Name: 优化的小鼠微创经巩膜视网膜下注射技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 学习优化的小鼠微创经巩膜视网膜下注射技术，用于遗传性视网膜疾病的临床前治疗研究。该方法通过改进器械和手术流程，显著提高注射成功率并减少视网膜损伤，为光感受器和视网膜色素上皮细胞的高效转导提供可靠方案。

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感谢加州大学伯克利分校的 John Flannery 提供 AAV1-Best1-GFP 病毒。资助来源：NIH R01 EY031748（CBR），NIH P30 EY005722（授予杜克大学）；FFB Free Family AMD 奖项（CBR）；防盲研究组织的无限制资助（杜克眼科中心）；FFB 转化研究加速项目 TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP（VA）；NIH K08 EY033857（OA）；杜克大学医师科学家启航奖（OA）。

所有实验均遵循杜克大学机构动物护理和使用委员会以及视觉与眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行。
1. 动物准备
<ol>
	<li>在进行视网膜下注射前30分钟，给予小鼠腹腔注射1 mg/kg的阿托品（总体积为50 μL）。此步骤可显著提高手术成功率，通过预防因注射过程中短暂眼内压升高所引发的潜在致命性眼心反射和眼肺反射11,12。 
	注意：我们的阿托品剂量适用于C57BL/6小鼠，其他品系小鼠可能需要调整剂量。我们未观察到阿托品剂量在性别或年龄之间存在明显差异。</li>
	<li>在整个操作过程中，将小鼠置于温热表面上，以最大限度提高动物舒适度，并减少冷诱导性白内障的发生。</li>
	<li>使用2%异氟烷（氧气流速为2 L/min）吸入麻醉小鼠，直至小鼠呈侧卧状态且对足趾夹捏无反应。随后在眼部滴加一滴0.5%丙美卡因以实现局部麻醉。</li>
	<li>在眼部滴加一滴0.2%环戊通与1%去氧肾上腺素的混合液，以扩大瞳孔，便于术后通过光学相干断层扫描（OCT）观察视网膜下隆起。去氧肾上腺素还可通过收缩浅表血管减少术中出血13。</li>
</ol>
2.&#160;巩膜切口术
<ol>
	<li>在开始操作前，用所需体积的待注射溶液填充玻璃微针。将微针连接至显微注射仪，并将补偿压力设定为5百帕（hPa），以抵消毛细作用。我们通常使用1 μL体积进行视网膜下注射。</li>
	<li>将小鼠置于解剖体视显微镜下。步骤2.3–2.6使用20倍放大倍数，步骤2.7–3.5使用50倍放大倍数。</li>
	<li>对于幼龄小鼠，应在操作前进行外眦切开术，以便充分暴露并清晰观察手术区域。</li>
	<li>使用自制的微型金属开睑器暴露上方穹窿部（图1C）。固定开睑器，以实现免手操作的上眼睑牵拉。</li>
	<li>使用斜角Vannas剪刀，在角膜缘后约1 mm处的上方结膜和滕囊膜上做一平行于角膜缘的切口，暴露巩膜上方3至4点钟区域。注意避免刺破眶后静脉窦。仔细但彻底地清除预定注射部位上方残留的滕囊膜组织。</li>
	<li>用带锁齿状镊夹住结膜切口和滕囊膜切口的前缘，轻柔地将眼球向下牵引，以暴露上方巩膜。固定已锁定的镊子，实现免手操作的下牵。</li>
	<li>立即在眼球表面滴加一滴平衡缓冲盐溶液（BSS），防止裸露的巩膜干燥。我们还发现BSS液滴产生的光学放大效应有助于操作。</li>
	<li>使用钻石刀在约12点钟方向、距角膜缘约1–2 mm处制作一个针尖大小的巩膜切口。刀片应与巩膜表面呈切线方向，以确保巩膜切口尽可能小且浅。 
	注意：此步骤基于两个原因：（1）较小的巩膜切口可使玻璃微针紧密嵌合，从而减少注射过程中的回流；（2）浅层切口至关重要，可避免穿透视网膜。需注意，巩膜切口处可能出现少量脉络膜出血，但这对操作结果无不良影响。</li>
</ol>
3. 经巩膜视网膜下注射
<ol>
	<li>注射前，使用外科海绵轻轻擦去眼球表面的所有BSS。</li>
	<li>将针头斜面向下，以与巩膜呈浅角度持针，缓慢而小心地将针尖插入巩膜切口，以进入视网膜下腔。为避免穿透视网膜，操作时应保持相对较小的角度，且插入深度仅需超过巩膜切口0.5–1 mm即可。 
	注意：将针头斜面朝下放置，旨在最大限度降低药物注入脉络膜的可能性，并减少推进针尖时刺穿视网膜的风险。</li>
	<li>保持针头位置稳定后，通过脚踏开关以500 hPa压力开始注射，并持续稳定加压15秒。</li>
	<li>完成注射时，需在完全拔出针头前持续保持注射压力。若针头仍位于视网膜下腔时提前停止加压，注入的液体可能因毛细作用迅速从眼内回流至针管内。</li>
	<li>拔出针头后，可见部分注入液从巩膜切口处反流。这是预期现象，因为即使在成年小鼠中，1 μL的体积也已超过视网膜下腔的容纳能力。若无反流，可能提示注射失败，原因可能是误将药物注入脉络膜或玻璃体腔。</li>
	<li>移除固定镊和眼睑撑开器。操作时注意避免对眼球施加压力，以防导致注入液进一步反流。</li>
	<li>注射完成后，立即在眼部涂抹足量润滑性眼膏，以便通过OCT14观察视网膜下隆起（subretinal bleb）。</li>
	<li>在眼部涂抹红霉素眼膏，并对动物进行常规术后护理。</li>
</ol>

