Name: 针对区域特定肠道淋巴管通讯选择性中断的小鼠肠系膜淋巴腺切除术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 了解小鼠肠系膜淋巴结切除术，用于选择性中断特定肠道节段的淋巴引流。该方法支持研究局部淋巴结在肠道免疫调节中的独特作用，并可获得高纯度CD45+细胞样本用于下游分析。

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感谢 J. Alderman、B. Cadugan、E. Hughes-Picard 和 J. Horrocks 提供的行政协助，以及 C. Hughes 对小鼠品系管理的支持。H.N.B. 是耶鲁大学外科医师科学家培训项目的研究员，该项目为本研究提供了部分资助与支持。本工作还获得了霍华德·休斯医学研究所（资助对象：R.A.F.）和美国外科医师学会住院医师研究奖（资助对象：H.N.B.）的资助。

所有操作均按照耶鲁大学动物护理与使用委员会（Yale Institutional Animal Care and Use Committee）的规程进行。为建立本实验流程，采用了8至12周龄的C57BL/6品系野生型小鼠，并设置年龄、性别和基因型相匹配的假手术对照组。实验包含雄性和雌性小鼠，体重范围为18至25 g。所用试剂和设备详见材料表。
1. 仪器、动物及手术室的准备
<ol>
	<li>对所有手术器械进行灭菌。确保手术台面和麻醉鼻罩用70%乙醇擦拭清洁。</li>
	<li>设置吸入式麻醉蒸发器装置，配备鼻罩及废气抽吸系统以清除过量麻醉气体。准备一个带有循环温水垫的手术操作台面，用于维持动物体温，并将所需物品置于方便取用且无菌的位置。 
	注意：本操作无需使用手术显微镜；然而，可考虑使用该仪器以改善视野可视化效果。</li>
	<li>通过给予2%-3%的吸入式异氟烷，同时以2 L/min的氧气流速诱导麻醉 通过 经机构批准的方案，从吸入式麻醉蒸发器设备中取出鼻锥
	<ol>
		<li>通过确认呼吸频率约为30-40次/分钟且对后足夹捏无反应，确保麻醉深度适当。定期重新检查麻醉深度，并相应调整异氟烷流量。 
		注意：也可使用可注射麻醉剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>遵循所在机构关于适当镇痛和局部麻醉的指导原则。例如，皮下注射长效镇痛剂如3.25 mg/kg的缓释布托啡诺（buprenorphine XR），并在预定切口部位按每5g体重最多0.04 mL的剂量，皮下注射1 mg/mL的利多卡因溶液。</li>
	<li>将动物仰卧位固定，涂抹眼用润滑剂，拔除或剪去腹部毛发，先用聚维酮碘溶液对腹部进行消毒，再用70%乙醇处理图2A).</li>
	<li>使用无菌手套，并在动物体表覆盖无菌手术巾，留出通向手术区域的窗口。整个操作过程中须保持无菌状态。</li>
</ol>
<img alt="Surgical procedure sequence, steps A to E, tissue healing, wound closure, medical illustration, scale 0.5 cm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68696/68696fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="Figure 4"> 
图图 2：肠系膜淋巴结切除术主要操作步骤的代表性图像. (A拔除并灭菌的腹部观察窗。B) 通过皮肤和白线做0.5 cm切口。 (C) 通过将回肠置于右侧、近端结肠置于左侧、盲肠置于下方，暴露肠系膜淋巴结链。第一个肠系膜淋巴结位于回结肠动脉旁（白色箭头）。D) 切除的肠系膜淋巴结（虚线箭头）。比例尺：0.5 cm。E) 离体 肠系膜淋巴结（白色箭头；2.5 mm × 3 mm）。刻度 = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68696/68696fig2v3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
2. 肠系膜淋巴结切除术准备
<ol>
	<li>沿中线做一道0.5–1 cm的切口穿过皮肤。钝性分离皮肤与腹壁，辨认腹白线。通过腹白线做一道0.5–1 cm的切口，以进入腹膜腔（图4B). 
