Name: 基于微生物反应器的锚固依赖间充质间质细胞的生产，为急性呼吸窘迫综合征做准备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 了解利用微生物反应器生产锚定依赖性间充质基质细胞的方法，用于急性呼吸窘迫综合征的细胞治疗。该方案通过微载体技术实现高密度细胞培养，并集成在线环境监测功能，确保培养条件的稳定性和一致性，从而提高细胞产量和质量。

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我们感谢威尔康奈尔医学院基因组学核心设施在qPCR分析和问题排查方面提供的咨询。我们衷心感谢Evan Gates和Eric Shiue的协助。&#160;（MilliporeSigma）&#160;微生物反应器技术支援

1. 微型生物反应器的设置与准备
<ol>
	<li>准备所需数量的微型生物反应器耗材
	<ol>
		<li>确保生物安全柜（BSC）已开启并处于无菌状态。通过刺破新耗材外层铝箔袋顶部将其移除，并保留铝箔袋直至本实验结束（以便在出现缺陷时记录批号信息）。打开外部泡罩包装，取出并丢弃其中的水化包，随后丢弃外部泡罩包装。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒内部泡罩包装，并将其移入生物安全柜内。打开内部泡罩包装后丢弃。</li>
		<li>使用无菌注射器，拔出活塞，并将喷嘴连接至0.22 µm无菌滤器。将50 mL未灭菌的超纯水倒入注射器筒内。手持注射器置于一个待用的无菌50 mL离心管上方，重新插入活塞，将经过滤灭菌的水注入该收集管中。</li>
		<li>取下瓶架上连接至LL瓶的透明塑料帽。使用一支新的无菌50 mL注射器，拔出活塞，并将喷嘴连接至LL瓶。将灭菌过滤后的水倒入注射器筒内，然后注入LL瓶。 
		&#8203;注意：无针连接口可能在制造商的灭菌过程中发生粘连，因此您可能需要多次连接和断开注射器，以打破瓶口密封并成功注入液体。或者，也可使用管路焊接仪将储液瓶以无菌方式连接至相应瓶子的可焊接管路上。</li>
		<li>采用相同方法，向L瓶中加入25 mL不含FBS的低糖DMEM培养基，向R瓶中加入25 mL无菌PBS，向RR瓶中加入8 mL抗黏附冲洗液。每种液体均需使用新的无菌注射器。</li>
		<li>根据实验所需数量，重复上述操作处理其余耗材。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对本实验所使用的每个POD执行POD自检。 
	注意：自检应顺利完成且无任何问题；若自检中某部件失败，须先解决故障后再继续操作。</li>
	<li>将自检卡盒取下并放回避光保存袋中。</li>
	<li>按照以下步骤将耗材安装至生物反应器。
	<ol>
		<li>移除耗材阀门上的绿色胶带，并将其安装至POD中的指定位置。重新安装夹具，并确保无气体或空气泄漏时发出的嘶嘶声。</li>
		<li>将白色瓶架压力传感器管路、红色空气压力管路以及蓝色真空管路在耗材与基站/POD之间正确连接。确保侧向注射口已使用白色泪滴形夹具夹紧关闭。</li>
		<li>按照软件提示启动新实验。最终将进入自动引液和校准功能，该过程约需4–5小时，可过夜运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在每个瓶架上标注其对应的POD位置，以便在耗材从生物反应器取出后能轻松识别应归还至哪个POD。使用不同颜色胶带标识位置：Pod0 = 红色，Pod1 = 橙色，Pod2 = 黄色，Pod3 = 绿色。在胶带上写明实验名称和日期。</li>
	<li>让耗材过夜完成校准。确保培养基能够进入反应器并顺利流入废液管路。</li>
	<li>若计划使用液氮保存的细胞，应提前解冻并接种细胞，使其在注射前有&#62;24小时的时间从冷冻保存状态中恢复。</li>
</ol>
2. 重新校准与微载体准备
<ol>
	<li>确保自动引液和校准步骤已成功完成。
	<ol>
		<li>如果校准未成功完成，请识别并解决根本原因问题，然后尝试重新校准。常见问题包括：未移除白色瓶架夹具、在将耗材放入POD前未取下绿色胶带，以及培养基瓶中的培养基体积不足。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保溶解氧传感器稳定。
	<ol>
		<li>约有10%的耗材在校准后会出现DO传感器漂移现象。首选的纠正措施是重新运行完整的校准程序。如有需要，可执行以下操作之一。
		<ol>
			<li>确保卡匣中无空气，然后取消勾选显示图表复选框以显示控制选项，接着点击自动校准DO和pH。
			<ol>
