探索蛋白质-聚糖相互作用：核磁共振技术的进展

我们研究蛋白质-蛋白质和蛋白质-聚糖相互作用，重点关注整合素-去整合素复合物。我们的模型探讨了结构动力学，并揭示了表面力在介导复合物形成及相互作用稳定性中的作用。本课题组致力于通过研究蛋白质中表面疏水簇，阐明表面力在分子识别以及结合位点进化过程中的作用。

NMR 溶液技术能够实现对蛋白质相互作用的检测。尽管弱相互作用对生命活动至关重要，但目前研究仍倾向于高亲和力复合物，即使弱相互作用参与了许多重要的生物学功能。本研究团队致力于采用整合性结构生物学方法来研究大型蛋白质复合物。

我们采用核磁共振（NMR）作为主要工具来研究动力学和功能特性。首先，配制含有50毫摩尔氯化钠和5%氘代水、pH为7.4的磷酸钠缓冲液中的4毫摩尔D-甘露糖溶液。将该溶液分为两个样品，其中一个含有80微摩尔CVN，另一个不含CVN。

为通过核磁共振波谱仪上的化学位移扰动来绘制配体结合图谱，设置HSQCTOPSI脉冲序列以采集¹H-¹³C HSQC谱。配置时域参数、谱宽、载波频率及扫描次数。使用所提供的公式计算化学位移扰动。

为了通过饱和转移差值法（saturation transfer difference）绘制配体结合图谱，首先创建一个新的数据集。通过筛选不同的饱和频率，或固定频率同时改变饱和时间以评估信号累积，来配置STD NMR实验参数。使用ZGPR脉冲序列设置1D H1 NMR实验。

调节光谱仪以适用于¹H，进行匀场，并测量一个硬90度脉冲。将载波频率中心大致设在4.7百万分之一（ppm），对应水信号位置，然后选择STDDIFFESGP.3脉冲序列并设置采样参数。

根据实验目标设置谱宽、扫描间延迟 D1 为四秒，并定义饱和时间 D20。在 FQ2 列表中加载偏共振频率为负 40 百万分之一，以及仅用于饱和蛋白质的共振频率。测试负 0.59、0.73 和 8.1 百万分之一的共振频率，以确定最佳条件。

使用最佳频率在饱和时间分别为 0.5、1、1.5、2、2.5、3 和 4 秒的条件下采集 STD 谱图。将相应的 ASTD 值对饱和时间作图。接下来，将扫描次数设为 64，并对实验循环平均 4 次。

然后，计算扫描总次数。将扫描间延迟设为4秒，采集时间设为2.7262976秒。通过将饱和脉冲持续时间设为50毫秒，并通过程序9SP9控制高斯脉冲形状，来配置饱和脉冲。

在STD NMR变体中应用T1行滤波器，然后根据蛋白质大小设置自旋锁时间D29。为绘制配体结合H1 R2图谱，首先从Bruker标准库中选择CPMG_ESGP2D脉冲程序。将实验设置为二维采集。

按照所示设置采集参数。然后运行实验，共 200 个循环，每个循环包含 8 次扫描。根据所需的 CPMG 循环总时间调整可变计数器列表。

进行两个实验，一个用于含蛋白质的样品，另一个用于仅含配体的样品。使用命令 EFP 或 sine M 后接 FP 绘制每个 TCPMG 的 H1 谱，然后根据最佳处理策略调整窗函数。利用方程计算 CPMG 商值 Q。

在298开尔文下获取¹⁵N标记的CVN的H1N15HSQC谱。加入D-甘露糖滴定，使终浓度分别为0、1、2、5、10、20、40和60毫摩尔。采用布鲁克标准谱库中的相敏FHSQCF3GPPH快速HSQC脉冲序列。

然后，使用公式计算化学位移扰动。将每个残基的化学位移扰动值（CSP）对 D-甘露糖浓度作图，利用公式五确定解离常数 KD。随后，使用公式将所得数据拟合为单一结合等温线。

采用相位敏感的 HSQCT2ETF3GPSI3D 脉冲序列，并按照所示参数设置，测定 CVN 残基在 298 开尔文温度下有无 60 毫摩尔 D-甘露糖存在时各残基的 N15 R2 值。使用 NMRPipe 处理准三维谱图，为每个弛豫延迟生成类似 HSQC 的谱图。将处理后的谱图导入分析平台。

然后，选择所有谱图并应用以下强度变化工具。将每个交叉峰的强度对 T relax 作图，并将衰减曲线拟合为单指数函数，以提取每个残基的 N15 R2 值。根据 67.84 毫秒处 HSQC 类谱图的信噪比计算实验误差。

处理仅包含噪声的谱图区域，并使用给定命令将其转换为文本文件。然后，使用统计软件确定该噪声区域的标准偏差或噪声强度。利用给定公式计算实验误差。

在存在CVN的情况下，D-甘露糖的两种异头物均观察到化学位移扰动，其中β-D-甘露糖的位移更为显著，表明其具有优先结合的倾向。在CVN存在下，大多数D-甘露糖氢原子显示出两个不同的峰，分别对应于游离态和结合态。表现出最高ASTD值的氢核与β-D-甘露糖相关，这与CVN之间存在强烈的双极性相互作用一致。

在横向弛豫速率分析中，H beta 四是唯一在结合 CVN 后弛豫显著增加的质子。配体加入所诱导的 H1 和 N15 化学位移扰动在浓度达到 10 毫摩尔时最大。β 链中的残基 I40、E41、N42、V43、D44 和 G45 显示出显著的化学位移扰动，表明它们构成了 D-甘露糖的高亲和力结合位点。

结合等温线显示，在β折叠残基中，D44残基的亲和力最高，其解离常数约为1毫摩尔。N15 R2弛豫速率的测定表明，D-甘露糖结合后，delta R2值出现升高和降低两种变化，提示存在构象稳定化与交换过程的混合效应。残基C58、R59、K74和R76的delta R2值增加，证实它们参与了高亲和力结合位点；而残基F4、C8、R24和G27则代表了低亲和力区域。