Name: 使用 zpc：cas9 敲入斑马鱼生成母系突变体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学习使用zpc:cas9敲入斑马鱼系结合Tol2介导的sgRNA递送技术，建立卵母细胞特异性条件敲除平台，快速高效生成母系突变体，用于研究导致致死或不育的合子突变相关母源因子。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢中国山东大学生命科学学院核心设施与服务平台的Jianlin Shen、Yiteng Xu和Qingqing Wei。本工作得到国家自然科学基金（项目编号32170816、32370860、32450630和31871451）、山东大学杰出中青年学者支持计划以及山东省泰山学者计划的资助。

<ol><li>Fuentes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maternal+coordinate+system%3A+Molecular-genetics+of+embryonic+axis+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish.</a> Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Huluwa+dictates+the+embryonic+body+axis+through+%CE%B2-catenin+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates.</a> Science. 362 (6417), eaat1045(2018).</li>
<li>Abrams, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+maternally-controlled+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions.</a> PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24+controls+poly%28A%29+tail+length+and+translation+efficiency+of+crystallin+mRNAs+in+the+lens+via+cytoplasmic+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).</li>
<li>Weidinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).</li>
<li>Ciruna, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).</li>
<li>Xing, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+dishevelled+genes+in+zebrafish+reveals+distinct+functions+in+embryonic+patterning+and+gastrulation+cell+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements.</a> PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).</li>
<li>Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+program+of+oocytes+can+be+modified+in+vivo+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary.</a> J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+maternal+mutants+via+oocyte-specific+knockout+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system.</a> Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maternal+mutants+via+oocyte+transgenic+expression+of+CRISPR-Cas9+and+sgRNAs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish.</a> Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+targeting-mediated+and+endogenous+gene+integrity-maintaining+knockin+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbm24a+dictates+mRNA+recruitment+for+germ+granule+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish.</a> EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T5+exonuclease-dependent+assembly+offers+a+low-cost+method+for+efficient+cloning+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+conditional+mutagenesis+using+transgenic+expression+of+Cas9+and+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li>
<li>Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+zebrafish+cells+by+conventional+pneumatic+microinjector%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector.</a> Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Aharon, D., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual determination in zebrafish.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+early+embryonic+primordial+germ+cells+promotes+zebrafish+female+differentiation+as+revealed+by+lifetime+labeling+of+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline.</a> Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+formation+of+primordial+germ+cells+from+zebrafish+blastomeres+by+germplasm+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors.</a> Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Bertho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dazl+regulates+cystogenesis+and+germline+stem+cell+specification+during+the+primordial+germ+cell+to+germline+stem+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition.</a> Development. 148 (7), dev.187773(2021).</li>
<li>Houwing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Piwi+and+piRNAs+in+germ+cell+maintenance+and+transposon+silencing+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish.</a> Cell. 129 (1), 69-82 (2007).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetally+localised+Vrtn+functions+as+a+novel+repressor+to+modulate+bmp2b+transcription+during+dorsoventral+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish.</a> Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).</li>
</ol>

本方案已获得中国国家知识产权局授予的专利，经作者许可后可解除该方法的使用限制。作者声明不存在其他竞争性或经济利益。

致死性合子突变会阻碍对基因母源效应的分析。替代策略中，最显著的是生殖系替代和原位卵母细胞显微注射（Oocyte Microinjection In Situ, OMIS），但这些方法技术难度较高6,8。在生殖系替代的细胞移植过程中，受体胚胎接收到的原始生殖细胞（PGCs）数量极少，常常导致雌性无法正常发育16,17,18。使用诱导性原始生殖细胞（iPGCs）进行生殖系替代改善有限：由iPGCs分化而来的生殖细胞数量显著减少，且导致所有iPGC移植嵌合体均为雄性19。这些局限性使得生殖系替代策略难以成为研究斑马鱼母源效应基因功能的常规工具。因此，该领域迫切需要一种简单、高效的卵母细胞特异性条件性基因敲除方法。
本文提供了一种改进的卵母细...