				<li>如果反应器中存在空气且需要重新校准时，请通过点击相应POD窗口左上角的蓝色左箭头返回MBS仪表板的第一页。点击按钮进入手动操作模式。勾选废液管已就绪框，并在文本输入框中输入W以选择废液瓶。点击排出-清洗按钮，然后在弹出窗口中点击“是”。此操作将排空反应室并从培养基源瓶重新注入培养基。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在15 mL锥形管中准备正确数量的微载体，每种条件使用一管。 
	注意：微载体数量、聚集体表面积和细胞接种密度将根据具体应用而定。本方案建议注入特定数量的微载体，使其提供相当于75 cm2的可用生长面积，以便与T75培养瓶进行比较。</li>
	<li>让微载体在管中自然沉降；尽可能吸除上清液，但不得移除微载体，以便为细胞和新鲜培养基腾出空间。</li>
</ol>
3. 细胞与微载体注射
<ol>
	<li>确保自动引液和校准功能已成功完成。</li>
	<li>按照标准悬浮细胞工作流程，在软件窗口中依次点击，如同正在进行反应器接种。</li>
	<li>在弹出窗口中输入备注，说明此阶段尚未注入细胞。</li>
	<li>进入手动操作模式，暂停反应器搅拌，并在瓶架管线上加装白色C型夹。</li>
	<li>移除各耗材并转移至生物安全柜（BSC）。清除废液瓶和灌注瓶中的废弃培养基并丢弃。
	<ol>
		<li>若计划在研究过程中收集条件培养基，请务必清除大容量灌注瓶内的所有废液，以及灌注瓶内所含的小型1.5 mL管中的废液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从L瓶中移除非血清补充的生长培养基并丢弃。用约20 mL无菌PBS冲洗L瓶后弃去。向L瓶中加入25 mL含血清的生长培养基。</li>
	<li>将耗材放回各自对应的POD中。将培养基源瓶置于冰上，直至实验结束。每日更换冰块。 
	注意：可额外添加冷冻包与湿冰配合使用，以延长温度控制时间。</li>
	<li>用PBS清洗反应器，并冲洗管路。
	<ol>
		<li>点击 冲洗瓶 按钮，启用L瓶的 单选 按钮，选择 输出至废液，然后点击 开始冲洗MSCserum。 
		注意：此步骤将使新加入的hMSC培养基流经管路，确保无非FBS补充培养基进入反应器。</li>
		<li>再次点击 冲洗瓶 按钮，选择RR瓶的 单选 按钮，开始冲洗。此操作将使抗黏附冲洗液流经管路，确保管路已准备好进入反应器。</li>
		<li>在“瓶内内容物”窗口中，于软件中标注MSCserum位于R瓶，而该瓶实际装有PBS。</li>
		<li>进入手动操作模式，对废液瓶执行三次排液-清洗循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向反应器中加入抗黏附冲洗液。
	<ol>
		<li>返回“瓶内内容物”窗口，在软件中标注MSCserum位于RR瓶，而该瓶实际装有抗黏附冲洗液。</li>
		<li>进入手动操作模式，对废液瓶执行一次排液-清洗循环。 
		注意：此前的PBS清洗是为了防止DMEM中的成分干扰抗黏附冲洗；此时反应器内应充满抗黏附冲洗液，并含有微量PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当抗黏附溶液在反应器中停留30分钟后，用&#160;PBS冲洗耗材。
	<ol>
		<li>在“瓶内内容物”窗口中，于软件中标注MSCserum位于R瓶，而该瓶实际装有PBS。</li>
		<li>进入手动操作模式，对废液瓶执行三次排液-清洗循环。</li>
		<li>返回“瓶内内容物”窗口，在软件中标注MSCserum位于L瓶，而该瓶装有hMSC培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>排空反应器，等待细胞和微载体的注入。在手动操作面板中点击 重新接种，使系统停留在仪表盘提示接种反应器的阶段。 
	注意：此处“接种”仅指将用于在微型生物反应器中扩增的细胞进行注入。</li>
	<li>添加额外电阻器，以调节搅拌速度，使其与默认的R0电阻器保持一致。</li>
	<li>从培养瓶中收集细胞，并使用血细胞计数板进行计数。所有开放操作均需在生物安全柜（BSC）中进行，以确保无菌。
	<ol>
		<li>吸除培养基，用5–10 mL预热的PBS洗涤一次，随后吸除PBS，向培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶+EDTA溶液。</li>
		<li>在37 °C孵育5分钟，或直至所有细胞明显从培养瓶表面脱落。</li>
