Name: 同步无标记自发荧光多谐波显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学习同步无标记自发荧光多谐波显微镜技术，用于研究生物样本中的非线性光学相互作用。该方法可同时激发和检测四个通道，实现多模态共配准成像，为神经科学和生物物理学研究提供可靠的时空数据。

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本研究所用设备的部分资金由葛兰素史克（GSK）通过贝克曼先进科学与技术研究所的光学分子成像中心提供。本工作还部分得到了美国国立卫生研究院下属国家生物医学成像与生物工程研究所（NIH/NIBIB）无标记成像与多尺度生物光子学中心（CLIMB）（P41EB031772）以及美国国家科学基金会科学与技术中心——定量细胞生物学中心的资助。K.K.D.T. 受美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）毒理学与环境健康研究培训项目（5T32ES007326-25）支持；A.D.C. 受贝克曼先进科学与技术研究所博士后研究员项目支持；A.H. 受国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB）组织微环境培训项目（T32EB019944）支持。作者感谢 Darold Spillman 对实验室空间、设备和技术的管理，同时感谢 Janet E. Sorrells 博士和 Rishyashring R. Iyer 博士在本研究中所使用的SLAM显微镜系统早期开发中的贡献。

作者声明无利益冲突。

产生合适的超连续谱对于成功的SLAM成像至关重要，但由于光子晶体光纤（PCF）的搭建较为复杂，这一过程可能具有挑战性。确保PCF的精确切割和小心操作对于维持表面清洁、避免碎屑、污垢或划痕至关重要，因为这些因素均可能干扰有效耦合、超连续谱的生成，甚至缩短PCF的使用寿命。由于PCF需要定期更换，练习光纤切割并精细调整切割设备参数有助于实现最佳切割效果。此外，PCF的精确对准以及每次使用前的定期重新对准对于生成所需超连续谱至关重要。对准不当还可能导致PCF损坏。由于PCF产生的超连续谱是SLAM显微技术中的关键环节，因此PCF纤芯尺寸和长度的选择是一个重要考虑因素。较长的PCF可产生更宽的超连续谱，但可能会降低输出功率、增加色散、使安装更复杂，并提高更换成本。较小纤芯尺寸的PCF也可产生更宽的超连续谱，但与较大纤芯直径的PCF相比，其寿命通常更短，损伤阈值也更低57。所描述的SLAM显微方法的一个局限性在于PCF质量的不一致性、其对对准的敏感性以及随时间推移性能的下降。此外，更换PCF所需的成本和时间也是重要因素。因此，研究人员正在探索用于SLAM显微技术的其他超连续谱光源<sup class...