脊椎动物早期胚胎发育在很大程度上依赖于卵细胞内储存的RNA和蛋白质，这些物质统称为母源因子。这些母源产物主要在减数第一次分裂的双线期合成1,2,3。为了研究其功能作用，必须获得纯合突变的雌性个体，因为只有卵母细胞中的纯合突变才能完全耗尽这些母源因子。然而，当合子期的纯合突变导致个体致死或不育时，获得此类纯合突变雌性个体就变得极为困难4,5。这为解析由致死或不育基因编码的母源产物功能带来了重大障碍。为克服这一技术瓶颈，已发展出多种创新方法6,7,8。然而，这些技术通常存在实验周期过长或技术难度较大的问题。
在我们之前的研究中，我们还开发了一种条件性基因敲除策略，可在单一代次内产生母源性突变体9,10。该系统包含两个关键组分：Tg(zpczcas9) 转基因斑马鱼和一个携带3-4个sgRNA表达盒的I-SceI转基因质粒系统。利用该系统，我们已成功实现了卵母细胞中母源因子的条件性基因敲除9,10，但仍存在改进空间。首先，先前报道的Tg(zpczcas9) 转基因品系在维持Cas9转基因表达方面的基因组编辑效率并不稳定。此外，由于该转基因品系是利用Tol2转座子系统构建的，因此无法再使用Tol2转座子将sgRNA表达盒整合到基因组中；而必须采用I-SceI介导的转基因技术。然而，该方法的效率低于Tol2系统，且更容易发生跨代表观沉默。
为了克服这些局限性，我们致力于建立一种敲入品系，以实现卵母细胞特异性的Cas9高效且稳定的表达。该品系可利用Tol2转座子系统，在斑马鱼中高效递送sgRNA表达质粒。通过采用基于内含子的基因组编辑策略11，我们成功构建了在rbm24a基因最后一个内含子中整合的zpccas9敲入品系（图1A，B）。我们选择该位点作为母源性转基因表达的候选基因组安全港，主要基于两项独立的观察结果：1）无害整合：在我们近期的研究12中，该位点携带外源DNA的纯合敲入鱼仍保持完全的存活能力和生育力；2）高效表达：当在同一位置插入zpccas9表达盒时，Cas9呈现高水平表达，并在多代间持续实现高效的基因组编辑（图1C）。Rbm24a作为一种核心生殖质成分，是一种RNA结合蛋白，可与Buc协同作用，将生殖质RNA整合至生殖颗粒中。因此，母源性Rbm24a缺失将导致原始生殖细胞（PGCs）完全缺失12。在此，我们以近期工作中靶向rbm24a基因为例，提供了一套改进的视频实验方案，用于生成和鉴定在合子致死基因中的母源性突变体。

<table><tbody><tr><td>2x M5 HiPer Taq PCR 混合液</td><td>Mei5bio</td><td>货号#MF001-BD-100</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>MDbio</td><td>货号 A006L</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep 质粒小提试剂盒</td><td>Axygen</td><td>货号#AP-MN-P-4</td><td></td></tr><tr><td>毛细管电泳仪（Qsep400）</td><td>双光路系统</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DIG标记混合液</td><td>罗氏</td><td>货号#11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>罗氏</td><td>货号#4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 R0861</td><td></td></tr><tr><td>第一链cDNA合成试剂盒</td><td>TransGen Biotech</td><td>货号#AT301</td><td></td></tr><tr><td>GenCrispr NLS-Cas9-NLS 核酸酶</td><td>GenScript</td><td>货号#Z03389</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管（1.0 × 100 mm）</td><td>Rantai 教学设备厂</td><td>货号#OS-2B</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>BBI生命科学</td><td>货号#28985</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>开源</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>生物技术</td><td>货号#CA1351</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪（MF2）</td><td>NARISHIGE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>显微分光光度计（Nano-300）</td><td>ALLSHENG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OlyVIA</td><td>OLYMPUS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>货号#15140122</td><td></td></tr><tr><td>皮升注射仪（PLI-100A）&amp;nbsp;</td><td>哈佛仪器公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>WPI</td><td>货号#500341</td><td></td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>&amp;nbsp;WPI&amp;nbsp;</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>拉力仪（PC-100）</td><td>NARISHIGE</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号#EO0381</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 R0481</td><td></td></tr><tr><td>硅羟基磁珠</td><td>Sangon Biotech</td><td>货号 B518720-0001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>货号#M0251L</td><td></td></tr><tr><td>Zold</td><td>WPI</td><td>货号# z-molds</td><td></td></tr></tbody></table>

