优化的小鼠经巩膜微创视网膜下注射技术

视网膜下注射是研究遗传性视网膜疾病疗法的重要临床前工具。在本视频中，我们介绍一种经过优化的、对小鼠进行微创视网膜下注射的技术。经巩膜的视网膜下注射是将物质递送至光感受器和视网膜色素上皮（RPE）的有效方法。

然而，该技术在操作上具有较高的难度，需要建立一种经过优化的实验方案以提高其可重复性和可及性。我们的改进包括开发了一种小鼠眼睑拉钩、术前给予阿托品、使用钻石刀制作针尖大小的巩膜切口，以及对注射针头尺寸和注射方法的优化。我们希望本方法所具备的一致性、可重复性、优异的转导覆盖范围以及最小化的手术损伤，能够提升视网膜下注射技术在科研领域的可及性。

我们的优化使小鼠视网膜下注射操作更简便、更快速，减少实验变异性，并提高注射成功率。该技术将促进未来临床前转化性视网膜研究。开始前30分钟，按1毫克/千克剂量经腹腔注射阿托品，总体积为50微升。

用所需体积的注射溶液填充玻璃微针。将微针连接至显微注射仪，并将补偿压力设定为五个百帕，以抵消毛细作用。将麻醉后的小鼠置于解剖体视显微镜下。

滴入一滴0.5%丙帕他卡因于眼部，以实现局部麻醉。滴入一滴含有0.2%环戊通和1%去氧肾上腺素的混合液于眼部，以扩大瞳孔，便于术后对视网膜下隆起进行成像，并减少术中出血。使用定制的微型金属开睑器暴露上方穹窿部，并固定开睑器，以实现免手操作的上眼睑牵拉。

使用斜角Vannas剪刀，在上方结膜和Tenon囊的角膜缘后约一毫米处做一对角膜缘切口，以暴露上方巩膜。仔细清除注射部位上方Tenon囊的任何残留组织。现在用带锁齿状镊子夹住结膜环切口和肌腱切断处的前缘。

然后轻柔地将眼球向下推，以暴露上方的巩膜。立即向眼内滴加一滴平衡缓冲盐溶液，以保持裸露巩膜的湿润，并获得更好的光学放大效果。使用钻石刀，在约12点位置、距角膜缘1至2毫米处做一个针尖大小的巩膜切口。

将刀片与巩膜呈切线方向放置，以确保巩膜切口小而浅。使用手术海绵轻轻吸除眼球表面所有的平衡缓冲盐溶液。将针头斜面朝下，以浅角度接触巩膜，缓慢将针尖插入巩膜切口，推进约0.5至1毫米，以进入视网膜下腔，同时避免穿透视网膜。

保持针头稳定，使用脚踏板以500百帕的压力开始注射，并持续加压15秒。拔出针头后，观察到部分注入液从巩膜切口处反流，表明给药成功，因为视网膜下腔无法容纳所注射溶液的全部体积。小心移除固定镊和眼睑撑开器，避免对眼球施加压力，以防进一步反流。

注射后立即在眼球表面涂抹足量的润滑性眼膏，以帮助观察视网膜下隆起。经巩膜注射后，光学相干断层扫描（OCT）可清晰显示视网膜下隆起，证实递送成功。为评估视网膜色素上皮（RPE）的靶向效果，注射了AAV-8 dystrophin 1-GFP，结果显示上皮层广泛出现绿色荧光，表明采用经巩膜途径可实现高效且广泛的RPE转导。

AAV-8 视紫红质 GFP 在视杆光感受器中产生了强烈的绿色荧光信号，在横截面和眼底图像中均可见，表明光感受器细胞的靶向和表达成功。AAV8-CAG-mCherry 在视网膜各层产生广泛的红色荧光，表明该技术能够支持跨多种细胞类型的广泛转基因表达。视网膜裂解物的蛋白质印迹分析也显示出强烈的绿色荧光蛋白表达，其中表达水平最高区域对应于注射液泡的中心，进一步验证了 AAV8 视紫红质 GFP 对光感受器的有效转导。

利用视网膜切片的免疫荧光分析优化AAV滴度，可选择出能够转导约90%靶细胞的病毒滴度。例如，在本例中，AAV8视紫红质GFP病毒原液以1:10稀释后，几乎在所有感光细胞中均实现了转基因表达；相比之下，1:100稀释则导致转导率不足。

视网膜电图显示，经巩膜注射可维持正常的视网膜功能，而经视网膜注射则导致A波和B波反应显著降低，提示视网膜损伤。