<ol><li>Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+inherited+retinal+degenerations%3A+prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges.</a> Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).</li>
<li>Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+Injection%3A+A+Review+on+the+Novel+Route+of+Therapeutic+Delivery+for+Vitreoretinal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases.</a> Ophthalmic Res. 58, 217-226 (2017).</li>
<li>Simunovic, M. P., Xue, K., Jolly, J. K., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Recovery+Following+Limited+Iatrogenic+Macular+Detachment+for+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Recovery Following Limited Iatrogenic Macular Detachment for Retinal Gene Therapy.</a> JAMA Ophthalmol. 135, 234-241 (2017).</li>
<li>Parikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Alternative+and+Validated+Injection+Method+for+Accessing+the+Subretinal+Space+via+a+Transcleral+Posterior+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach.</a> J Vis Exp. (118), e54808(2016).</li>
<li>Testa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-year+follow-up+after+unilateral+subretinal+delivery+of+adeno-associated+virus+in+patients+with+Leber+congenital+Amaurosis+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Three-year follow-up after unilateral subretinal delivery of adeno-associated virus in patients with Leber congenital Amaurosis type 2.</a> Ophthalmology. 120, 1283-1291 (2013).</li>
<li>Ghazi, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+retinitis+pigmentosa+due+to+MERTK+mutations+by+ocular+subretinal+injection+of+adeno-associated+virus+gene+vector%3A+results+of+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial.</a> Hum Genet. 135, 327-343 (2016).</li>
<li>Bennett, J., Anand, V., Acland, G. M., Maguire, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+comparison+of+in+vivo+reporter+gene+expression+after+recombinant+adeno-associated+virus-mediated+retinal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after recombinant adeno-associated virus-mediated retinal transduction.</a> Methods Enzymol. 316, 777-789 (2000).</li>
<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li>
<li>Hejri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-surgical+method+for+subretinal+delivery+by+trans-scleral+microneedle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A non-surgical method for subretinal delivery by trans-scleral microneedle injection.</a> Bioeng Transl Med. 10 (3), e10755(2025).</li>
<li>Sastry, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscope-Integrated+OCT-Guided+Volumetric+Measurements+of+Subretinal+Blebs+Created+by+a+Suprachoroidal+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Microscope-Integrated OCT-Guided Volumetric Measurements of Subretinal Blebs Created by a Suprachoroidal Approach.</a> Transl Vis Sci Technol. 10, 24(2021).</li>
<li>Blanc, V. F., Jacob, J. L., Milot, J., Cyrenne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oculorespiratory+reflex+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">The oculorespiratory reflex revisited.</a> Can J Anaesth. 35, 468-472 (1988).</li>
<li>Dewar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oculocardiac+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Med%22%5BJournal%5D)">The oculocardiac reflex.</a> Proc R Soc Med. 69, 373-374 (1976).</li>
<li>Katzung, B. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatzung%2C+BG+%22Basic+%26amp%3B+clinical+pharmacology%22">Basic &amp; clinical pharmacology</a>. , 9th ed, Lange Medical Books/McGraw Hill. New York, USA. (2004).</li>
<li>Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Optical+Coherence+Tomography+to+a+Mouse+Model+of+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy.</a> J Vis Exp. (179), e63421(2022).</li>
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<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+in+mice+to+study+retinal+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease.</a> Nat Protoc. 17, 1468-1485 (2022).</li>
<li>Stockslager, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+method+for+automated+measurement+of+glass+micropipette+tip+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Precis+Eng%22%5BJournal%5D)">Optical method for automated measurement of glass micropipette tip geometry.</a> Precis Eng. 46, 88-95 (2016).</li>
<li>Li, Q., Rycaj, K., Chen, X., Tang, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+cell+size%3A+A+causal+link%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and cell size: A causal link.</a> Semin Cancer Biol. 35, 191-199 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述技术对先前描述的经巩膜注射方法4进行了多项改进，提高了操作的可靠性，并进一步减少了对眼部的手术损伤。其中一项改进是使用开睑器牵拉上眼睑，从而实现稳定、无遮挡且无需用手辅助的眼部操作视野。市售开睑器通常即使对成年小鼠也优化不足，而对于幼年小鼠则根本无法使用。为克服这一障碍，我们设计了定制的开睑器（图1C），采用 commercially available 细钨丝制造，因其直径小且刚性极佳。这显著提高了操作的便捷性，增加了手术成功率，并大幅减少了每次注射所需的时间和操作强度。类似地，我们使用带锁齿状镊子向下牵拉眼球，以稳定且无需用手辅助的方式暴露注射部位。上眼睑开睑器与带锁镊子的结合，使术者能够双手同时进行巩膜切开和注射操作，这对于最大限度提高这一精细手术的成功率具有显著优势。
其次，许多视网膜下腔注射方案使用金属针4,15,<su...