利用zpc:cas9基因敲入斑马鱼产生母源突变体

Generation of Maternal Mutants Using zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

卵子发生及早期胚胎发育严重依赖于母源性mRNA和蛋白质。要消除这些母源因子，通常需要在雌性斑马鱼中引入纯合突变，但这往往导致致死或不育的表型，从而无法获得母源突变的胚胎。我们之前的研究提出了一种通过卵母细胞特异性基因组编辑来绕过合子致死性的快速方法。然而，先前报道的cas9转基因存在不稳定性，并在连续世代中逐渐发生沉默。此外，该品系中zpc:cas9表达盒两侧存在Tol2转座子元件，限制了利用Tol2系统进一步进行sgRNA转基因操作的可能性，而Tol2系统目前仍是斑马鱼中最高效的转基因系统。因此，迫切需要一种不含Tol2元件的斑马鱼品系，以实现稳定且高效的卵母细胞特异性Cas9表达。本文中，我们报道了一种将zpccas9敲入至rbm24a基因位点的品系，满足了这一需求。利用这一改进的工具，我们建立了一个技术流程，可在斑马鱼模型中快速生成具有合子致死突变表型基因的母源突变体。

快速生成 rbm24a 母本突变体 
我们构建了一种转基因载体，可表达一种母源性BFP标记物和四个高效靶向的sgRNA rbm24a 编码序列。将该载体导入纯合子后 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 通过 Tol2 转座获得胚胎，Mrbm24a 在BFP阳性的F1胚胎中，由于缺乏Rbm24a-RFP蛋白，可轻松且快速地被识别出来（图11A- D。大约30%–70%的BFP阳性胚胎缺乏RFP信号。这些Mrbm24a 胚胎在24 hpf时表现出生殖质mRNA无法招募至生殖粒以及缺乏原始生殖细胞，如图所示 原位 使用杂交技术 nanos3 探针图11E- H）。这些 Mr...