		<li>加入10 mL预热的hMSC培养基以中和胰蛋白酶活性。吸取液体内容物，转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>在300 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量hMSC培养基中用于计数。对于完全融合的T75培养瓶，通常使用2–4 mL体积，可获得约1–2×10⁶ 个细胞/mL的浓度。</li>
		<li>取部分重悬细胞与等体积台盼蓝活率染料混合，将混合液加入血细胞计数板进行计数。按照制造商说明书进行细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算达到150,000个细胞所需的细胞悬液体积，并用移液器将该体积加入各实验组对应的、已装有微载体的15 mL锥形管中。用新鲜、预热的hMSC培养基补足管内体积至2.2–2.5 mL。 
	注意：每个15 mL锥形管中的总体积应略大于2 mL，以便注入后反应器处于轻微过满状态，避免产生气泡，后续步骤中将平衡体积。</li>
	<li>向T75培养瓶对照组中加入相应体积的细胞悬液。</li>
	<li>每次操作一至两个耗材，将耗材从POD&#160;中取出并移入生物安全柜（BSC）。</li>
	<li>使用绿色4英寸钝针，用5 mL注射器吸取细胞和微载体，随后将其注入反应器中。</li>
	<li>将耗材放回基站，重复上述步骤，直至所有耗材均完成注入。</li>
	<li>在 软件窗口 中依次点击，确认接种已完成。当软件返回正常主页后，从耗材输出管线中移除白色夹子。</li>
	<li>进入手动操作模式，执行“排出过量”功能，将输出端口设为P（用于灌注）。启用静态搅拌模式，设置为开启1680秒，关闭120秒。静态搅拌期间保持搅拌频率为5 Hz。</li>
	<li>关闭光密度参考测量功能。
	<ol>
		<li>打开MBS客户端并点击 连接。输入以下引号内的命令：&#34;dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1&#34;</li>
		<li>点击 发送，等待确认命令已成功发送后，关闭MBS客户端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24小时后，禁用静态搅拌模式，重新启用正常搅拌模式。将搅拌频率降低至1.5 Hz。</li>
</ol>
4. 微型生物反应器操作
<ol>
	<li>每天监测微型生物反应器，确保无任何问题干扰实验。确保培养基来源瓶中的培养基体积保持在&#62;5 mL以上，以保证反应器顺利灌注且无异常。</li>
	<li>根据需要及时更换冰桶，以维持培养基来源瓶的温度控制。将避光遮布覆盖在微型生物反应器前方，防止光照导致培养基中挥发性成分降解。</li>
	<li>确保无气泡进入反应器。切勿忘记定期更换TCPS培养瓶对照组中的培养基。</li>
</ol>
5. 微型生物反应器收获
<ol>
	<li>确保生物安全柜（BSC）无菌且处于可操作状态。
	<ol>
		<li>将以下所需试剂在珠浴或水浴中预热至 37 °C：约 25 mL 温热的 hMSC 培养基、10 mL 温热的 PBS，以及收获所需的 1.5 mL 浓度为 10 mg/mL 的 Pronase。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备收获用的瓶架。
	<ol>
		<li>在软件中为每个 POD 启用手动操作模式。</li>
		<li>使用白色 C 型夹夹住耗材的进液管路，夹在管路透明部分。</li>
		<li>将耗材移至生物安全柜（BSC）中，清空废液瓶内容物并丢弃。</li>
		<li>用约 20 mL PBS 冲洗废液瓶后弃去。评估培养基瓶中剩余体积，必要时补充新鲜（冷藏）的 hMSC 培养基。 
		注：此处需要 &#62; 4 mL 培养基，以完成收获所需的三次必要排液-冲洗循环。</li>
		<li>在废液瓶中加入约 5 mL 冷 hMSC 培养基，以缓冲收集到的液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从微型生物反应器中收获细胞。
	<ol>
		<li>使用 1 mL 注射器吸取 200 µL 浓度为 10 mg/mL 的 Pronase，并吸入约 300–400 µL 空气。</li>
		<li>拧下侧端口注射管路的帽盖，用 70% 乙醇喷洒无针阀连接器。撕下固定侧端口注射管路打结处的胶带并解开结，松开白色泪滴形夹具。</li>
		<li>连接 1 mL 注射器，轻柔地将 Pronase 注入反应器中。用空气推动液体沿注射管路下行，确保所有液体完全进入反应器。</li>
		<li>重新夹紧泪滴形夹具，并盖回侧端口注射管路的帽盖。将耗材放回其对应的 POD，重新连接所有管路，移除白色 C 型夹，并恢复搅拌。</li>
