伤精确可靠分析的显微级氯化三苯基四氮唑检测法

A Microscopic 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride Assay for Accurate and Reliable Analysis of Myocardial Injury

在本实验方案中，我们介绍了一种基于2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）的优化方法，可用于在细胞分辨率水平上对心肌梗死（MI）进行准确且可靠的分析。该方案包括在心肌梗死发生24小时后对梗死心脏进行两步TTC染色：第一步为灌注，即通过主动脉插管将1% TTC溶液逆行灌注至冠状血管系统；第二步为浸染，即将心脏随后在4 °C条件下于TTC溶液中过夜孵育。染色完成后，将心脏包埋于OCT包埋剂中，并以100 µm为间隔进行横向冷冻切片，切片厚度为50 µm。经过Zamboni固定液固定24小时后，在显微镜下可清晰分辨存活心肌组织（深红色）与坏死组织（黄色）之间的锐利边界。值得注意的是，该显微TTC检测法不仅可在急性期（心肌梗死后24小时）检测心肌梗死，还可适用于超过7天的更长时间窗口。由于显微TTC检测可产生多层图像（每颗心脏约80张切片），我们开发了一种稳健的、基于颜色的半自动化算法，能够快速高效地分析大规模图像数据集，并在数分钟内量化整体梗死面积。通过上述改进，本方法显著优化了TTC染色流程，为研究心肌缺血性损伤的实验室提供了一种广泛适用且极具价值的工具。

进行显微TTC染色的关键步骤如图1所示。经过两轮TTC染色后，心脏表面呈现出明显的穿孔状图案。以100-µm间隔对整个心脏进行连续切片，共获得约80个组织切片，结扎部位位于第60个切片附近。在每个切片中，存活心肌细胞（viaCM）呈现深红色染色，而由苦味酸标记的黄色坏死组织（necCM）与之形成清晰对比，边界分明（图2A）。对所有切片进行三维重建，进一步可视化了viaCM和necCM在心脏内的空间分布及体积（图2B）。与传统染色方法相比，显微染色方案提供了更清晰、更锐利的边界以及更高的存活组织与梗死组织信号比（图2C）。在样本处理过程中，用OCT填充心室腔可防止心脏收缩变形，使心脏保持生理形态，且未影响梗死面积的定量分析或引起结构损伤，完整的心内膜层即为佐证（图2D</st...

本实验采用的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）检测法引入了一种优化的TTC染色方案，可在显微分辨率下分析心肌损伤，生成高质量图像，从而在细胞水平上对梗死面积和心肌细胞活力进行准确可靠的评估。

在本方案中，我们介绍了一种改进的基于2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）的方法，用于准确且可靠地分析心肌……