本文介绍了一种通过将稳定的zpc:cas9基因敲入品系与Tol2介导的sgRNA表达盒递送相结合，以产生母源突变体的实验方案。

卵子发生和早期胚胎发育在很大程度上依赖于母源性mRNA和蛋白质。清除这些母源因子……

在本视频中，我们介绍一种改良的斑马鱼卵母细胞特异性条件性基因敲除方法，为研究那些因合子突变导致致死或不育的母源因子提供了多功能平台。目前的母源基因敲除方法要么技术难度较高，要么耗时较长。我们此前曾报道过 zpc:cas9 转基因在多代传递过程中会发生转录沉默。利用 zpc:cas9 基因敲入品系，我们建立了一个高效的平台，可在卵子发生过程中产生条件性基因敲除，从而快速且高效地生成母源性突变体。首先，收集由纯合 rbm24a RFPKI zpc:cas9 鱼产生的胚胎。将 1 微升 PGG dust EB rbm24a 4sGRNA 与 1 微升 Tol2 转座酶信使 RNA 混合，制备注射混合液。将质粒和Tol2信使RNA直接用纯水稀释。现在将玻璃盖玻片放入一个90毫米的培养皿中。将胚胎沿盖玻片边缘排列，并用移液器轻轻吸除多余的水分。然后将2纳升的制备混合物注射到每个单细胞期胚胎的胚盘中。用蓝色水轻轻冲洗注射后的胚胎，并将其转移至另一个培养皿中。将培养皿置于设定为28摄氏度的培养箱中进行培养。在受精后24小时，挑选表现出强烈且广泛分布的蓝色荧光蛋白表达的胚胎。在受精后四天，仅继续培养仍保持强烈转基因荧光信号的胚胎。收集由嵌合型转基因创始人雌性个体与野生型雄性个体交配所产生的胚胎。使用荧光体视显微镜，在单细胞阶段挑选出表达蓝色荧光蛋白的胚胎。随后在4°C条件下，用4%多聚甲醛固定适当发育阶段的胚胎，过夜。制备1.5% OGER溶液时，称取适量OGER粉末加入1/3浓度的林格氏缓冲液中，加热煮沸至完全溶解。将融化的OGER溶液倒入一个90毫米的培养皿中，并将Z型模具插入熔化的琼脂糖中。待琼脂糖完全凝固后，轻轻取出模具，制成可直接使用的平板。接下来，调整拉针仪的设置，使用两个轻质砝码，并选择程序一步。将玻璃毛细管装入拉针仪中，制备熔封针头。使用尖头镊子将毛细管尖端修剪至30至40微米直径。然后使用显微操作仪在尖端加工出尖刺，以利于穿透胚胎并减少组织损伤。将假定的雌性奠基者与野生型斑马鱼交配并收集胚胎。在单细胞阶段，使用荧光体视显微镜筛选出表达蓝色荧光蛋白的阳性胚胎。受精后3小时，将胚胎置于含有蛋白酶的1/3浓度林格氏缓冲液中，轻轻吹打10分钟，以去除卵膜。将去壳的胚胎小心转移至已加入1/3 Ringer缓冲液（含青霉素-链霉素）的预制琼脂糖平板上。调整胚胎方向，使卵裂球朝向毛细管尖端，以便进行细胞吸出。随后使用显微注射仪，通过轻微降低平衡压力以抵消毛细管的吸力，从每个胚胎中轻柔吸出20至40个细胞。增加平衡压力，将吸出的细胞释放到1.5毫升Eppendorf管边缘的2微升去离子水中。然后向管中加入200微升RNA提取试剂，以冲洗下吸出的细胞，并将管置于冰上暂时保存。在吸细胞操作后，将胚胎保留在琼脂糖平板上，直至观察到异常表型。接着，向提取试剂中选定胚胎的细胞加入 40 µL 氯仿，轻轻混匀。然后在室温下以 12,000 ×g 离心 1 分钟。收集上清液后，加入 1 µL 甘油三酯溶液。然后根据上清液体积加入等体积的异丙醇，并充分混匀。将离心管置于负20摄氏度孵育30分钟，以使RNA沉淀。随后在4摄氏度下以12,000 G离心10分钟，并弃去上清液。随后用70%乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次加入500 µL，于4°C、12,000 ×g离心1分钟。弃去上清液后，打开管盖，使沉淀在室温下干燥5分钟。加入7 µL水以溶解RNA沉淀。使用第一链 cDNA 合成试剂盒进行逆转录，然后通过 PCR 和 Sanger 测序分析母源突变胚胎中的突变。母源 rbm24a 突变体通过缺失 rbm24a RFP 信号来鉴定，其他母源突变体则通过特定表型或基于细胞吸液的基因分型方法检测。在 BFP 阳性胚胎中，缺乏 RFP 信号的个体被鉴定为母源 rbm24a 突变体。使用NANOS3探针进行原位杂交显示，Mrbm24a胚胎在四细胞期无法将生殖质mRNA招募至生殖颗粒，且在受精后24小时缺乏原始生殖细胞。所有成年Mrbm24a雄性个体均无法使野生型雌性产下的卵子受精，其生殖系统表现出解剖学异常，正常睾丸组织被脂肪沉积所取代。组织学分析证实，Mrbm24a睾丸中完全缺乏生殖细胞和精子。 Western blot 分析证实，在 BFP 阳性、RFP 阴性的胚胎中，rbm24a 蛋白水平几乎无法检测到。RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，RFP 阴性、BFP 阳性胚胎中的 rbm24a 转录水平显著降低。RT-PCR 和 Sanger 测序结果显示，在 RFP 阴性、BFP 阳性以及 RFP 阳性、BFP 阳性胚胎中均存在大片段缺失和插入缺失突变（indels），而野生型转录本仅在 RFP 阳性胚胎中可检测到。通过引入母源性GFP标记和nanog sgRNA生成母源性nanog突变体，GFP阳性胚胎表现出不同程度的背化表型。在GFP阳性的转基因品系中，生殖系传递率介于12%至32%之间。在22%至60%的GFP阳性胚胎中观察到与母源性nanog突变体一致的背化表型。