非线性光学显微技术利用样品对强光辐射（电场强度大于 3 × 103 V/cm 的光）的响应来产生图像对比度，其中诱导的极化（以及由此产生的信号）与入射光强呈非线性关系1,2,3。由于这些多种对比机制分别由不同的光与物质相互作用介导，非线性显微技术能够同时获取关于样品形态结构和化学分布的独特信息1,2,3。尽管涉及照明光线性相互作用的传统显微技术也能实现定量成像，但非线性显微技术提供了更丰富的多模态成像方式，通常具有更深的成像深度和更优的光学切片能力，同时对样品造成的光损伤更小4。在生物医学应用中，例如术中对组织进行类似组织学的实时评估5,6，该技术可直接探测内源性生物分子，无需外源标记或修饰即可无缝研究活细胞。这种方法避免了使用标签、标记物7、外源分子、基因表达的荧光蛋白或纳米颗粒，这些不仅需要大量实验操作，还可能干扰样品原有的生物化学环境，对目标细胞或组织产生负面影响8,9,10。因此，非线性显微镜是一种强大且真实的分析工具，能够在不改变样品化学和结构完整性的前提下，持续成像微观结构。这一能力为从疾病诊断、药物发现到细胞信号传导和系统生物学的广泛应用开辟了广阔前景。
多光子对比机制，如双光子自体荧光（2PAF）、三光子自体荧光（3PAF）、二次谐波生成（SHG）和三次谐波生成（THG），在样本表征中各自具有分析优势。2PAF由内源性黄素类分子产生，其中黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）在生物系统中含量最为丰富11。3PAF利用近红外激发来可视化内源性发色团（如NAD(P)H），可在避免紫外光相关光毒性和光衰减问题的同时实现代谢成像12。SHG可特异性揭示非中心对称的分子结构，例如纤维状胶原蛋白（I、II 和 III 型）及蛋白质阵列13,14,15,16,17，从而提供结构信息1。最后，THG对界面和微小结构特征敏感，在脂质分布和细胞外囊泡成像方面表现优异18,19,20,21,22。
这些对比信号已被多个研究团队分别深入探索，确立了多光子非线性显微镜作为生物应用中可靠且多功能工具的地位23,24,25,26。该领域的发展由双光子吸收荧光（2PAF）显微镜的发明者率先推动，他们利用这一创新技术，深入揭示了组织形态、细胞代谢，乃至阿尔茨海默病和癌症等病理状态的形态功能特征23。他们的工作最终推动了神经科学领域的突破性应用27,28。在随后的几年中，多位研究人员指出，二次谐波生成（SHG）对细胞外基质的变化具有高度敏感性；细胞外基质是为细胞提供结构支撑的支架，在癌症发生过程中会发生显著改变29。特别是Campagnola等人14,24,30,31证明，SHG显微镜能够可视化大分子和超分子组装结构，揭示出胶原蛋白的排列方式、浓度和类型等细节，而这些信息是传统基于荧光的技术无法检测到的。这些结果凸显了SHG显微镜在临床环境中作为有效诊断工具的潜力。最后，三次谐波生成（THG）显微镜已成功应用于在亚细胞分辨率下可视化啮齿类动物的视网膜层25，绘制脑结构图谱32，以及捕捉黑色素瘤细胞侵袭过程中的多界面拓扑特征33。
这些非线性显微技术的历史实现通常涉及使用锁模飞秒（fs）激光器耦合高数值孔径（NA）物镜，以产生并收集非线性信号，随后通过二向色镜将信号导向带通滤波器，并由光电倍增管（PMT）采集34。尽管实现方式相似，大多数应用仅专注于获取一种或最多两种对比度，而忽略了其他信号。为了充分实现多光子显微镜的潜力，Boppart 等人首先实现了多种非线性对比度的顺序采集21,35,36,37，随后发展为同时检测4,22,38,39,40,41。该技术被称为无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微术，通过单次激发和多路检测，实现非线性双光子激发自体荧光（2PAF）、三光子激发自体荧光（3PAF）、二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）信号在空间和时间上的共定位，从而获得更强的分析能力。这四个通道的时空共定位提供了高信息量且特征丰富的数据42，相较于顺序采集的数据，可消除运动伪影并提高图像配准精度。因此，SLAM 能够生成复合特征，例如光学氧化还原比值，有效表征组织代谢特性43,44,45。此外，跨模态信号的联合分析有助于基于通道间的相关性和共定位关系构建新的特征。例如，Shi 等人展示了 SLAM 显微术中共定位特征在准确分类用于药物生产的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的重要性42。由此，SLAM 为当前多光子显微技术的前沿发展奠定了基础，推动了该领域未来的进一步进步46。
在本实验方案中，我们概述了SLAM显微镜的关键组成部分（图1），并详细描述了其实施的逐步方法。内容包括激发脉冲的产生与整形、典型组织样本的制备、成像步骤，以及数据的处理与显示。通过采用现成的技术和成熟的方法，本方案具有通用性、可转移性，可在不同实验室中利用类似的光学系统轻松重复实现。
<img alt="SLAM显微镜示意图；用于扫描和激发的光学装置；用于光谱分析的光子探测器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68637/68637fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图1"> 
