Name: 探索蛋白质-聚糖相互作用：核磁共振的进展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 探索利用核磁共振技术研究蛋白质-聚糖相互作用的结构动力学机制。该方法通过检测弱相互作用和变构效应，为糖链特异性诊断和分子识别机制研究提供重要框架。

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我们感谢国家核磁共振中心Jiri Jonas（CNRMN）提供核磁共振波谱仪的使用。我们感谢Carole Bewley博士与我们分享CVN与Manα1-2Manα复合物的化学位移归属。我们还感谢资助机构FAPERJ和CNPq的支持。

作者声明不存在任何竞争利益。

核磁共振（NMR）波谱法是一种研究蛋白质-聚糖相互作用的多功能方法，尤其适用于检测弱且短暂的相互作用，例如CVN与D-甘露糖之间所观察到的相互作用。本文所述方案结合了基于配体和基于蛋白质的NMR方法，能够更全面地表征相互作用界面。
该实验方案的关键步骤包括精确控制蛋白质和配体浓度的样品制备、光谱参数的标准化，以及核磁共振实验的适当选择。数据的可重复性在很大程度上取决于样品的稳定性，尤其是在对溶剂饱和效应敏感的STD和WaterLOGSY21,43等实验中尤为如此。
通过从配体和蛋白质两个角度采用互补的核磁共振（NMR）方法，本研究得以验证结合位点，并检测潜在的变构效应或碰撞复合物的形成，这些现象通常难以观测。 通过 分离方法
在实际操作中，该方案可能需要根据所研究的体系进行调整。对于溶解度较低或表达量较低的蛋白质，可采用选择性同位素标记（...

蛋白质-聚糖相互作用在多种生物学过程中起着基础性作用，包括细胞间识别、免疫应答调节以及病原体与宿主之间的相互作用1,2。这些分子相互作用具有高度特异性和动态性，在生理和病理机制中均发挥关键作用3,4,5。此类相互作用的一个经典例子是凝集素（lectins），即能够特异性识别并结合聚糖的蛋白质。例如，Cyanovirin-N（CVN）因其能够以高亲和力与高甘露糖寡糖发生相互作用，已被广泛用作实验模型进行研究5,6,7。
除了凝集素外，许多糖基化蛋白（如整合素）也在识别和细胞信号传导中发挥关键作用。整合素是一类跨膜受体，其亚基常发生糖基化修饰，从而影响其稳定性以及对配体（包括聚糖）的亲和力5,8,9,10。然而，由于聚糖本身具有内在的异质性和柔性，使得传统结构生物学方法难以解析这些相互作用的结构特征，因此对该类相互作用进行结构表征仍具挑战性。在此背景下，开发能够在溶液中捕捉此类相互作用的先进方法对该领域，特别是糖生物学领域，具有重要意义11,12。
核磁共振（NMR）波谱技术已成为在原子水平上研究蛋白质-配体相互作用的有力工具。与其他技术（如X射线晶体学和冷冻电子显微镜）不同，NMR能够在接近生理条件下研究生物大分子相互作用，从而提供关于结构和动力学的深入信息。这种灵活性使研究人员能够调节环境参数，如pH值（通常为4.0–8.0）、离子强度（例如0–500 mM NaCl）和温度（一般为273–330 K），从而根据蛋白质-聚糖复合物的具体特性优化实验条件。此外，NMR在分析瞬时性和弱相互作用方面具有显著优势，而这类相互作用通常是蛋白质识别聚糖过程的典型特征13,14。
已采用多种核磁共振（NMR）技术研究蛋白质-聚糖相互作用，包括基于蛋白质和基于配体的方法。从蛋白质角度出发，异核单量子相干（HSQC）滴定法被广泛用于通过监测配体加入后化学位移的变化来定位结合位点。弛豫弥散实验能够检测发生在微秒至毫秒时间尺度上的构象变化和化学交换过程，从而揭示聚糖识别过程中的动态特性15,16。这些基于蛋白质的技术通常要求样品浓度在50 µM至2 mM之间，具体取决于蛋白质的稳定性和标记效率17,18。
基于配体的核磁共振（NMR）技术通过聚焦结合过程中糖链的变化，提供互补的信息。饱和转移差谱（STD-NMR）在识别参与识别过程的糖链表位方面尤为有用，因为它可以选择性地饱和与蛋白质紧密接触的配体区域的核磁共振信号19,20。通过梯度谱观测水-配体相互作用（Water-Ligands Observed via Gradient Spectroscopy, WaterLOGSY）21,22 和转移核Overhauser效应谱（Tr-NOESY）为评估配体结合及相互作用过程中的构象变化提供了额外手段23。此外，Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）弛豫实验有助于识别那些使用常规方法难以检测的弱结合和瞬时相互作用24。基于配体的实验通常在蛋白质浓度为10–50 µM的条件下进行，可能需要优化混合时间与饱和参数25。值得注意的是，这些方法可能受限于糖链溶解度低，或在使用小分子配体时信噪比较差的问题。
这些核磁共振（NMR）方法共同为阐明蛋白质-聚糖相互作用的结构与动态特性提供了全面的框架。随着灵敏度和同位素标记策略的不断进步，该技术在糖生物学中正变得日益重要，为分子识别机制提供了新的视角，并在药物开发和生物标志物发现方面具有潜在应用价值。然而，这些方法的成功依赖于多种因素，例如样品的均一性、聚糖的复杂性，以及是否存在柔性或无序区域，这些可能拓宽NMR信号或阻碍谱图解析26。NMR是研究瞬时事件的有力手段，而瞬时事件正是结构生物学中的一个主要挑战。
CVN 能够以纳摩尔级亲和力识别高甘露糖型寡糖中存在的 α(1,2)-连接的甘露糖残基27,28,29。然而，它对单糖 D-甘露糖的识别能力较弱。在本研究中，我们通过分析 CVN 与 D-甘露糖的相互作用，展示核磁共振（NMR）技术在研究瞬时相互作用方面的强大能力。