	注意：为了更好地暴露第2/3/4站淋巴结，可考虑将切口向头侧延长，但不应超过软骨性剑突。</li>
	<li>向腹腔内注入1 mL体温的无菌生理盐水 通过 使用钝头灌胃针，并将无菌手术巾润湿以备进行肠管定位。用无菌湿润的棉签经切口识别并取出盲肠。
	<ol>
		<li>避免使用锐器处理肠管，以免造成损伤。应定期润湿手术巾和肠管，防止因干燥而受损。 
		注意：小鼠的盲肠通常位于腹腔的左下象限，但也可位于其他任一象限。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>明确需要切除的目标肠系膜淋巴结站，并遵循以下具体说明（即 3.1–3.4）。参见 图1A,B 用于解剖学标志和识别。</li>
</ol>
3. 肠系膜淋巴结站的解剖与切除
<ol>
	<li>第一淋巴结站（近端结肠引流；补充图1A，B'）。
	<ol>
		<li>将外置的肠段置于湿润的手术巾上，盲肠朝下，近端结肠朝上，回肠末端朝向术者右侧（动物左侧；图1A，图2C）。</li>
		<li>辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。使用有角度的精细镊子，通过将闭合的镊子插入淋巴结与回结肠血管之间的间隙并轻轻张开镊子，钝性分离第一淋巴结站。
		<ol>
			<li>取出镊子，重复此操作2-3次，或直至形成足够安全切除的分离平面。避免损伤主要的结肠血管（图3A，B）。 
			注意：若出现明显出血，应终止操作，并按照机构批准的方案人道处死动物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可选步骤：为降低邻近淋巴结侧支循环的理论风险，可使用9-0黑色单丝尼龙缝线和精细镊子进针，在淋巴结链上进行可选的缝扎结扎（在第一淋巴结站远端1 mm和近端1 mm处各缝一针间断缝合）（图3C，D）。</li>
		<li>轻柔地向尾侧牵拉已结扎的淋巴结站，使用精细剪刀从头侧向尾侧切除目标淋巴结站（图3E）。 
		注意：小鼠通常有一支来自回结肠动脉的小而可见的供血血管进入淋巴结后部。该血管出血可通过棉签轻压止血，直至实现止血。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="使用镊子操作组织的手术技术序列，步骤 A-F，0.5 cm 比例尺，实验方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68696/68696fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图 2"> 
图 3：肠系膜淋巴结清扫术（第一站）的标注图像及说明。（A）正确调整肠管方向以暴露第一站肠系膜淋巴结（白色箭头）。（B）在回结肠动脉（蓝色箭头）与淋巴结之间建立分离平面。（C）对进入淋巴结顶端的供血血管（蓝色箭头）进行缝扎，同时通过退出两结构之间的间隙（白色箭头）以避开回结肠血管主干。（D）对淋巴结基底部进行缝扎，再次注意并避开回结肠动脉的远端分支。（E）沿已建立的组织平面切除淋巴结，保持高位分离，将缝扎线留在原位（黑色箭头）。（F）确认止血效果，观察回结肠动脉的远端分支以确保血流正常，并注意淋巴结原所在位置（虚线箭头）已无残留淋巴结组织。比例尺：0.5 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68696/68696fig3v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>第二淋巴结站（中段-远端小肠引流）
	<ol>
		<li>同样轻柔地将小肠完整取出。将暴露的肠管置于湿润的敷料上，盲肠朝下，近端结肠朝上，小肠朝向术者右侧（动物左侧；图1A）。</li>
		<li>辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。第二站起始于回肠/空肠血管汇合处（图1B）。
		<ol>
			<li>使用弯头精细镊子，通过将闭合的镊子插入淋巴结与结肠血管之间的间隙并轻轻张开，钝性分离第二淋巴结站。</li>
			<li>取出镊子，重复此操作2-3次，或直至形成足够安全切除的分离平面。避免损伤主要的结肠血管。同时需特别注意回肠和空肠血管，若受损将造成严重后果。 
			注：若出现明显出血，应立即终止操作，并人道处死动物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可选步骤：为降低邻近淋巴结侧支循环的理论风险，可沿淋巴结链使用9-0黑色单丝尼龙线和精细镊子进行可选的缝扎结扎（在第二淋巴结站远端和近端各1 mm处分别施以单个间断缝合），以推动缝针（补充图2A）。</li>
		<li>轻柔地将结扎的淋巴结站向尾侧牵拉，使用精细剪刀从头侧向尾侧方向切除目标淋巴结站（补充图2B）。 
		注：小鼠常有一条细小但可见的供血血管从回结肠动脉发出，进入淋巴结后方。该血管出血可通过棉签轻压止血，直至实现止血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二和第三淋巴结站（近端-中段-远端小肠引流；补充图1C,D'）
	<ol>
		<li>轻柔地将整个小肠完全取出，直至达到后方固定点（屈氏韧带）。将暴露的肠管置于湿润的敷料上，盲肠朝下，近端结肠朝上，小肠朝向术者右侧（动物左侧；图1A）。</li>
		<li>辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。第二站起始于回肠/空肠血管汇合处（图1B）。
		<ol>
			<li>使用弯头精细镊子，通过将闭合的镊子插入淋巴结与结肠血管之间的间隙并轻轻张开，钝性分离第二和第三淋巴结站。</li>