视网膜下注射是一种眼科手术操作，通过该操作将物质递送至视网膜与视网膜色素上皮（RPE）之间的潜在腔隙。与其他后段眼内药物递送方式（如玻璃体内注射或脉络膜上腔注射）相比，视网膜下注射能够最直接地接触光感受器细胞和RPE。在递送病毒基因治疗载体时，视网膜下注射可实现更高的光感受器和RPE转导效率，从而允许使用更低的病毒滴度，并降低病毒毒性风险1。此外，视网膜下腔具有解剖学上的局限性，可限制病毒颗粒的全身扩散，减少免疫反应的风险2。在人体中，视网膜下注射的安全性良好，视网膜结构与功能通常在注射后1个月内恢复至基线水平3,4。视网膜下注射已应用于多种场景，如干细胞移植和小分子药物递送2，其中最常见的用途是递送用于治疗视网膜疾病的病毒载体。由于其病毒滴度相对较低、全身暴露最小化，以及转导效率高且靶向特异性强，视网膜下注射已成为视网膜研究领域不可或缺的技术。目前，该技术已成功用于临床治疗遗传性视网膜疾病，包括视网膜色素变性及Leber先天性黑蒙5,6。
鉴于其在该领域的重要性，对小鼠进行视网膜下注射的能力对于研究遗传性视网膜疾病疗法的临床前研究至关重要。然而，目前的小鼠视网膜下注射方法失败率较高，且常导致视网膜手术损伤，这可能限制功能结局指标的可靠性和一致性。传统上，啮齿类动物的视网膜下注射采用经视网膜途径，即针头穿透前部视网膜，绕过晶状体，并通过视网膜的第二次穿刺进入视网膜下腔7,8（图1A）。尽管该操作相对简便，但由于手术损伤程度存在较大变异，导致实验结果出现明显不一致。这对于采用行为学和功能性视觉结局指标的研究尤为不利。此外，与人类相比，小鼠的晶状体相对较大；这显著增加了经视网膜注射过程中晶状体受损的风险，从而使动物无法用于功能性视觉评估4。
另一种选择是经巩膜注射途径，该方法通过后部入路进入视网膜下腔，针头穿透巩膜、脉络膜、布鲁赫膜和视网膜色素上皮（RPE）4,9（图1B）。该方法完全避免了对视网膜的穿刺，从而最大限度地减少了视网膜损伤。此外，该途径还能减少注射物质从视网膜下腔的反流10，从而获得更一致的结果并减少实验动物数量。尽管小鼠经巩膜视网膜下注射技术此前已有文献报道，但其广泛应用仍受限于操作技术难度较高，可能影响成功率4。本文中，我们介绍了几项对该经巩膜注射操作的改进，使其更简便、快速，降低实验变异性，并提高注射成功率。这些改进包括小鼠眼睑拉钩的研制、术前给予阿托品、使用金刚石刀制作针尖大小的巩膜切口，以及优化针头尺寸和注射角度。该技术可实现感光细胞和RPE的高效病毒转导覆盖，且不会引起ERG可检测到的手术影响。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠注射液，USP</td><td>Hospira</td><td>PAA130066</td><td></td></tr><tr><td>1% 硫酸阿托品眼用溶液，USP</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-215-05</td><td></td></tr><tr><td>30&amp;deg; 菱形刀</td><td>Katena</td><td>K2-6560</td><td></td></tr><tr><td>AmScope 6W LED 双蛇形颈照明器</td><td>AmScope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>斜角Vannas剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5618</td><td></td></tr><tr><td>BSS 无菌灌注液</td><td>Alcon</td><td>289010-0902</td><td></td></tr><tr><td>Cyclomydril 扩瞳眼药水</td><td>Alcon</td><td>0065-0359-02</td><td>0.2% 环戊通，1% 去氧肾上腺素</td></tr><tr><td>epT.I.P.S. MicroloaderTM 移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i 显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>E5252000021</td><td>已停产产品</td></tr><tr><td>GenTeal Tears 润滑性眼膏</td><td>Alcon</td><td>16027802</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微注射针</td><td>Clunbury Scientific</td><td>B100-58-50</td><td>30&amp;deg; 斜面。直径：外径 50 &amp;micro;m，内径 29 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>异氟烷溶液</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>MICRON IV 视网膜成像显微镜（带图像引导OCT）</td><td>Phoenix</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Stern-Castroviejo 锁定齿状镊</td><td>Katena</td><td>K5-2552</td><td></td></tr><tr><td>齿状镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5172</td><td></td></tr><tr><td>用于23号针头的钨清洗丝</td><td>Hamilton</td><td>18306</td><td></td></tr><tr><td>Ultracell PVA 眼科穿刺针</td><td>BVI Medical</td><td>40400-8</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Fine2015 胰岛素注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>328438</td><td>3/10 mL，8 mm (5/16&amp;rdquo;)，31G</td></tr></tbody></table>