<table><tbody><tr><td>13C 葡萄糖</td><td>Cambrige Isotopic Lab.</td><td>CLM-481</td><td></td></tr><tr><td>15N 氯化铵</td><td>Cambrige Isotopic Lab.</td><td>NLM-467</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Cambrige Isotopic Lab.</td><td>DLM-4</td><td></td></tr><tr><td>D-甘露糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2069-5G</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td></td><td></td><td>软件教程链接: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾 (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Shigemi 管</td><td>Bruker</td><td>Z1Z10684A</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠 (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠 (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S97263</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz 波谱仪</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker 800 MHz 波谱仪</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫胺素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>三共振 TXI 探头</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93657</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

探索蛋白质-聚糖相互作用：核磁共振技术的进展

Exploring Protein-Glycan Interactions: Advances in Nuclear Magnetic Resonance

蛋白质-聚糖相互作用在许多生物过程中起着核心作用，并且日益被视为感染性疾病、炎症性疾病和肿瘤性疾病诊断策略中有前景的靶点。然而，表征这些相互作用（尤其是当它们较弱且具有瞬时性时）在技术上仍具挑战性。核磁共振（NMR）波谱技术在近生理条件下研究此类相互作用具有独特优势，可提供原子分辨率水平的结构与动态信息。本研究中，我们提出了一种整合型NMR实验方案，以甘露糖特异性凝集素cyanovirin-N与单糖D-甘露糖为模型体系，用于研究低亲和力的蛋白质-聚糖相互作用。该方案结合了基于配体和基于蛋白质的NMR方法，全面绘制结合位点，并检测细微的结合事件，包括潜在的别构效应或碰撞复合物。该方案的关键步骤包括精细的样品制备、浓度的精确控制以及谱图标准化，以确保数据的可重复性和可靠性。溶液中的NMR技术能够检测到其他方法通常难以捕捉的瞬时相互作用。尽管弱相互作用对生命活动至关重要，但现有文献更倾向于研究高亲和力复合物，而低亲和力复合物在许多重要生物学功能（如信号转导和细胞间通讯）中同样具有重要意义。该技术为研究蛋白质-聚糖识别提供了强有力的平台，有望成为基于聚糖特异性相互作用发现新型诊断标志物的重要工具。

