建立辣椒蓟马 （Scirtothrips dorsalis Hood） 饲养系统，用于昆虫病原真菌的毒力筛选

辣椒蓟马是一种经过充分研究的多种作物害虫。我们的研究重点是改进辣椒蓟马育种系统，并将其应用于昆虫病原真菌筛选，以备未来实验。最近的研究主要集中在笼内整株植物上大规模饲养辣椒蓟马。有些人正在探索分离叶子等替代方案，但清晰详细的方法仍然没有得到很好的描述。

本研究建立了一种基于剥离叶的蓟马大规模饲养方法，能够保证辣椒蓟马群落的稳定。此外，还开发了一种稳定且可重复的生物测定系统，用于昆虫病原真菌毒力筛选。该协议解决了使用叶盘掌握蓟马缺乏明确的标准化方法的问题，重点是改善舞台管理和减少资源使用。

该协议简化了发育阶段控制，减少了空间和劳动力需求，并提供了适合大规模和可靠生物测定的一致蓟马供应。我们的实验室将专注于优化大规模饲养方法，并将该协议应用于各种蓟马物种，改善环境和处理条件，以确保生物测定的种群一致和健康。此外，大规模饲养系统可以扩展到使用温室试验。

首先，剪掉长满辣椒蓟马的叶子和花朵。将它们转移到塑料拉链袋中，确保用内部空气密封袋子，以保持裂口的活力。接下来，获得一个高 35 毫米、内径 45 毫米的玻璃饲养容器。

在容器底部放置三层直径 40 毫米的圆形纸巾。在纸巾上加入 8 至 10 滴过滤水以保持湿度。现在，彻底清洗一片年轻的芒果叶。

在光学显微镜下检查它，以检查是否有昆虫卵或其他昆虫污染。用皮刀将芒果叶切成直径 40 毫米的圆盘，然后放在玻璃饲养容器内的湿纸巾上。在光学显微镜下以 10 倍放大倍率观察辣椒蓟马。

使用细画笔，将 10 只成年蓟马（包括 5 只雄性和 5 只雌性）转移到准备好的玻璃饲养容器中。然后用两层封口膜密封每个玻璃饲养容器。使用数字 0-0 的昆虫针在封口膜上打大约 40 个小孔，以确保适当的通风。

将密封的玻璃饲养容器放入培养箱中 48 小时。在体视显微镜下观察叶组织，以确认是否存在指示卵子位置的卵。然后将新鲜的芒果叶盘放在装有鸡蛋的叶子上，并在纸巾上加入 8 至 10 滴过滤水以保持湿度。

为了维护蓟马，将含有一龄幼虫的叶子直接转移到新的玻璃饲养容器中。每天观察辣椒蓟马。为了大规模饲养辣椒蓟马，首先从维持的种群中收集雌性成年蓟马。

将 10 只雌性成年蓟马转移到准备好的饲养容器中以获得卵。然后用细画笔轻轻地将大约 120 只一龄幼虫转移到新的玻璃饲养容器中。为了进行分子鉴定，将一只成年辣椒蓟马收集到1.5毫升离心管中。

使用颗粒杵将辣椒蓟马均质化。然后根据制造商的方案使用商业试剂盒分离基因组 DNA，并使用 PCR 预混液扩增。通过在1%琼脂糖凝胶中电泳检查PCR扩增子，以验证扩增结果。

从凝胶中切除大小约658个碱基对的靶带。使用默认参数对 NCBI 数据库执行爆炸搜索以确认物种身份。为了制备昆虫病原真菌，将两到三毫升0.03%吐温80添加到在1/4强度的Sabouraud葡萄糖琼脂上生长的10至14天龄真菌培养物的表面。

使用无菌环轻轻刮掉分生孢子。将真菌悬浮液转移到干净的 15 毫升离心管中。然后通过以最大速度涡旋使悬浮液均质化。

用滤纸过滤悬浮液，去除hyfil碎屑，得到纯分生孢子悬浮液。使用血细胞计数器在光学显微镜下检查分生孢子的数量。稀释悬浮液至浓度为每毫升 10 的 8 次方分生孢子。

然后将分生孢子悬浮液转移到用紫外线灭菌的微型喷雾器中，用于随后的生物测定应用。从蓝莓农场收集并清洗蓝莓嫩叶。风干后，在体视显微镜下检查它们的表面，检查是否有任何残留的节肢动物或卵，如果存在，请将其取出。

现在，使用皮革切割机切割直径 2.8 厘米的叶盘。然后用 1% 次氯酸钠溶液对叶盘进行消毒。三用消毒水冲洗两次，去除漂白剂残留物。

接下来，将三毫升 2.5% 水琼脂倒入层流罩内的小玻璃容器中。然后轻轻地将叶盘近轴面朝上转移到琼脂上并稍微嵌入，以便只有一小部分暴露在表面上方。琼脂完全凝固后，考虑玻璃容器已准备好进行生物测定。

在应用之前，彻底涡旋分生孢子悬浮液。使用微型喷雾器，从玻璃容器内约 10 厘米的距离将 0.1 毫升悬浮液均匀涂抹在每个叶盘的表面上。现在用细画笔将 10 龄幼虫转移到每个玻璃容器中。

用两层封口膜密封每个容器。使用数字 0-0 的昆虫针在封口膜上创建大约 30 个通风小孔。然后将容器放入培养箱中 7 天。

每天在体视显微镜下以 10 倍放大倍率观察并记录辣椒蓟马的死亡率，持续 7 天。将死去的幼虫放在玻璃容器内进行真菌病观察，以确认内源性病原真菌感染。对于选定的昆虫病原真菌的生物测定，准备三种浓度的分生孢子悬浮液。

将悬浮液接种到不同的饲养容器中。在执行单因素方差分析之前，使用反正弦变换转换每种真菌菌株的死亡率数据，以确定处理之间的显着差异。然后使用遗嘱认证回归分析计算中位致死时间和中位致死浓度值。

明显观察到辣椒蓟马在幼虫早期、幼虫后期和成虫期等各个生命阶段的形态特征。靶向部分 COI 基因的聚合酶链反应扩增产生了一条条带，证实了田间采集的蓟马是辣椒蓟马的身份。分离式叶育系统成功支持辣椒蓟马群落的建立，在7 d观察期内观察到对照组的存活率为90%。

在测试的昆虫致病真菌分离株中，冬虫夏草 NCHU-213 在接种后 7 天导致的辣椒蓟马幼虫死亡率最高，其次是冬虫夏草 NCHU-298，而白杨冬虫夏草的毒力较低。冬虫夏草 NCHU-213 和冬虫夏草 NCHU-298 的 LT50 值为 10 的 8 分生孢子每毫升 8 次方显示出相似的值，并且表现出比白僵草更短的天数。在感染冬虫夏草分离株的蓟马尸体上明显观察到真菌病，如覆盖其身体的真菌生长物所示。

在接种后 4 天和 5 天，用冬虫夏草 NCHU-213 处理的蓟马的死亡率明显呈剂量依赖性增加，而 7 天后以 10 的每毫升 7 个分生孢子的幂观察到的死亡率最高，为 71.4%，其次是 58.9% 的 10 分生孢子 8 次方/毫升，44.4% 的 10 分生孢子的 6 次方每毫升。