图1：同步无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微镜的光学设计。飞秒激光器输出波长为1040 nm、脉宽为370 fs的激光脉冲，重复频率为10 MHz。在泵浦光子晶体以产生超连续谱之前，激光的强度和偏振状态被精确控制。随后，脉冲通过脉冲整形器进行压缩，并导入定制的激光扫描显微镜（虚线框内）。二向色镜和带通滤光片用于分离样品产生的非线性信号，然后由高灵敏度光子探测器（如光电倍增管（PMT）或混合型光电探测器（HPD））进行检测。该光学设计基于先前报道的系统41。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68637/68637fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>三轴位移台</td><td>ThorLabs</td><td>MAX316</td><td>已停产。</td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底成像培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>未包被 #0 盖玻片。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063029</td><td>高糖，含 HEPES，不含酚红。</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基添加剂</td><td>PromoCell</td><td>C-39210</td><td>省略胎牛血清。</td></tr><tr><td>FemtoTrain 飞秒激光器</td><td>Spectra-Physics</td><td>1040-5</td><td>平均功率：&gt;5.0 W，脉冲能量：&gt;500 nJ，波长：1040 nm &amp;plusmn;8 nm，重复频率：10 MHz，脉冲宽度（FWHM）：&amp;lt;220 fs。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Cytiva</td><td>SH30071.03</td><td>HyClone 优质级。</td></tr><tr><td>光纤剥线钳</td><td>ThorLabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6625</td><td></td></tr><tr><td>振镜扫描镜</td><td>Cambridge Technology</td><td>6215H</td><td>已停产。</td></tr><tr><td>玻璃加工工作站</td><td>Vytran</td><td>GPX3800</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>威斯康星大学麦迪逊分校 Eliceiri 实验室</td><td>版本 2.16.0</td><td>FIJI 发行版。</td></tr><tr><td>Kimwipe 擦镜纸</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Cytiva</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载物台</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FTP-2050</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载物台控制器</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MS-2000-500-UDSW</td><td></td></tr><tr><td>显微自相关仪</td><td>Angewandte Physik und Elektronik GmbH</td><td>Carpe</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>水浸式，25倍放大，数值孔径 1.05。</td></tr><tr><td>光功率计</td><td>Newport</td><td>919P-003-10</td><td>600 - 1700 nm。</td></tr><tr><td>光谱分析仪</td><td>ThorLabs</td><td>OSA202C</td><td></td></tr><tr><td>光子晶体光纤</td><td>NKT Photonics</td><td>LMA-PM-15 NKT</td><td>大模场面积，保偏光纤。纤芯直径：15 &amp;micro;m。</td></tr><tr><td>高精度光纤切割器</td><td>Fujikura</td><td>CT-101</td><td></td></tr><tr><td>脉冲整形器</td><td>Biophotonics Solutions Inc.</td><td>FemtoJock-D</td><td>已停产。</td></tr><tr><td>&amp;beta;-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10128023001</td><td></td></tr></tbody></table>