generation-of-maternal-mutants-using-zpccas9-knock-in-zebrafish

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用 zpc：cas9 敲入斑马鱼生成母系突变体

显微注射是一种成熟且有效的方法，可用于将外源物质导入受精的斑马鱼胚胎中。本文中，我们展示了一种可靠的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行mRNA过表达以及吗啉代寡核苷酸基因敲降研究。...

斑马鱼胚胎中mRNA和吗啉代反义寡核苷酸的显微注射

通过囊胚期或原肠胚期移植，生成特定嵌合斑马鱼胚胎的逐步操作指南。...

通过移植生成嵌合体斑马鱼胚胎

本视频介绍了一种通过胚胎显微注射将化合物递送至斑马鱼卵黄囊的技术。...

胚胎显微注射：一种将化合物递送至斑马鱼卵黄的技术

斑马鱼因其与高等脊椎动物具有较高的遗传相似性，已成为发育生物学和人类疾病研究中强有力的研究模型系统。本实验方案描述了一种制备单倍体斑马鱼胚胎的方法，可用于正向筛选策略，以鉴定在早期胚胎发育过程中起关键作用的基因中的隐性突变。...

通过单倍体胚胎生产斑马鱼单倍体胚胎 体外 受精作用

一种优化的方案 体外 本文介绍了用于操控母源基因产物的斑马鱼卵母细胞的成熟过程。...

利用功能操作母源基因产物 体外 斑马鱼卵母细胞成熟

本实验方案的目的是通过选择性育种改变斑马鱼致死性骨骼突变表型的外显率。致死性突变体无法生长至成年并进行自交繁殖，因此本方案描述了一种通过子代检测在多代中追踪和选择外显率的方法。...

通过子代检测改变斑马鱼致死性骨骼突变体的外显率

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

早期发育依赖于母源遗传的产物，而这些产物中许多的功能目前尚不清楚。本文描述了一种利用 CRISPR-Cas9...

利用母源性crispant确定母源性表达基因在早期发育中的作用

本方案描述了一种利用CRISPR-Cas9技术在斑马鱼胚胎中实现精确基因敲入编辑的方法。同时提供了一套表型分析流程，以证明该技术在模拟与长QT综合征相关基因变异中的应用价值。...

CRISPR-Cas9介导的斑马鱼心脏精准敲入编辑

本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。...

斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

CRISPR-Cas 技术已彻底改变了基因组编辑领域。然而，发现并分离出理想的种系编辑仍是一个主要瓶颈。因此，本实验方案描述了一种可靠的方法，利用标准的 PCR、限制性酶切和凝胶电泳技术，快速筛选经 CRISPR 注射的 F0...

斑马鱼生殖系编辑的精子筛选快速分离方法

学习使用zpc:cas9敲入斑马鱼系结合Tol2介导的sgRNA递送技术，建立卵母细胞特异性条件敲除平台，快速高效生成母系突变体，用于研究导致致死或不育的合子突变相关母源因子。

利用zpc:cas9基因敲入斑马鱼产生母源突变体

探索更多视频