无标记自体荧光多谐波显微成像同步观测

无标记自体荧光多谐波显微成像技术（SLAM显微成像）通过检测光与生物样本之间的非线性相互作用，获取独特的生物学信息。在我们的实验室中，我们利用该技术在微观尺度上研究生命与疾病过程。我们观察到，无标记多模态成像正成为发展趋势，它能够提供更丰富的细胞与组织结构及动态信息，避免了标记物的毒性影响，同时实现不同成像模态间的互补对比与关联分析。

目前先进的无标记非线性显微镜一次仅采集一种信号，容易导致图像错位、光损伤以及大量并发过程。SLAM 技术通过实现严格共定位的多模态对比，克服了这些问题，确保了可靠的空间和时间数据。该技术能够在多光子显微镜中同时激发并检测四个通道。

利用光子晶体光纤展宽脉冲，用于二次谐波（SHG）、三次谐波（THG）以及双光子和三光子荧光成像。SLAM技术无需对齐伪影或外源性标记物，即可获取多重代谢、结构及动态细胞信号信息，实现标准化的定量组织分析。该技术的应用涵盖基础生物学、转化医学研究，以及肿瘤学、神经退行性疾病和组织再生领域的生物标志物发现。

首先，使用光谱仪或光谱分析仪测量抛物面镜后的激光，验证光子晶体光纤的超连续谱产生。调节偏振分束器后的半波片，以优化超连续谱的宽度。打开显微镜自相关仪。

在软件中，将探测器设置为内置探测器，并将扫描范围调整为5皮秒，以捕获脉冲自相关信号的完整宽度。解除激光遮挡，调整自相关仪使其对准脉冲整形器输出的光束，直至出现信号。确保快门2处于关闭状态。

然后在物镜上添加适当的浸没介质，例如水或油。将自相关仪的外接探测器放置在显微镜载物台上，并将其置于物镜正上方。接着打开扫描振镜，将其电压设置为 0。

打开快门，使用荧光靶确认光束到达外部探测器。将自相关仪探测器设置为外部探测器，然后调节载物台位置，直至信号出现。

调整脉冲整形器的多项式系数，通过自相关仪对测得的脉冲宽度进行迭代优化以使其最小化。随着脉冲宽度减小，相应缩小扫描范围，以提高自相关函数的准确性和可视化效果。确保光子晶体光纤的激光输入被阻断，然后开启激光器。

让激光器预热30分钟。确认光路中无障碍物，然后将光功率计放置在光子晶体光纤之前的光路中。按下控制按钮打开快门1，并测量输入功率。

再次关闭快门1。将功率计移至抛物面反射镜后的光子晶体光纤输出端。打开快门1，并调节输入端的三轴调节架以最大化输出功率。

让光子晶体光纤预热10分钟，然后再次使用三轴平台最大化输出功率，并记录光子晶体光纤的透射率。将功率计移至中性密度滤光片之后，旋转滤光片以调节到达样品的激光功率。将测得的功率乘以剩余光学元件的透射率，以确定样品处的实际功率。

现在，打开振镜和载物台。启动采集软件并输入所需的成像参数。将样品放置在载物台上，使用与物镜先前所用相同的浸没介质。

然后关闭房间灯光并拉上窗帘，以防止环境光进入。接着，打开检测器的电源和放大器。关闭显微镜载物台周围的光箱。

使用电子控制开关手动打开检测器快门 3-6。在采集软件中，点击“点击开始采集”选项以开始 SLAM 成像。使用载物台控制器旋钮调节显微镜焦距，直至样品清晰可见。

使用显微镜载物台控制器上的操纵杆找到所需的视野。定位完成后，点击停止和重置。在保存选项卡下，将保存数据切换为是。

然后点击“单击以开始采集”选项，等待成像完成。在成像过程中如需调整样本，请关闭探测器快门，并使用手电筒或头灯进行照明。调整完毕后，返回成像设置。

结束图像采集时，先关闭探测器快门，关闭探测器，然后才能打开室内灯光。使用快门1阻断激光，随后关闭激光器。关闭振镜和载物台，并关闭采集软件。

妥善处理组织样本，并清洁工作台。切割良好的光子晶体光纤应显示出与轴线垂直的平整端面，且端面洁净。切割不良的光子晶体光纤则表现出倾斜的切口、破损的端面，以及表面明显的划痕或残留物。

操作不当或污染会导致光纤表面周围出现明显的污垢和颗粒积聚，从而遮蔽空气孔的排列模式。纤芯烧毁并出现变暗区域，表明光子晶体光纤已达到使用寿命终点。超连续谱覆盖范围约为 975–1,175 纳米，具有平坦的顶部和明显的光谱调制。

压缩后的脉冲自相关显示对称的轮廓和较窄的半高全宽，表明脉冲整形效果良好。功能正常的超连续谱光源可产生较强的二倍频和三倍频信号。超连续谱变窄会导致三倍频信号强度减弱，而二倍频信号得以保留。

未进行脉冲整形会显著降低所有非线性信号，导致图像微弱且对比度低。对离体肾脏组织成功进行SLAM成像，显示出清晰的肾单位结构，并检测到多种强烈的光学信号，包括三次谐波产生和NADPH荧光。通过强烈的二次谐波产生信号可识别肾间质胶原纤维。

氧化还原比率图像显示，与肾髓质相比，肾皮质近端小管的有氧线粒体代谢升高。第二张氧化还原比率图谱证实了氧化代谢与糖酵解代谢在空间上的差异，进一步支持了组织内能量利用的差异性。