		<li>确保废液瓶和培养基源瓶置于冰上。启动 5 分钟计时器，使 Pronase 在反应器内消化微载体。</li>
		<li>5 分钟后，检查微载体是否已降解，即在反应器中不再可见。若仍可见微载体，则额外延长消化 1 分钟；若微载体已不可见，则继续下一步操作。</li>
		<li>收获细胞。启用手动操作模式，设置循环次数为 3 次，输出端口为 W（废液），然后点击 排液-冲洗。</li>
		<li>排液-冲洗循环完成后，将耗材移回生物安全柜（BSC），使用 10 或 20 mL 注射器抽取废液瓶中的内容物。</li>
		<li>将废液瓶内容物转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液，并评估细胞沉淀的大小。</li>
		<li>用 1–5 mL 生长培养基或 PBS 重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板进行细胞计数。对所有耗材重复此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用常规细胞培养方案收获培养瓶中的样本（条件）。间充质干细胞（MSCs）的典型方案见步骤 3.13。</li>
</ol>
6. 分析微生物反应器条件和摇瓶条件下的细胞，用于下游应用
注意：生成本研究结果所用的分析方法在下文简要提供，更详细的描述见 Krupczak, Farruggio 和 Van Vliet（2024）20。
<ol>
	<li>环境控制：在培养期间，使用微生物反应器提供的图形用户界面访问并显示每个一次性耗材集成传感器的数据。这些数据可在随微生物反应器提供的笔记本电脑中预装的 Breez Explorer 软件中查看。</li>
	<li>细胞得率：按照上述方法收获间充质干细胞（MSCs），在 300 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。小心移除上清液，并用适量 PBS 或 hMSC 培养基（1–2 mL）充分重悬细胞沉淀。取一部分重悬的细胞混合液，与等体积的台盼蓝染料混合。用微量移液器将染色后的样品混合液加入血细胞计数板芯片中，使用自动或手动血细胞计数仪测定细胞数量和活率。</li>
	<li>通过以下所述的两步法逆转录定量聚合酶链式反应检测基因表达。
	<ol>
		<li>RNA 纯化：使用 RNeasy Mini 试剂盒，按照制造商说明书从每个样品中分离和纯化 RNA。简而言之，裂解细胞，将细胞内容物转移至纯化离心柱中，并用各缓冲液洗涤样品，以去除可能干扰后续 PCR 反应的非必需细胞组分、核酸和蛋白质。</li>
		<li>cDNA 转录：使用 High-Capacity 逆转录试剂盒和热循环仪，按照制造商说明书将纯化的 RNA 转录为互补 DNA（cDNA）。简而言之，将试剂盒组分解冻，并根据样品数量按适当体积配制主混合液。将等量的纯化 RNA 和预混主混合液（各 10 µL）分别加入 PCR 板的每个孔中，注意记录每个样品的位置。按照制造商提供的程序在热循环仪中完成逆转录反应。</li>
		<li>qPCR：使用经验证可避免引物二聚体形成的外显子跨接、序列特异性引物，按适当体积（通常分别为 1 µL、1 µL、1 µL、7 µL 和 10 µL）将正向引物、反向引物、模板 cDNA、无核酸酶水和主混合液加入 384 孔 qPCR 板中，每个基因和样品设置多个技术重复孔。如有需要，可将样品分装至多个孔板以覆盖所有目标基因。确保同一目标基因的所有样品均加样于同一块孔板上，以避免板间差异；每块孔板均应包含适当的看家基因和无模板对照。在合适的 qPCR 仪器上检测荧光强度，并采用 ΔΔCt 法进行相对定量分析以计算基因表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Krupczak, B., Farruggio, C., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+mesenchymal+stromal+cells+in+a+microcarrier-microbioreactor+platform+can+enhance+cell+yield+and+quality+attributes%3A+case+study+for+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Manufacturing mesenchymal stromal cells in a microcarrier-microbioreactor platform can enhance cell yield and quality attributes: case study for acute respiratory distress syndrome.</a> J Transl Med. 22 (1), 614(2024).</li>