我的研究重点是改进TTC染色方法，以提高图像质量，从而准确检测心肌缺血再灌注损伤。近期进展包括采用冷冻切片和显微成像技术改进TTC检测，以增强心肌损伤的可视化效果。首先，通过PBS加样口，使用10毫升注射器将系统预充满冰冷的PBS溶液。使用一个3毫升注射器，用新配制的1%染色液预先填充TTC端口。用胶带将兰格多夫逆行灌注装置水平固定在直径150毫米的培养皿上，以防止移动。将套管尖端置于培养皿底部上方1毫米处，当心脏平放时，使其与主动脉根部对齐。检查灌注系统是否存在意外的气泡。若发现气泡，需在轻敲三通旋塞并保持套管直立的同时，抽出并重新填充PBS。接着，使用6-0丝线打一个松散的半方结，并将其置于套管远端，以便后续固定主动脉根部。使用显微解剖镊子和剪刀，从已处死并固定的小鼠中腹部至前肢中部区域去除毛皮。然后在膈肌下方的腹壁肌肉上做一条长约两厘米的横向切口，以便后续进行胸腔切开术。接着，使用精细剪刀剪开膈肌，暴露心脏。然后通过皮肤、肌肉和肋骨进行双侧切口，打开胸腔。双侧剪开膈肌并向后剥离，抬起胸骨以充分暴露心脏。立即向心脏表面倾倒20毫升冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS），以停止心跳。然后连同周围组织一起切除心脏。将组织块转移至含有冰冻 PBS 的 50 毫升烧杯中，约一分钟后使心跳逐渐停止。接着，将心脏转移至 150 毫米的培养皿中。使用精细镊子和剪刀在双目显微镜下将主动脉根部的结缔组织剔除干净。然后轻轻移除胸腺，暴露升主动脉。通过解剖结缔组织修整主动脉根部。用精细镊子夹起主动脉残端，并将其套在已连接预充灌装置的套管上。接着，使用套管上预先打好的松结固定主动脉。检查套管位置，并在PBS灌注过程中通过观察心室膨胀来确认心脏是否充盈。保留额外的心脏组织，包括肺和食管，以维持心脏处于自然且适当的位置。插管固定后，用湿润的组织纸覆盖心脏。使用预先连接的10毫升注射器，以冰冷的PBS开始冲洗心脏，直至心脏流出液变得澄清。在体视显微镜下检查心脏，确认主动脉根部无渗漏，并且在灌注压力下心脏能够正常膨胀。随后，将三通旋塞转向TTC溶液方向，通过TTC加样口在30秒内缓慢注入1毫升染色液。在显微镜下观察心脏表面。在此阶段，存活的心肌应呈深红色，而坏死组织呈浅灰色。随后用精细剪刀去除所有非心脏组织，并将染色后的心脏转移至含有3毫升TTC溶液的15毫升锥形管中。将锥形管置于4°C环境下过夜，以通过浸渍实现第二轮染色。为制备组织块，首先使用1毫升注射器将适量的包埋剂（optimal cutting temperature compound）注入钝头弯曲的20号套管针中。用精细剪刀切除三尖瓣，然后将套管针插入右心室。向腔内注入50至80微升OCT包埋剂，当观察到回流时停止注入。将心脏小心地放入装有300微升OCT包埋剂的圆柱形铝箔胶囊中，保持垂直、心尖向下的位置。随后将胶囊浸入预冷至零下30至零下40摄氏度的2-甲基丁烷溶液中。使用OCT将组织块固定在冷冻切片机的样品头夹上。将样品头夹放入冷冻切片机中，并将温度设置为约-24摄氏度。切片至心脏心尖部位可见为止。然后将切片厚度设为 50 微米，并每隔一片收集一次，以确保切片间保持 100 微米的间隔。将收集的切片按顺序排列在玻璃载玻片上，每张载玻片放置 8 片，每颗心脏共制备 10 张载玻片。使用吹风机最低档位以室温气流吹干载玻片，时间约为 10 分钟。将切片浸入盛有Zamboni固定液的染色缸中，固定液含2%多聚甲醛和0.4%苦味酸（质量分数）。在4°C条件下对心脏组织进行过夜固定，以确保组织表面无固定过程中形成的气泡。使用封片剂将切片封固，并加盖盖玻片，完成图像采集前的最终制备。将制备好的切片存放于室温下的切片盒中。为观察切片，使用1.25倍物镜设置光学显微镜，并运行CellSens成像软件。将心脏切片置于视野中央。根据需要调整相机的曝光时间、焦距和白平衡。随后拍摄每个切片的图像，并将同一心脏的所有图像保存在专用文件夹中。将每颗心脏的全部图像导入 ImageJ 平台，用于三维重建。使用 ImageJ 的弹出菜单按顺序堆叠所有图像。然后利用表面图函数创建三维结构。最后，打开体积查看器窗口并调整三维投影的参数。接下来，将 R 脚本复制到 RStudio 平台，并运行自动化算法以评估心肌梗死。该算法将计算每张切片的梗死面积，并计算总梗死体积。将数据集导出为 Excel 文件，并根据需要进行数据分析。在每个切片中，存活心肌细胞的深红色染色与黄色坏死组织清晰可辨，形成界限分明的边界。与传统染色方法相比，该显微染色方案提供了更清晰、更锐利的边界，以及更高的存活组织与梗死区域信号比。用OCT填充心室腔可维持心脏的生理形态，并在不改变梗死面积的情况下保存心内膜层。活心肌细胞的胞质中可见深红色甲臜沉淀，且与心肌肌钙蛋白I染色区域重叠。在缺血50分钟的小鼠心肌梗死模型中，全心平均梗死面积为32.14%，与心室中段以上平面测量的梗死范围相符。梗死面积在心脏不同横切面上存在差异，在心尖区域达到峰值（71.21%），并从该处向结扎部位逐渐减小，直至接近结扎处时降至零。显微TTC染色法显示，即使在心肌梗死发生三天后，仍可观察到梗死区域，坏死核心呈黄色染色，周边区域呈粉灰色。心肌梗死后七天，纤维化瘢痕组织在心肌细胞与非心肌细胞之间表现出可区分的TTC染色。30分钟的心脏缺血诱发了从心内膜开始并向心外膜扩展的波前式损伤模式。当缺血持续时间超过40分钟时， consistently 会诱导出透壁性梗死。我们证明，本研究的显微TTC染色法显著提高了图像质量。该方法增强了图像清晰度和边界定义，能够可靠地界定梗死区域，从而提高了心肌梗死评估的准确性。我们的标准化方法为染色动力学提供了新的选择，将图像精确性与分子变化相关联，并改进了心脏修复的评估。

