同步无标记自发荧光多谐波显微镜
August 29th, 2025
该协议提供了同步无标记自发荧光多谐波（SLAM）显微技术的分步指南，包括有关如何生成激光光源，制备组织样本，进行成像和分析数据的详细信息。SLAM 通过测量四种互补的无标记对比度来研究组织微环境，从而推进了非线性显微镜的发展。
同步无标记自发荧光多谐波显微镜或 SLAM 显微镜通过测量与光的非线性相互作用来捕获生物样品中的独特信息。在我们的实验室中，我们使用这种技术在微观尺度上研究生命和疾病。我们观察到向无标记多模态成像的转变，为细胞和组织结构和动力学提供了更丰富的见解，同时避免了毒性并实现了跨模式的互补对比和相关性。
最先进的无标记非线性显微镜一次采集一个信号，存在错位、光损坏和大量并发过程的风险。SLAM 通过实现严格共配的多模态对比度来克服这些问题，确保可靠的空间和时间数据。该技术能够在多光子显微镜中同时激发和检测四个通道。
使用光子晶体光纤拓宽 SHG、THG 以及双光子和三光子荧光的脉冲。SLAM 捕获多重代谢结构和动态细胞信号传导信息，无需比对伪影或外源性标记，从而实现标准化的定量组织分析。其应用涵盖肿瘤学、神经变性和组织再生中的基础生物学、转化研究和生物标志物发现。
首先，使用光谱仪或光谱分析仪测量抛物面镜后的激光，并验证光子晶体光纤的超连续谱生成。在偏振分束器之后旋转半程板以优化超连续谱的宽度。打开显微镜自相关器。
在软件中，将检测器设置为内部检测器，并将扫描范围调整为 5 皮秒，以捕获脉冲自相关的整个宽度。解锁激光器并将自相关器对准离开脉冲整形器的光束，直到出现信号。确保快门 2 已关闭。
然后在物镜上涂抹适当的浸入介质，例如水或油。将自相关器外部检测器放在显微镜载物台上，并将其直接放置在物镜上方。现在打开扫描振镜以将其电压设置为 0。
打开快门并使用荧光目标确认光束到达外部检测器。将自相关器检测器设置为外部检测器。然后调整舞台位置，直到出现信号。
调整脉冲整形器的多项式系数，以迭代最小化自相关器测量的脉冲宽度。随着脉冲宽度的减小，相应地减小扫描范围，以提高自相关函数的准确性和可视化。确保光子晶体光纤的激光输入被阻挡并打开激光器。
让激光预热 30 分钟。验证光束路径没有障碍物，然后在光子晶体光纤之前的光束路径中放置一个光功率计。按控制按钮打开快门 1 并测量输入功率。
再次关闭快门 1。将功率计移至抛物面镜后光子晶体光纤的输出端。打开快门 1 并使用输入三轴级来最大化输出功率。
让光子晶体光纤预热10分钟，然后再次使用三轴级最大化输出功率，并记录PCF的传输。将功率计移动到中性密度滤光片之后并旋转滤光片以调节到达样品的激光功率。将测量功率乘以剩余光学器件的透射率以确定样品功率。
现在，打开检流计和舞台。启动采集软件并输入所需的成像参数。使用之前应用于物镜的相同浸入介质将样品放在载物台上。
然后关掉室内灯，拉上窗帘，防止环境光进入。接下来，打开探测器电源和放大器。关闭显微镜载物台周围的灯箱。
使用电子控制开关手动打开探测器百叶窗 3-6。在采集软件中，按“点击开始采集”选项开始 SLAM 成像。使用载物台控制器旋钮调整显微镜焦点，直到样品清晰可见。
使用显微镜载物台控制器上的纵杆找到所需的视野。定位后，单击停止并重置。在“保存”选项卡下，将“保存数据”切换为“是”。
然后按单击开始采集选项并等待成像完成。要在成像过程中纵样品，请关闭探测器百叶窗并使用手电筒或前照灯进行照明。调整后，返回成像设置。
要结束图像采集，请关闭探测器快门，关闭探测器，然后才打开室内灯。使用快门 1 阻挡激光，然后关闭激光。关闭检流计和载物台并关闭采集软件。
适当处理组织样本并清洁工作站。正确切割的光子晶体光纤显示出垂直于其轴线的平坦端面和干净的面。切割不良的光子晶体纤维在表面出现有角度的切口、碎裂的表面以及明显的划痕或碎屑。
处理不当或污染会导致纤维表面周围出现可见的污垢和颗粒堆积，从而遮挡气孔图案。带有深色区域的烧毁核心表明光子晶体光纤在其使用寿命结束时已损坏。超连续谱跨度约为 975-1、175 纳米，具有平顶和独特的光谱调制。
按压后的脉搏自相关显示出对称的轮廓，全宽半极值较窄，表明脉冲整形良好。功能正常的超连续源会产生强的二次和三次谐波信号。变窄的超连续谱导致三次谐波信号强度的损失，同时保留二次谐波信号。
没有脉冲整形大大减少了所有非线性信号，产生了微弱且低对比度的图像。离体肾组织的成功 SLAM 成像显示出独特的肾单位结构，具有多种强光信号，包括三次谐波产生和 NADPH 荧光。肾间质胶原纤维可通过强二次谐波产生信号进行识别。
氧化还原比图像表明，与髓质相比，肾皮质近端小管的有氧线粒体代谢升高。第二张氧化还原比图证实了氧化和糖酵解代谢的空间变化，加强了组织内能量使用的差异。
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概述
本协议提供了一种详细指南，用于同步标签免标自发荧光多谐波（SLAM）显微镜技术，该技术捕获生物样本中的独特信息。SLAM通过测量四个互补的标签免费对比来推进非线性显微镜，以研究组织微环境。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 显微镜技术
背景
- SLAM显微镜测量与光的非线性相互作用。
- 该技术能够同时激发和检测四个通道。
- 它提供了对细胞和组织结构更丰富的见解。
- SLAM避免毒性并在各种模式中实现互补对比。
研究目的
- 研究显微尺度下的生命和疾病。
- 克服传统成像中的对准不准确和光损伤问题。
- 实现可靠的空间和时间数据收集。
使用的方法
- 为成像准备组织样本。
- 使用SLAM显微镜进行成像。
- 分析从成像过程中获得的数据。
- 为显微镜生成激光光源。
主要结果
- SLAM提供了共注册的多模态对比。
- 它增强了对组织微环境的理解。
- 收集到的数据是可靠和全面的。
- SLAM显微镜促进了先进的生物学研究。
结论
- SLAM显微镜是成像技术的重大进步。
- 它允许对生物样本进行无标签的详细分析。