无标记自体荧光多谐波显微成像同步观测

Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic Microscopy

非线性光学显微技术通过检测超短激光脉冲与内源性分子发生非线性相互作用所产生的信号来对生物样本进行成像。该方法能够在无需标记或标签、非破坏性的条件下，以亚细胞分辨率快速实现化学成分与结构的识别，从而为细胞和组织的研究提供了一种强大的手段。这些独特的非线性对比机制包括多光子激发自体荧光和倍频/高次谐波产生。由于每种对比机制均具有各自的优势与局限性，将它们结合并实现时空共定位，可提供互补的对比度组合，从而增强非线性光学显微技术的分析能力。因此，我们课题组开发了同步无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微技术，该成像方法可同时检测四种或更多种并发产生的非线性光学信号，旨在识别生物样本中不同的形态学、代谢状态及功能特征。本文介绍了一种针对组织样本的SLAM成像实验方案，重点阐述该技术的关键组成部分，包括激光光源、脉冲压缩装置和显微镜系统。此外，我们还讨论了样本制备方法，并概述了SLAM数据的处理流程。该工作流程适用于在无需外源性标记的前提下，研究人类及动物组织的代谢状态、结构排列、细胞响应及组成成分。

SLAM显微镜的复杂多通道、多模态方法（图1）可能使新用户在排查问题和理解结果时感到困难。首先，切割良好的光子晶体光纤（PCF）应具有一个干净的端面（图2C），其表面平整且与PCF的长度方向垂直（图2A）。倾斜或崩边的切割面（图2B）以及表面存在划痕（图2E）表明切割质量较差。如图2D所示，PCF表面存在污垢或碎屑，表明切割不良或切割后对PCF操作不当。最重要的是，在成功的切割中，PCF的纤芯（即被空气孔蜂窝状结构包围的中央小区域）应无任何碎屑或划痕。尽管如此，在PCF表面观察到少量划痕和少许碎屑是正常现象，尤其是在PCF的外层包层上（图2C），此类PCF通常仍可使用。随着PCF使用寿命的延长，其会逐渐受损，耦合效率将下降，...

本方案详细介绍了无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微技术的逐步操作流程，包括激光光源的产生、组织样本的制备、成像过程的实施以及数据的分析方法。SLAM技术通过检测四种互补的无标记对比信号，推动了非线性显微成像技术的发展，可用于研究组织微环境。