在本研究中，我们介绍了用于研究蛋白质-聚糖相互作用的核磁共振实验。蛋白质-聚糖分子识别是众多涉及细胞外基质（ECM）的生物学过程的基础，包括细胞黏附、迁移、增殖以及各种其他形式的细胞间通讯的调控。
本研究中，我们选择使用单糖 D-甘露糖，其被描述为一种弱结合配体。目标是阐述测量瞬时相互作用的方法，并强调其在阐明结合机制中的重要性。采用三种不同的基于配体的核磁共振（NMR）方法来表征配体的相互作用位点。
第一种方法是评估在CVN存在下D-甘露糖的化学位移扰动（CSPs）。为此，我们在相同的缓冲条件下记录了含有相对于CVN过量50倍的D-甘露糖样品的1H-13C-HSQC谱图（图1A）以及游离D-甘露糖的谱图（图1B）。两种异头构型均观察到化学位移变化（图1C）。值得注意的是，β-D-甘露糖的扰动更为显著，提示...

本基于核磁共振（NMR）的实验方案利用氰病毒素-N（cyanovirin-N）与D-甘露糖研究弱蛋白-聚糖相互作用。通过结合配体检测与蛋白检测方法，该方案可定位结合位点、检测变构效应并鉴定碰撞复合物。该方法概述了样品制备与数据分析流程，为聚糖特异性诊断及识别机制提供重要的结构与动态信息。