<li>Ng, E. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolvable+Gelatin-Based+Microcarriers+Generated+through+Droplet+Microfluidics+for+Expansion+and+Culture+of+Mesenchymal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dissolvable Gelatin-Based Microcarriers Generated through Droplet Microfluidics for Expansion and Culture of Mesenchymal Stromal Cells.</a> Biotechnol J. 16 (3), e2000048(2021).</li>
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作者披露与微生物反应器制造商MilliporeSigma存在合作协定。

本方案描述了一种采用微载体-微型生物反应器方法扩增、启动并收获细胞的技术。该过程能够在台式规模下，利用生物反应器平台（相较于传统的组织培养塑料表面培养瓶）对间充质干细胞（MSCs）等贴壁依赖性细胞实现更优的生化调控，从而增加细胞数量，适用于快速工艺开发。此外，本文还证明了通过微载体-微型生物反应器生产的MSCs可获得一种启动状态的细胞表型，可能在治疗急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中表现出增强的治疗效力。
基于生物反应器的方法在工艺开发和细胞制造方面具有重要优势，包括能够监测和调控环境参数，如pH、温度、二氧化碳和溶解氧。由于这些参数的波动可能对细胞产量和表型产生不利影响，缺乏此类功能的培养平台（包括传统的组织培养处理塑料瓶，TCPS）可能产生质量和数量不一致且不可预测的细胞批次。然而，大多数市售的用于贴壁依赖性细胞培养的生物反应器平台其运行体积或规模不适合探索性的台式研究，且成本过高（例如，典型的小型搅拌罐生物反应器工作体积约为3升）。因此，本方案相较于现有方法的意义在于，在适合台式研究、快速原型构建和探索性工艺开发的操作规模上，实现了细胞收获并提供了生物反应器的优势特性——更优的...

将活细胞用作治疗性产品，近年来已成为应对多种健康挑战的有前景的新治疗选择。例如，嵌合抗原受体（CAR）T细胞已使那些对所有既往可用疗法均耐药的所谓“液体肿瘤”——白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤——患者实现了持久缓解1。最近，一种间充质干细胞/基质细胞（MSC）产品（Ryoncil）获批用于治疗患有类固醇耐药性急性移植物抗宿主病（SR-aGvHD）的儿童，该疾病的死亡率超过&#62;50%2。然而，要将此类疗法拓展至其他尚未满足的临床需求，还需对治疗手段本身以及该产品的开发与制造方法进行深入研发。
一个尚未满足的临床需求体现在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者中。本文以 ARDS 为例，提供一个具体的应用场景，用以说明该方法及其结果，并探讨可能扩展至其他疾病靶点的应用前景。ARDS 是一种危重（数小时至数天内快速进展）、常见（美国每年病例超过&#62;20万例）且致死率高（病死率为27%–46%，取决于病情严重程度）的临床病症，在 COVID-19 大流行期间，由于 SARS-CoV-2 感染患者的主要死因通常为 ARDS，该病重新受到广泛关注3,4。ARDS 的特征是肺血管通透性增加，导致间质性肺水肿、肺泡积液，以及包括中性粒细胞和红细胞在内的细胞成分渗入肺泡腔5。在 ARDS 的早期渗出阶段，固有免疫细胞介导的炎症通过破坏内皮和上皮屏障的完整性，并通过分泌促炎性细胞因子促进免疫细胞的募集与活化，从而引发上述病理改变；能否成功控制炎症反应、修复屏障完整性并避免过度纤维化，是决定患者能否存活的关键3。尽管抗病毒药物如瑞德西韦（Remdesivir）在治疗 SARS-CoV-2 相关 ARDS 中显示出一定前景，但对于其他病因所致的 ARDS，目前尚无获批的可降低病死率的药物干预手段5。