非线性光学显微镜通过检测超短激光脉冲与内源性物质非线性相互作用产生的信号来成像生物样品……

无标记自体荧光多谐波显微成像技术（SLAM显微成像）通过检测光与生物样本之间的非线性相互作用，获取独特的生物学信息。在我们的实验室中，我们利用该技术在微观尺度上研究生命与疾病过程。我们观察到，无标记多模态成像正成为发展趋势，它能够提供更丰富的细胞与组织结构及动态信息，避免了标记物的毒性影响，同时实现不同成像模态间的互补对比与关联分析。目前先进的无标记非线性显微镜一次仅采集一种信号，容易导致图像错位、光损伤以及大量并发过程。SLAM 技术通过实现严格共定位的多模态对比，克服了这些问题，确保了可靠的空间和时间数据。该技术能够在多光子显微镜中同时激发并检测四个通道。利用光子晶体光纤展宽脉冲，用于二次谐波（SHG）、三次谐波（THG）以及双光子和三光子荧光成像。SLAM技术无需对齐伪影或外源性标记物，即可获取多重代谢、结构及动态细胞信号信息，实现标准化的定量组织分析。该技术的应用涵盖基础生物学、转化医学研究，以及肿瘤学、神经退行性疾病和组织再生领域的生物标志物发现。首先，使用光谱仪或光谱分析仪测量抛物面镜后的激光，验证光子晶体光纤的超连续谱产生。调节偏振分束器后的半波片，以优化超连续谱的宽度。打开显微镜自相关仪。在软件中，将探测器设置为内置探测器，并将扫描范围调整为5皮秒，以捕获脉冲自相关信号的完整宽度。解除激光遮挡，调整自相关仪使其对准脉冲整形器输出的光束，直至出现信号。确保快门2处于关闭状态。然后在物镜上添加适当的浸没介质，例如水或油。将自相关仪的外接探测器放置在显微镜载物台上，并将其置于物镜正上方。接着打开扫描振镜，将其电压设置为 0。打开快门，使用荧光靶确认光束到达外部探测器。将自相关仪探测器设置为外部探测器，然后调节载物台位置，直至信号出现。调整脉冲整形器的多项式系数，通过自相关仪对测得的脉冲宽度进行迭代优化以使其最小化。随着脉冲宽度减小，相应缩小扫描范围，以提高自相关函数的准确性和可视化效果。确保光子晶体光纤的激光输入被阻断，然后开启激光器。让激光器预热30分钟。确认光路中无障碍物，然后将光功率计放置在光子晶体光纤之前的光路中。按下控制按钮打开快门1，并测量输入功率。再次关闭快门1。将功率计移至抛物面反射镜后的光子晶体光纤输出端。打开快门1，并调节输入端的三轴调节架以最大化输出功率。让光子晶体光纤预热10分钟，然后再次使用三轴平台最大化输出功率，并记录光子晶体光纤的透射率。将功率计移至中性密度滤光片之后，旋转滤光片以调节到达样品的激光功率。将测得的功率乘以剩余光学元件的透射率，以确定样品处的实际功率。现在，打开振镜和载物台。启动采集软件并输入所需的成像参数。将样品放置在载物台上，使用与物镜先前所用相同的浸没介质。然后关闭房间灯光并拉上窗帘，以防止环境光进入。接着，打开检测器的电源和放大器。关闭显微镜载物台周围的光箱。使用电子控制开关手动打开检测器快门 3-6。在采集软件中，点击“点击开始采集”选项以开始 SLAM 成像。使用载物台控制器旋钮调节显微镜焦距，直至样品清晰可见。使用显微镜载物台控制器上的操纵杆找到所需的视野。定位完成后，点击停止和重置。在保存选项卡下，将保存数据切换为是。然后点击“单击以开始采集”选项，等待成像完成。在成像过程中如需调整样本，请关闭探测器快门，并使用手电筒或头灯进行照明。调整完毕后，返回成像设置。结束图像采集时，先关闭探测器快门，关闭探测器，然后才能打开室内灯光。使用快门1阻断激光，随后关闭激光器。关闭振镜和载物台，并关闭采集软件。妥善处理组织样本，并清洁工作台。切割良好的光子晶体光纤应显示出与轴线垂直的平整端面，且端面洁净。切割不良的光子晶体光纤则表现出倾斜的切口、破损的端面，以及表面明显的划痕或残留物。操作不当或污染会导致光纤表面周围出现明显的污垢和颗粒积聚，从而遮蔽空气孔的排列模式。纤芯烧毁并出现变暗区域，表明光子晶体光纤已达到使用寿命终点。超连续谱覆盖范围约为 975–1,175 纳米，具有平坦的顶部和明显的光谱调制。压缩后的脉冲自相关显示对称的轮廓和较窄的半高全宽，表明脉冲整形效果良好。功能正常的超连续谱光源可产生较强的二倍频和三倍频信号。超连续谱变窄会导致三倍频信号强度减弱，而二倍频信号得以保留。未进行脉冲整形会显著降低所有非线性信号，导致图像微弱且对比度低。对离体肾脏组织成功进行SLAM成像，显示出清晰的肾单位结构，并检测到多种强烈的光学信号，包括三次谐波产生和NADPH荧光。通过强烈的二次谐波产生信号可识别肾间质胶原纤维。氧化还原比率图像显示，与肾髓质相比，肾皮质近端小管的有氧线粒体代谢升高。第二张氧化还原比率图谱证实了氧化代谢与糖酵解代谢在空间上的差异，进一步支持了组织内能量利用的差异性。

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同步无标记自发荧光多谐波显微镜

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

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利用自发荧光成像评估细胞代谢

本文介绍了多种多细胞球体的形成方法，用于后续的多参数活细胞显微成像。通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）、细胞自发荧光、染色染料和纳米颗粒，展示了对活体三维（3D）肿瘤细胞和干细胞来源的球体中细胞代谢、缺氧状态及细胞死亡进行分析的方法。...

多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

拉曼光谱是一种适用于活细胞、组织工程构建物及天然组织的非接触、无标记分析技术。可通过多元分析生成并分析具有来源特异性的光谱指纹。...

非接触式、无标记的细胞与细胞外基质拉曼光谱监测

光学生物传感器技术可检测活细胞质膜附近的质量变化，从而能够追踪单个细胞及细胞群体的细胞反应。本方案将介绍利用该方法在完整细胞中检测G蛋白偶联受体对钾离子通道的调控作用。...

使用无标记光学生物传感器检测G蛋白偶联受体对钾通道的调节作用

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