优化的小鼠经巩膜微创视网膜下注射技术

Optimized Minimally Invasive Transscleral Subretinal Injection Technique in Mouse

在小鼠中，传统向视网膜下腔递送物质的方法需要对神经视网膜进行两次穿刺，这会造成广泛的手术损伤。这种损伤导致后续视觉功能评估指标（如视网膜电图（ERG）记录或行为学视觉检测）的结果出现较大变异性，从而干扰对实验性治疗手段疗效的准确评估。为克服这些障碍，我们优化了一种经巩膜的微创视网膜下注射技术。该技术使用自制的钨丝眼睑拉钩经上方穹窿部进入，实施结膜环切术和肌腱切断术。随后使用钻石刀在巩膜上制造一个微小切口，不穿透视网膜，再以浅角度小心插入一根细玻璃针头，通过微注射泵将物质递送至视网膜下腔。注射后立即采用光学相干断层扫描（OCT）评估视网膜下隆起的大小和位置。我们将该技术与传统的经视网膜方法进行了比较，后者使用弹簧加载式注射器经33G针头制造巩膜切口进行操作。ERG记录显示，经巩膜注射的小鼠视网膜功能得到极好保留，与未注射的对照组小鼠相当；相比之下，传统注射组则表现出明显的ERG信号减弱。综上所述，我们优化了一种适用于小鼠的微创视网膜下注射技术。我们证明，该技术是一种稳健且高效的基因治疗递送方法，可最大限度减少对视网膜的解剖结构损伤，并对视网膜功能影响极小。该方法降低了针对视网膜色素上皮层和光感受器的多种视网膜及黄斑疾病疗法的开发门槛。