			<li>取出镊子，重复此操作2-3次，或直至形成足够安全切除的分离平面。避免损伤主要的结肠血管。同时需特别注意回肠和空肠血管，若受损将造成严重后果。 
			注：若出现明显出血，应立即终止操作，并人道处死动物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可选步骤：为降低邻近淋巴结侧支循环的理论风险，可使用9-0黑色单丝尼龙线和精细镊子沿淋巴结链进行可选的缝扎结扎（通常在第二/第三淋巴结站远端1 mm、两侧各1 mm及近端1 mm处施以单个间断缝合），以推动缝针（补充图3B、C）。
		<ol>
			<li>注意位于回肠/空肠血管束浅表的传入淋巴管（补充图3B）。缝扎时应确保结扎线位于淋巴管深部、主要血管结构浅部，避免损伤回肠/空肠血管束，否则将造成严重后果。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>轻柔地将结扎的淋巴结站向头侧牵拉，使用精细或超精细剪刀从尾侧向头侧方向切除目标淋巴结站。 
		注：在继续操作前，确保小肠保持粉红色且灌注良好。意外结扎回肠/空肠血管将导致小肠缺血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第四淋巴结站（远端结肠引流；补充图1E、F'）
	<ol>
		<li>轻柔地将整个小肠完全取出，直至达到后方固定点（屈氏韧带）。将暴露的肠管置于湿润的敷料上，盲肠朝下，近端结肠朝上，小肠朝向术者右侧（动物左侧；图1A）。</li>
		<li>辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。第四站位于远端结肠内侧、第三站外侧（图1B、图4A）。
		<ol>
			<li>使用弯头精细镊子或超精细剪刀，通过将闭合的镊子或剪刀插入淋巴结与结肠血管及周围脂肪组织之间的间隙并轻轻张开，钝性分离第四淋巴结站。</li>
			<li>取出镊子或剪刀，重复此操作2-3次，或直至形成足够安全切除的分离平面。避免损伤主要的结肠血管。 
			注：若出现明显出血，应立即终止操作，并人道处死动物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>可选步骤：为降低邻近淋巴结侧支循环的理论风险，可对每个可识别的淋巴结使用9-0黑色单丝尼龙线和精细镊子进行可选的缝扎结扎（通常在每个淋巴结1 mm处施以单个间断缝合），以推动缝针（图4B–D）。</li>
		<li>轻柔地将结扎的淋巴结站向头侧牵拉，使用超精细剪刀从尾侧向头侧方向切除目标淋巴结站（图4D、E）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="手术技术序列、组织操作、缝合位置、带标签的箭头、特写照片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68696/68696fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图3"> 
图4：肠系膜淋巴结清扫术（第四站）的标注静态图像及说明。（A）正确摆放肠道方向，以显露位于远端结肠内侧、第三站外侧的第四站肠系膜淋巴结区域（白色箭头）。（B、C）钝性分离淋巴结区域后，对每个可识别的淋巴结进行缝扎（黑色箭头），需确保包含所有供应该淋巴结的血管（蓝色箭头）。（D）沿先前建立的组织平面切除淋巴结，操作时保持高位贴近淋巴结组织，将缝扎结留于原位（黑色箭头）。（E）完成淋巴结区域切除后（白色箭头），确认止血效果，可见缝扎结（黑色箭头），并观察到淋巴结原所在位置的空腔（虚线箭头）无残留淋巴结组织。比例尺：0.2 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68696/68696fig4v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 完成肠系膜淋巴结清扫术
<ol>
	<li>观察回结肠血管、回肠血管和/或空肠血管的远端分支，以确保血供完整。血流灌注良好的肠段呈鲜亮粉红色，并可见搏动。
	<ol>
		<li>使用棉签将腹腔内容物复位至腹膜腔内。复位前需注意清除肠管上的棉絮、绒毛、手术巾碎片或缝线残留，以免引起额外的手术后炎症反应。</li>
		<li>通过确认肠段保持鲜亮/粉红色（灌注良好）而非暗淡/灰白/紫色（缺血），确保肠管未在其系膜上发生扭转。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在关闭腹腔前，向腹腔内注入1 mL体温的无菌生理盐水，以补充不显性液体丢失/蒸发。使用6-0单丝聚丙烯缝线连续缝合，分两层（腹壁和皮肤）关闭腹腔。</li>
	<li>在伤口处涂抹无菌外科胶。
	 
	注：也可使用间断缝合或伤口夹闭器进行皮肤缝合。</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>将动物转移到一个清洁的笼子中，笼子一半置于循环温水垫上，一半置于其外，并可自由获取食物和水。</li>
	<li>让动物从麻醉中恢复，并密切监测其是否出现痛苦迹象。若动物未能及时从麻醉中恢复并表现出正常行为（如呼吸频率增加、自主翻身、行走、理毛等），应实施人道安乐死。</li>
	<li>当所有动物均从麻醉中恢复后，将笼子送回动物饲养设施，提供自由获取的水、食物、垫料和环境丰富材料 ad libium。</li>
	<li>术后每12小时对小鼠进行一次评估，持续3天，观察疼痛或痛苦迹象（如弓背姿势、活动减少、互动减少、理毛不良等）。对表现出痛苦迹象的小鼠实施人道安乐死。</li>