间充质干细胞（MSCs）可能为治疗急性呼吸窘迫综合征（ARDS）提供一种有前景的方法，因其在全身注射后具有向肺组织特异性归巢的特性，并能够向周围微环境分泌具有免疫调节作用的旁分泌信号6,7。机制研究表明，多种旁分泌因子的表达，如白细胞介素-10（IL-10）8、吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）9、前列腺素E2（PGE2）10等，可能介导MSC在包括急性肺损伤（ALI）/ARDS在内的多种适应证中的潜在治疗效力11；因此，这些基因产物的表达水平可作为潜在的关键质量属性（pCQAs），用于预测临床疗效，并为终末细胞产品的生产提供可操作的放行标准。然而，生产足够数量的细胞以达到有效治疗剂量仍具挑战性；例如，Ryoncil的推荐剂量为每公斤患者体重2 × 106个细胞，每周给药两次，持续4周12。对于一名80 kg的患者，单个疗程所需MSC数量超过&#62;12亿个，这需要较大的物理空间来容纳满足该二维培养条件所需的足够表面积。由于这种活细胞产品在给药前无法在不损害其治疗潜能的前提下进行灭菌处理，因此必须严格遵循现行药品生产质量管理规范（cGMP）以无菌方式生产，这进一步增加了细胞制造的物流复杂性，从而推高了产品成本13。
此外，先前的研究表明，在组织培养用聚苯乙烯（TCPS）培养瓶中常规培养间充质干细胞（MSC）会导致细胞群体内表型异质性的出现。对于某些最终用途而言，这使得在科研及临床转化过程中，不同批次间的质量控制变得困难14,15,16,17。据推测，TCPS培养瓶中有限的生化控制条件（包括气体、营养物质和代谢废物的扩散梯度、pH调节能力差等）是造成这些挑战的原因之一。
这些问题促使人们采用基于生物反应器的培养方式，以利用在可控的三维生长环境中通过动态混合所能实现的更优生化调控和更高的细胞密度18。然而，基于生物反应器的加工或生产也面临一系列自身挑战：由于间充质干细胞（MSCs）属于贴壁依赖性细胞类型，因此在生物反应器中培养时需要某种形式的生长基质，这就必须添加微载体。此外，许多市售的生物反应器运行规模所需体积过大（&#62; 3 L 培养基），对于探索性台式研究而言资源消耗过高，而这类研究正是识别和优化影响细胞质量可测指标表达的未知工艺参数所必需的。这些特征被称为潜在关键质量属性（pCQAs）19。
Krupczak 等人先前报道了一种微载体-微型生物反应器方法，该方法可生产出在体外评估中具有改善的 pCQA 表达的间充质干细胞（MSCs），用于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）治疗，但该研究仅限于in vitro评估20。该方法结合了实验室自制的可溶解明胶微载体平台与市售的微型生物反应器平台——Mobius Breez 微型生物反应器21。该微型生物反应器采用 2 mL 一次性使用的一次性反应腔室，在动态混合的闭环灌注培养系统中实现了对温度、pH、CO2 和 O2 的调控，具备多种有利于提高生化控制性能的理想特性，但其设计并未考虑适用于MSCs等贴壁依赖性细胞。事实上，用于注入反应物的标准微流控通道过小，无法允许微载体通过，因此必须进行大量改造，才能在此平台上成功生产MSCs。
本文详细描述并图示了将该微型生物反应器用于间充质干细胞（MSCs）贴壁依赖性培养的适应性操作流程。文中报告的工艺参数旨在为间充质干细胞在临床前研究中的工艺开发与生产提供参考。 体外 评估ARDS治疗效果。然而，原则上，该方案可适用于其他终端用户应用、其他与炎症或免疫调节相关的病症，以及在台式规模条件下可受益于增强生化调控的其他贴壁依赖性细胞类型。 图1 示意图展示了随附视频中所述的实验方案，以及 图2, 图3, 和 图4 展示关键结果。

<table><tbody><tr><td>抗黏附冲洗液</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breez 微型生物反应器</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>锥形管，15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>锥形管，50 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基，低糖</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室封口膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微载体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝头针，4&quot;，18号</td><td>Amazon</td><td>B0D663ZR6D</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶（源自灰色链霉菌）</td><td>MilliporeSigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，10 