采用这种经巩膜技术成功注射后，可通过光学相干断层扫描（OCT）立即观察到视网膜下隆起（subretinal bleb）的形成（图 2A）。鉴于该技术操作难度较高，影像学检查步骤对于准确识别成功注射的动物至关重要。对于计划将该技术用于基因治疗实验的研究人员，我们建议先使用携带荧光报告基因的腺相关病毒（AAV）颗粒进行预实验注射。采用该技术递送的AAV颗粒可实现非常广泛的视网膜色素上皮（RPE）转导区域（图 2B）、光感受器细胞转导区域（图 2C、D），或两者兼有（图 2E、F）。转导区域通常从上方锯齿缘延伸至下方视神经乳头以外。与所有视网膜下注射技术一样，转导效率通常呈不均匀分布，在隆起中心区域达到峰值，并随着距离中心变远而逐渐减弱（图 2B–G</strong...

视网膜下注射是光感受器和视网膜色素上皮（RPE）疾病治疗药物临床前研发中不可或缺的技术。本文介绍一种优化的小鼠经巩膜视网膜下注射技术，可提高术中操作成功率并最大限度减少视网膜损伤。

将材料递送至小鼠视网膜下腔的传统方法涉及对神经视网膜进行双穿刺，这会导致广泛的……

视网膜下注射是研究遗传性视网膜疾病疗法的重要临床前工具。在本视频中，我们介绍一种经过优化的、对小鼠进行微创视网膜下注射的技术。经巩膜的视网膜下注射是将物质递送至光感受器和视网膜色素上皮（RPE）的有效方法。然而，该技术在操作上具有较高的难度，需要建立一种经过优化的实验方案以提高其可重复性和可及性。我们的改进包括开发了一种小鼠眼睑拉钩、术前给予阿托品、使用钻石刀制作针尖大小的巩膜切口，以及对注射针头尺寸和注射方法的优化。我们希望本方法所具备的一致性、可重复性、优异的转导覆盖范围以及最小化的手术损伤，能够提升视网膜下注射技术在科研领域的可及性。我们的优化使小鼠视网膜下注射操作更简便、更快速，减少实验变异性，并提高注射成功率。该技术将促进未来临床前转化性视网膜研究。开始前30分钟，按1毫克/千克剂量经腹腔注射阿托品，总体积为50微升。用所需体积的注射溶液填充玻璃微针。将微针连接至显微注射仪，并将补偿压力设定为五个百帕，以抵消毛细作用。将麻醉后的小鼠置于解剖体视显微镜下。滴入一滴0.5%丙帕他卡因于眼部，以实现局部麻醉。滴入一滴含有0.2%环戊通和1%去氧肾上腺素的混合液于眼部，以扩大瞳孔，便于术后对视网膜下隆起进行成像，并减少术中出血。使用定制的微型金属开睑器暴露上方穹窿部，并固定开睑器，以实现免手操作的上眼睑牵拉。使用斜角Vannas剪刀，在上方结膜和Tenon囊的角膜缘后约一毫米处做一对角膜缘切口，以暴露上方巩膜。仔细清除注射部位上方Tenon囊的任何残留组织。现在用带锁齿状镊子夹住结膜环切口和肌腱切断处的前缘。然后轻柔地将眼球向下推，以暴露上方的巩膜。立即向眼内滴加一滴平衡缓冲盐溶液，以保持裸露巩膜的湿润，并获得更好的光学放大效果。使用钻石刀，在约12点位置、距角膜缘1至2毫米处做一个针尖大小的巩膜切口。将刀片与巩膜呈切线方向放置，以确保巩膜切口小而浅。使用手术海绵轻轻吸除眼球表面所有的平衡缓冲盐溶液。将针头斜面朝下，以浅角度接触巩膜，缓慢将针尖插入巩膜切口，推进约0.5至1毫米，以进入视网膜下腔，同时避免穿透视网膜。保持针头稳定，使用脚踏板以500百帕的压力开始注射，并持续加压15秒。拔出针头后，观察到部分注入液从巩膜切口处反流，表明给药成功，因为视网膜下腔无法容纳所注射溶液的全部体积。小心移除固定镊和眼睑撑开器，避免对眼球施加压力，以防进一步反流。注射后立即在眼球表面涂抹足量的润滑性眼膏，以帮助观察视网膜下隆起。经巩膜注射后，光学相干断层扫描（OCT）可清晰显示视网膜下隆起，证实递送成功。为评估视网膜色素上皮（RPE）的靶向效果，注射了AAV-8 dystrophin 1-GFP，结果显示上皮层广泛出现绿色荧光，表明采用经巩膜途径可实现高效且广泛的RPE转导。AAV-8 视紫红质 GFP 在视杆光感受器中产生了强烈的绿色荧光信号，在横截面和眼底图像中均可见，表明光感受器细胞的靶向和表达成功。AAV8-CAG-mCherry 在视网膜各层产生广泛的红色荧光，表明该技术能够支持跨多种细胞类型的广泛转基因表达。视网膜裂解物的蛋白质印迹分析也显示出强烈的绿色荧光蛋白表达，其中表达水平最高区域对应于注射液泡的中心，进一步验证了 AAV8 视紫红质 GFP 对光感受器的有效转导。利用视网膜切片的免疫荧光分析优化AAV滴度，可选择出能够转导约90%靶细胞的病毒滴度。例如，在本例中，AAV8视紫红质GFP病毒原液以1:10稀释后，几乎在所有感光细胞中均实现了转基因表达；相比之下，1:100稀释则导致转导率不足。视网膜电图显示，经巩膜注射可维持正常的视网膜功能，而经视网膜注射则导致A波和B波反应显著降低，提示视网膜损伤。