	<li>若使用永久性缝线（如6-0单丝聚丙烯缝线），应在术后第10天检查切口，并移除任何残留的缝线材料。</li>
</ol>
6. 淋巴结处理
<ol>
	<li>将切除的组织立即放入含有 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）的 1.5 mL 微量离心管中，进行浮力测试。通过观察组织在 PBS 中的沉降情况确认是否为淋巴结：淋巴结会下沉，而意外切除的脂肪组织则会上浮（图 5A）。 
	注意：切除的淋巴结区域可立即用于后续下游处理。</li>
	<li>如需进行活细胞实验，将切除的淋巴结区域置于细胞培养基（如 DMEM、RPMI）或 PBS 中，并置于冰上保存。如计划进行组织学分析，则将切除的淋巴结区域放入固定液（如 10% 中性缓冲甲醛、4% 多聚甲醛）中。</li>
</ol>

<ol><li>Chopp, L., Redmond, C., O'shea, J. J., Schwartz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+thymus+to+tissues+and+tumor%3A+A+review+of+T+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">From thymus to tissues and tumor: A review of T cell biology.</a> J Allergy Clin Immunol. 151 (1), 81-97 (2023).</li>
<li>Rouiz-Argüelles, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRouiz-Arg%C3%BCelles%2C+A+%22Autoimmunity%3A+From+bench+to+bedside%22">Autoimmunity: From bench to bedside</a>. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).</li>
<li>Crespo, J., Sun, H., Welling, T. H., Tian, Z., Zou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+anergy%2C+exhaustion%2C+senescence%2C+and+stemness+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell anergy, exhaustion, senescence, and stemness in the tumor microenvironment.</a> Curr Opin Immunol. 25 (2), 214-221 (2013).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).</li>
<li>Divi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+count+from+neck+dissection+predicts+mortality+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymph node count from neck dissection predicts mortality in head and neck cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (32), 3892-3897 (2016).</li>
<li>Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+evaluation+and+survival+after+curative+resection+of+colon+cancer%3A+Systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22JNCI%22%5BJournal%5D)">Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: Systematic review.</a> JNCI. 99 (6), 433-441 (2007).</li>
<li>Simoes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+yield+in+the+pathological+staging+of+resected+nonmetastatic+colon+cancer%3A+The+more+the+better%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymph node yield in the pathological staging of resected nonmetastatic colon cancer: The more the better.</a> Surg Oncol. 43, 101806(2022).</li>