蛋白质-聚糖相互作用在许多生物过程中起着核心作用，并且正日益被视为疾病诊断策略中极具前景的靶点……

我们研究蛋白质-蛋白质和蛋白质-聚糖相互作用，重点关注整合素-去整合素复合物。我们的模型探讨了结构动力学，并揭示了表面力在介导复合物形成及相互作用稳定性中的作用。本课题组致力于通过研究蛋白质中表面疏水簇，阐明表面力在分子识别以及结合位点进化过程中的作用。NMR 溶液技术能够实现对蛋白质相互作用的检测。尽管弱相互作用对生命活动至关重要，但目前研究仍倾向于高亲和力复合物，即使弱相互作用参与了许多重要的生物学功能。本研究团队致力于采用整合性结构生物学方法来研究大型蛋白质复合物。我们采用核磁共振（NMR）作为主要工具来研究动力学和功能特性。首先，配制含有50毫摩尔氯化钠和5%氘代水、pH为7.4的磷酸钠缓冲液中的4毫摩尔D-甘露糖溶液。将该溶液分为两个样品，其中一个含有80微摩尔CVN，另一个不含CVN。为通过核磁共振波谱仪上的化学位移扰动来绘制配体结合图谱，设置HSQCTOPSI脉冲序列以采集¹H-¹³C HSQC谱。配置时域参数、谱宽、载波频率及扫描次数。使用所提供的公式计算化学位移扰动。为了通过饱和转移差值法（saturation transfer difference）绘制配体结合图谱，首先创建一个新的数据集。通过筛选不同的饱和频率，或固定频率同时改变饱和时间以评估信号累积，来配置STD NMR实验参数。使用ZGPR脉冲序列设置1D H1 NMR实验。调节光谱仪以适用于¹H，进行匀场，并测量一个硬90度脉冲。将载波频率中心大致设在4.7百万分之一（ppm），对应水信号位置，然后选择STDDIFFESGP.3脉冲序列并设置采样参数。根据实验目标设置谱宽、扫描间延迟 D1 为四秒，并定义饱和时间 D20。在 FQ2 列表中加载偏共振频率为负 40 百万分之一，以及仅用于饱和蛋白质的共振频率。测试负 0.59、0.73 和 8.1 百万分之一的共振频率，以确定最佳条件。使用最佳频率在饱和时间分别为 0.5、1、1.5、2、2.5、3 和 4 秒的条件下采集 STD 谱图。将相应的 ASTD 值对饱和时间作图。接下来，将扫描次数设为 64，并对实验循环平均 4 次。然后，计算扫描总次数。将扫描间延迟设为4秒，采集时间设为2.7262976秒。通过将饱和脉冲持续时间设为50毫秒，并通过程序9SP9控制高斯脉冲形状，来配置饱和脉冲。在STD NMR变体中应用T1行滤波器，然后根据蛋白质大小设置自旋锁时间D29。为绘制配体结合H1 R2图谱，首先从Bruker标准库中选择CPMG_ESGP2D脉冲程序。将实验设置为二维采集。按照所示设置采集参数。然后运行实验，共 200 个循环，每个循环包含 8 次扫描。根据所需的 CPMG 循环总时间调整可变计数器列表。进行两个实验，一个用于含蛋白质的样品，另一个用于仅含配体的样品。使用命令 EFP 或 sine M 后接 FP 绘制每个 TCPMG 的 H1 谱，然后根据最佳处理策略调整窗函数。利用方程计算 CPMG 商值 Q。在298开尔文下获取¹⁵N标记的CVN的H1N15HSQC谱。加入D-甘露糖滴定，使终浓度分别为0、1、2、5、10、20、40和60毫摩尔。采用布鲁克标准谱库中的相敏FHSQCF3GPPH快速HSQC脉冲序列。然后，使用公式计算化学位移扰动。将每个残基的化学位移扰动值（CSP）对 D-甘露糖浓度作图，利用公式五确定解离常数 KD。随后，使用公式将所得数据拟合为单一结合等温线。采用相位敏感的 HSQCT2ETF3GPSI3D 脉冲序列，并按照所示参数设置，测定 CVN 残基在 298 开尔文温度下有无 60 毫摩尔 D-甘露糖存在时各残基的 N15 R2 值。使用 NMRPipe 处理准三维谱图，为每个弛豫延迟生成类似 HSQC 的谱图。将处理后的谱图导入分析平台。然后，选择所有谱图并应用以下强度变化工具。将每个交叉峰的强度对 T relax 作图，并将衰减曲线拟合为单指数函数，以提取每个残基的 N15 R2 值。根据 67.84 毫秒处 HSQC 类谱图的信噪比计算实验误差。处理仅包含噪声的谱图区域，并使用给定命令将其转换为文本文件。然后，使用统计软件确定该噪声区域的标准偏差或噪声强度。利用给定公式计算实验误差。在存在CVN的情况下，D-甘露糖的两种异头物均观察到化学位移扰动，其中β-D-甘露糖的位移更为显著，表明其具有优先结合的倾向。在CVN存在下，大多数D-甘露糖氢原子显示出两个不同的峰，分别对应于游离态和结合态。表现出最高ASTD值的氢核与β-D-甘露糖相关，这与CVN之间存在强烈的双极性相互作用一致。在横向弛豫速率分析中，H beta 四是唯一在结合 CVN 后弛豫显著增加的质子。配体加入所诱导的 H1 和 N15 化学位移扰动在浓度达到 10 毫摩尔时最大。β 链中的残基 I40、E41、N42、V43、D44 和 G45 显示出显著的化学位移扰动，表明它们构成了 D-甘露糖的高亲和力结合位点。结合等温线显示，在β折叠残基中，D44残基的亲和力最高，其解离常数约为1毫摩尔。N15 R2弛豫速率的测定表明，D-甘露糖结合后，delta R2值出现升高和降低两种变化，提示存在构象稳定化与交换过程的混合效应。残基C58、R59、K74和R76的delta R2值增加，证实它们参与了高亲和力结合位点；而残基F4、C8、R24和G27则代表了低亲和力区域。

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