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医学

优化的小鼠微创经巩膜视网膜下注射技术

该手术技术演示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。...

围产期小鼠眼内视网膜下注射基因治疗载体与干细胞

来源：Park, S. W., 等. 小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的角膜缘入路视网膜下注射。J. Vis. Exp.

小鼠模型中向视网膜色素上皮的视网膜下注射病毒载体

来源：Parikh, S., et al. 一种经巩膜后入路进入视网膜下腔的替代性且经验证的注射方法。J. Vis. Exp.

向小鼠视网膜下腔递送荧光染料

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

直接注射至大鼠视神经在再生研究中具有重要价值。我们展示了一种微创技术，可实现对大鼠视神经的直接注射，且无需打开颅骨。采用该方法可最大限度减少手术并发症，并加快术后恢复。...

微创大鼠视神经注射技术

视网膜下注射是一种将基因有效递送至小鼠眼内视网膜色素上皮的外科技术。本文介绍了一种在实验小鼠中对视网膜色素上皮进行病毒载体视网膜下注射的简便且可重复的方法。...

经角膜缘入路-小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的视网膜下注射

关键词：角膜缘入路，视网膜下注射，病毒载体，基因治疗，视网膜色素上皮，小鼠

视网膜下注射是将大分子治疗剂（如蛋白质和病毒载体）递送至光感受器和视网膜色素上皮层的最常用技术。本文介绍了一种在小鼠中可有效靶向视网膜下腔、造成最小附带损伤且恢复时间较快的替代方法。...

一种可替代且经过验证的进入视网膜下腔的注射方法 通过 经巩膜后部入路

视网膜下注射已广泛应用于年龄相关性黄斑变性干细胞替代治疗的临床前研究。在本可视化文章中，我们描述了一种经巩膜途径向大鼠眼内递送细胞的、风险更低、可重复且精确改良的视网膜下注射技术。...

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

本文展示了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）将基因治疗药物递送至视网膜下腔、评估其分布范围并表征光感受器活性的新方法。...

超高分辨率小鼠光学相干断层扫描技术在视网膜基因治疗研究中辅助眼内注射

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

本文介绍了利用术中可视化技术来控制注射部位和视网膜脱离范围的大鼠视网膜下注射方法。...

大鼠视网膜下注射与视网膜脱离的术中可视化

学习优化的小鼠微创经巩膜视网膜下注射技术，用于遗传性视网膜疾病的临床前治疗研究。该方法通过改进器械和手术流程，显著提高注射成功率并减少视网膜损伤，为光感受器和视网膜色素上皮细胞的高效转导提供可靠方案。

优化的小鼠经巩膜微创视网膜下注射技术

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