a-microscopic-235-triphenyltetrazolium-chloride-assay-for-accurate

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

一项用于准确可靠分析心肌损伤的显微镜2,3,5-三苯基四唑氯化物测定

在复杂的生物样本中检测生物标志物正日益指导临床决策。本文介绍一种高灵敏度的方法，可同时检测心肌梗死患者和健康对照者血清样本中的心肌肌球蛋白结合蛋白-C、肌酸激酶同工酶MB以及心肌肌钙蛋白I。...

一种通过电化学发光免疫分析法测定血清心脏肌球蛋白结合蛋白-C的高灵敏度和高特异性定量方法

本文描述了一种在小鼠中建立心肌梗死的高可重复性模型，该模型仅需最少的侵入性操作。该模型易于实施，具有高重复性和高存活率。因此，该模型将减少实验所需的动物数量，符合3R原则（替代、优化和减少）的要求。...

小鼠心肌梗死诱导的微创手术操作

本方法概述了使用量子微计算机断层扫描（MicroCT）结合碘化对比剂，在实验性心肌缺血小鼠模型中评估心脏形态、功能、灌注、代谢及存活能力。该技术可用于多种人类心脏病动物模型的无创、高通量、纵向体内成像。...

体内 心肌结构、功能、灌注及存活性的定量评估：基于心脏微型计算机断层扫描技术

介绍了一种诱导心肌肥厚和心室重构的腹主动脉缩窄大鼠模型。该方法高效、高度可重复且具有微创性，为心肌肥厚及心功能障碍的研究提供了一个简便而有效的研究平台。...

通过腹主动脉缩窄建立大鼠心脏重塑模型

啮齿类动物心肌梗死（MI）的死后评估基于对染色心脏切片上梗死区域的定量分析。本文介绍了一种准确量化梗死面积的方法，该方法通过对收获的大鼠心脏从基底部到心尖部进行系统性取样，并对三色染色的组织学切片进行图像分析。...

大鼠慢性心肌梗死的组织学定量分析

本方案描述了一种将完整心脏心肌组织与磁共振成像（MRI）进行三维比对的新方法。该方法旨在对慢性猪心肌梗死模型中梗死边缘区的心肌内注射进行精确定量评估。...

三维全心心肌组织分析

本文展示了一种标准化急性心肌梗死猪模型采样流程的实验方案，旨在提高该模型在理解心肌缺血/再灌注损伤病理生理机制方面的转化价值，并用于测试新型候选药物。...

通过标准化组织与血液采样流程优化闭胸式猪心肌梗死模型

本文介绍了一种利用JC-1染料检测细胞在缺氧/复氧处理（无论是否添加保护剂）后线粒体膜电位的实验方案。...

一种基于流式细胞术的检测方法，用于测量缺氧/复氧后心肌细胞线粒体膜电位

在充分麻醉的条件下，通过肋间切口将小鼠心脏外置，并使用大多数实验室 readily available...

一种改良的简易小鼠心肌梗死诱导方法

本研究探讨了传统维吾尔草药复方木尼孜克（Munziq）对中国台湾地区异常体液大鼠心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）的心脏保护作用。通过系统的实验方法，我们证实木尼孜克可通过抑制NF-κB信号通路减轻心肌缺血-再灌注损伤。...

草本复方Munziq通过抑制炎症改善心肌缺血-再灌注损伤

再灌注急性心肌梗死（repAMI）中心脏损伤的三维（3D）重建可实现对相关疾病影响模式的精确量化与共定位。本文提供了一种可自动化的光片引导成像方法，用于同时测量心脏损伤、风险区域以及免疫细胞反应。...

利用光片荧光显微镜对再灌注急性心肌梗死中心脏损伤与免疫反应进行同步三维分析

学习改进的TTC染色方法，通过冷冻切片和显微成像技术准确检测心肌缺血再灌注损伤。该方法利用Langendorff灌流装置和1%TTC溶液，可清晰区分存活心肌与坏死组织，显著提高心肌梗死评估的图像质量和准确性。

一种用于心肌损伤精确可靠分析的显微级氯化三苯基四氮唑检测法

探索更多视频