mL</td><td>VWR</td><td>75816-100</td><td></td></tr><tr><td>无菌去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，0.22 µm，无菌</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229762</td><td></td></tr><tr><td>注射器，1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>注射器，20 mL</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>注射器，5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>注射器，50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>组织培养用聚苯乙烯培养瓶，T75</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>SigmaAldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

基于微型生物反应器的锚定依赖型间充质基质细胞制备及其在急性呼吸窘迫综合征中的应用

Microbioreactor-Based Production of Anchorage-Dependent Mesenchymal Stromal Cells Primed for Acute Respiratory Distress Syndrome

基于细胞的治疗是多种健康状况下正在兴起的一种治疗策略。然而，生产足量且高质量的细胞仍然是当前活跃的科学与技术挑战。最终的细胞产品无法进行灭菌处理，因此无菌性以及基于设计质量（quality-by-design）的考量至关重要。对于贴壁依赖性细胞，目前在研发和工业规模上仍采用培养瓶扩增方式，这种方法需要较大的空间占用，限制了对生化环境（pH、CO2 和 O2、营养物质与代谢物的扩散梯度）的控制，并提供可能影响最终细胞质量的物理信号。这些挑战推动了基于生物反应器的生产方式的应用，但此类方法通常在体积规模上带来操作难题，对于探索性的台式研究或工艺开发而言，可能成本过高。已有报道表明，利用微型生物反应器结合微载体进行细胞治疗产品的生产，可在培养过程中实现对特定测试细胞来源类型——间充质基质细胞的生化环境控制。为初步评估细胞在体外的in vitro质量，急性呼吸窘迫综合征被考虑作为一个潜在的应用场景。本文所展示的方法由于采用小体积（2 mL）和微型生物反应器内严格的生化控制，能够在台式规模实现快速的工艺开发。为实现贴壁依赖性细胞类型（如间充质基质细胞）在该系统中的培养，需对微型生物反应器工艺进行大量改进，并采用通过微流控工艺自主制备的明胶微载体平台。本文进一步详细阐述了在微型生物反应器中培养此类贴壁依赖性细胞所使用的方法及工艺参数，旨在帮助其他研究人员将这些实践方法适配至其各自的研究场景和细胞来源类型中。

微型生物反应器能够在培养过程中持续监测和调控环境因素，时间长达约10天。在培养期间，微型生物反应器条件下可精确测量并维持pH（图2A）、温度（图2B）、溶解氧（图2C）和二氧化碳（图2D）等环境参数，而普通培养瓶条件下则无法实现。为便于说明，图2A-D展示的是单个POD的代表性结果，但截至目前，在超过30次独立实验中均观察到了pH、温度、溶解氧和二氧化碳稳定性的定量相似结果。在培养瓶条件下未对pH、温度、溶解氧和二氧化碳进行测量，这符合标准细胞培养操作的常规做法；为证实TCPS培养瓶条件下的环境控制能力相对较弱，确实会导致这些参数出现波动，本文参考了类似时间尺度下的pH变化情况，总结于18。该研究...

本文描述了一种用于生产贴壁依赖性细胞的微载体-微型生物反应器方案，该细胞具有作为细胞治疗产品的潜力。以急性呼吸窘迫综合征为应用示例，本方案展示了与传统培养瓶工艺条件相比相当的细胞产量以及更有利的基因表达谱。该方案可拓展应用于其他贴壁依赖性细胞及不同的适应症。

基于细胞的治疗是多种健康状况的一种新兴治疗策略。然而，生产足量且高质量的细胞仍然……