<li>Resio, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commission+on+cancer+standards+for+lymph+node+sampling+and+oncologic+outcomes+after+lung+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Commission on cancer standards for lymph node sampling and oncologic outcomes after lung resection.</a> Ann Thorac Surg. 119 (2), 308-315 (2025).</li>
<li>Connolly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reservoir+of+stem-like+CD8+T+cells+in+the+tumor-draining+lymph+node+preserves+the+ongoing+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A reservoir of stem-like CD8 T cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response.</a> Sci Immunol. 6 (64), eabg7836(2021).</li>
<li>Saddawi-Konefka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic-preserving+treatment+sequencing+with+immune+checkpoint+inhibition+unleashes+cdc1-dependent+antitumor+immunity+in+HNSCC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lymphatic-preserving treatment sequencing with immune checkpoint inhibition unleashes cdc1-dependent antitumor immunity in HNSCC.</a> Nat Commun. 13, 4298(2022).</li>
<li>Saddawi-Konefka, R., Schokrpur, S., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let+it+be%3A+Preserving+tumor-draining+lymph+nodes+in+the+era+of+immuno-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Let it be: Preserving tumor-draining lymph nodes in the era of immuno-oncology.</a> Cancer Cell. 42 (6), 930-933 (2024).</li>
<li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Pinschewer, D., Chiba, K., Feng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fty720%3A+A+novel+transplantation+drug+that+modulates+lymphocyte+traffic+rather+than+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Fty720: A novel transplantation drug that modulates lymphocyte traffic rather than activation.</a> Trends Pharmacol Sci. 21 (2), 49-52 (2000).</li>
<li>Mehandru, S., Colombel, J. -F., Juarez, J., Bugni, J., Lindsay, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+molecular+mechanisms+of+anti-trafficking+therapies+and+their+clinical+relevance+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Understanding the molecular mechanisms of anti-trafficking therapies and their clinical relevance in inflammatory bowel disease.</a> Mucosal Immunol. 16 (6), 859-870 (2023).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lymph+nodes+in+lymphotoxin-alpha+%28lt+alpha%29-deficient+mice+is+due+to+abnormal+organ+development%2C+not+defective+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflam%22%5BJournal%5D)">Absence of lymph nodes in lymphotoxin-alpha (lt alpha)-deficient mice is due to abnormal organ development, not defective lymphocyte migration.</a> J Inflam. 45 (1), 72-78 (1995).</li>