- 该技术有望增强各种生物学领域的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic (SLAM) microscopy enables multiplexed, quantitative imaging of tissue structure, metabolism, and cellular dynamics without exogenous labels. This capability addresses the need for standardized, artifact-free, and reproducible data in early discovery and translational research. SLAM's coregistered multimodal outputs support predictive confidence and mechanistic de-risking at critical pipeline inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of metabolic and structural features in native tissue environments.
- Supports functional target validation by correlating morphological and metabolic states.
- Reduces biological ambiguity by providing simultaneous, artifact-free multimodal readouts.
- Facilitates portfolio triage through robust, label-free phenotypic characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, standardized outputs across multiple optical channels.
- Enables high-content, label-free assay development for multiplexed screening platforms.
- Improves screening reliability by eliminating alignment artifacts and photo-damage risks.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant metabolic and structural biomarkers.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling non-destructive tissue analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in oncology, neurodegeneration, and tissue regeneration research.
- Enhances predictive de-risking by integrating functional and morphological data in situ.
Pipeline & Workflow Integration
SLAM microscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative imaging for hypothesis testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multiplexed, label-free imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-content screening workflows.
- Analytics: Provides coregistered measurements of metabolic, structural, and functional tissue features.
- Translational Research: Enables non-destructive, disease-relevant biomarker analysis in human and animal tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized imaging platform for cross-program R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, multiplexed data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optics and advanced microscopy instrumentation.
- Demands access to ultrafast laser sources, photonic crystal fibers, and sensitive detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data processing pipelines.
- Adaptation across tissue types and disease models may require protocol optimization.
- Instrument maintenance and photonic crystal fiber handling are critical for consistent performance.