我们研究细胞如何与其环境相互作用，包括在将细胞作为治疗手段进行生产或制造时的情况。在此，我们探讨了如何克服某些临床转化障碍，以实现对间充质基质细胞（MSCs）等贴壁依赖性细胞的生产。人们日益认识到，细胞群体的变异性会影响每一批次或每位个体最终细胞产品的稳定性和效力。这些挑战甚至可能影响某些细胞疗法的监管审批。我们致力于解决这一难题，旨在实现每毫升液体中获得高密度细胞，同时对环境进行高度控制，并具备可放大性。本方案提供了一种方法，可用于对间充质干细胞（MSCs）等贴壁依赖性细胞进行在线环境监测。这种过程控制相较于目前大多数实验室和临床生产中仍在使用的烧瓶具有优势。对于间充质干细胞（MSCs）及其他对机械信号敏感的细胞类型，仍存在若干尚未解决的问题。例如，此类方法如何帮助工程化细胞以应对其他疾病状态？首先，取下瓶架中与 LL 瓶相连的透明塑料盖。使用一支新的无活塞无菌 50 毫升注射器，将喷嘴连接至 LL 瓶。将无菌过滤水倒入注射器筒内，然后注入 LL 瓶中。同样地，向 L 瓶中加入 25 毫升不含 FBS 的低糖 DMEM，向 R 瓶中加入 25 毫升无菌 PBS，向 RR 瓶中加入 8 毫升抗黏附冲洗液。重复此操作，以制备实验所需数量的耗材。接下来，对实验中将使用的每个模块进行自检。当模块成功通过自检中的所有检测后，取出自检盒并将其放入避光保护袋中储存。将耗材安装到生物反应器上。取下耗材阀门上的绿色胶带，将耗材安装到样本舱中。重新安装夹具，并检查是否有漏气声以确认密封牢固。将白色压力传感器管路、红色气压管路和蓝色真空管路连接在耗材与基站或样本舱之间。在开始新实验之前，使用白色泪滴形夹子夹紧侧向进样口。在软件界面中点击“冲洗瓶”图标。启用 L 瓶对应的单选按钮，选择“排液至废液”，然后点击“开始冲洗 MSCserum”。在“瓶内物质”窗口中，指明 MSCserum 位于含有 PBS 的 R 瓶中。然后进入“手动操作”界面，对废液瓶执行三次“弹出清洗”循环。在“瓶内物质”窗口中，指明 MSCserum 现在位于含有抗黏附冲洗液的 RR 瓶中。返回手动操作界面，对废液瓶执行一次排空清洗循环。30分钟后，用PBS冲洗耗材。排空反应器，等待细胞和微载体的注入。在手动操作面板中，点击“重新接种”。将系统暂停在仪表盘提示接种反应器的步骤。随后，将重悬细胞的计算体积用移液器加入每个条件对应的含有微载体的15毫升锥形管中。用新鲜的温热人源间充质干细胞培养基将每根试管补液至 2.2 至 2.5 毫升。每次操作一种或两种耗材，将其从底座上取下并移入生物安全柜中。使用绿色四英寸钝针，将细胞与微载体混合物吸入一支 5 毫升注射器中。将混合物注入反应器中。小心握住卡带底部附近的注射端口管路，注意不要将管路拔下。使用拇指和食指之间的滚动动作，将注射端口管路扭转两整圈，以在管路中形成打结状的扭结。将结扎结塞入进样口底部附近的切口处，并用一小块实验室胶带固定。然后将耗材放回基站。对所有耗材重复进样操作后，通过软件界面提示接种已完成。当软件返回主页后，从耗材输出管路中取下白色夹子。进入手动操作界面，将输出端口设置为 P（灌注），执行排出多余液体功能。启用静态混合模式，设置循环为开启 680 秒、关闭 120 秒，混合频率设为 5 赫兹。开始收集细胞时，使用1毫升注射器吸取200微升Pronase以及大约300至400微升空气。拧开侧端口输液管上的帽盖，用70%乙醇喷洒无针阀连接器。撕下结扎的侧端口输液管上的胶带，解开结，并打开白色泪滴状夹子。现在，连接1毫升注射器，缓慢将蛋白酶注入反应器中。随后注入空气，以确保液体完全注入。重新夹紧梨形夹，并盖上进样管的盖子。然后将耗材放回舱内，重新连接所有管路，移除白色C形夹，并恢复混合。将废液瓶和培养基源瓶置于冰上。启动5分钟计时器，使Pronase在反应器中消化微载体。五分钟后，通过检查反应器中微载体是否消失来确认其已降解。进入手动操作模式进行细胞收获，设置循环次数为三次，选择废液输出端口 W，然后点击“排出清洗”。排出清洗循环完成后，将耗材转移至生物安全柜中。然后使用10或20毫升注射器抽出废液瓶中的内容物。将废液瓶中的内容物转移至15毫升锥形离心管中。在300×g条件下离心5分钟。吸弃上清液，并评估细胞沉淀的大小。在微型生物反应器系统中，环境条件（包括pH、温度、溶解氧和二氧化碳）在整个10天的培养期间均稳定维持。与组织培养用聚苯乙烯培养瓶条件相比，微型生物反应器中的pH波动显著更低。微型生物反应器中的细胞得率高于T25培养瓶，同时保持相似的细胞活力。在测定的14项与效力相关的质量属性中，有9项在微型生物反应器条件下的mRNA表达水平显著高于T75培养瓶。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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基于GMP级可溶性多孔微载体的大规模细胞生产

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基于微型生物反应器的锚定依赖型间充质基质细胞制备及其在急性呼吸窘迫综合征中的应用

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