<li>Kwon, S., Agollah, G. D., Wu, G., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+changes+of+lymphatic+contractility+and+drainage+patterns+following+lymphadenectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal changes of lymphatic contractility and drainage patterns following lymphadenectomy in mice.</a> PLoS One. 9 (8), e106034(2014).</li>
<li>Blum, K. S., Proulx, S. T., Luciani, P., Leroux, J. -C., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+lymphatic+regeneration+and+flow+patterns+after+lymph+node+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Dynamics of lymphatic regeneration and flow patterns after lymph node dissection.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (1), 81-86 (2013).</li>
<li>Shaikh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+lymph+node+transplantation+in+mice+to+study+immune+responses+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenteric lymph node transplantation in mice to study immune responses of the gastrointestinal tract.</a> Front Immunol. 12, 689896(2021).</li>
</ol>

R.A.F. 是葛兰素史克、Plythera 公司和 Ventus 治疗公司（Ventus Therapeutics）的顾问。其余所有作者声明无竞争利益。

本文描述了一种可在四个淋巴结站位分别进行的安全且耐受性良好的小鼠生存状态下肠系膜淋巴结切除术。该手术的主要局限性在于，淋巴结沿肠系膜链的分布与术中暴露的直接可视性之间存在间接关系。第一站淋巴结可完全直接暴露，操作简便。第二站淋巴结通常可见，但其暴露程度取决于手术视野的拓展情况。nd 至 4th 可通过向头侧延长皮肤/腹壁切口来改善手术入路。然而，由于远端结肠存在后方附着结构，通过该切口进一步暴露远端结肠最远端及直肠的范围有限，且存在损伤深部结构的风险。
另一个重要的局限性是假传入支和/或侧支淋巴管的形成。已有研究表明，在腘窝淋巴引流区，侧支淋巴管可能在手术切除后2-7天内即开始形成，并在2-3周内获得功能性收缩能力16,17。尽管目前尚不清楚肠系膜淋巴结引流区是否也遵循这种早期功能性侧支形成的模式，但已知移植的肠系膜淋巴结至少在术后5周时已与受体的淋巴系统建立吻合，实现功能性引流18</...

T细胞是适应性免疫中主要的效应细胞类型之一，在多种疾病类别中均具有重要作用，包括感染、自身免疫和恶性肿瘤1,2,3。T细胞发挥功能的关键步骤是由次级淋巴器官（如局部淋巴结）中的抗原呈递细胞对其进行三阶段的启动4。在现代医学中，对多个器官系统实施规范的肿瘤根治性切除通常包括一定程度的局部取样或整块淋巴结切除5,6,7,8。例如，在结肠癌治疗中，共识指南建议在根治性切除术中应切除并检查至少12个淋巴结，因为这与改善的长期生存率存在明确的相关性6,7。然而，局部淋巴结是否真的可以毫无代价地被切除？近期在小鼠中的研究表明，肿瘤引流淋巴结中含有抗肿瘤T细胞前体的储备库，这些前体可能避免了在肿瘤微环境中发生的终末分化和T细胞耗竭9,10,11。这表明，切除如此关键的细胞群体可能会削弱正在进行的免疫监视能力。
已知小鼠肠道淋巴引流模式在肠系膜淋巴结链上具有高度特异性；例如，近端结肠几乎完全由第一淋巴结站引流，小肠由第二/第三站引流，远端结肠主要由第四淋巴结站引流12（图1，补充图1）。因此，通过靶向消融这些淋巴结，可中断肠道各节段与淋巴系统之间的直接通讯。为阻断淋巴结与组织之间的细胞迁移，通常使用S1P受体激动剂（如FTY720）或整合素阻断剂；然而，这些药物广泛抑制细胞迁移，因而无法用于研究特定淋巴结的独立作用13,14。然而，由于缺乏针对每个淋巴结站的详细描述的手术切除方法，科学界在研究肠道淋巴结内免疫相互作用的局部效应方面受到限制。鉴于这一空白，本文建立并描述了一种针对小鼠各淋巴结站的肠系膜淋巴结切除存活手术。该手术的总体目标是在小鼠中安全、可靠地切除肠系膜淋巴结站（或多个站），并实现较高的术后存活率和良好的耐受性。
该操作已在多种品系的幼年和成年小鼠（例如 Balb/c、C57BL/6J、129S4）中经过测试，并易于实施，但其应用受限于需要具备可及且易于识别的淋巴结。因此，该方法可能不适用于淋巴结较正常小鼠更小或难以察觉的小鼠模型或基因型（例如淋巴毒素-α缺陷小鼠）15。此外，较年长的小鼠（&gt;15 周）通常具有更多的内脏脂肪，使得淋巴结的识别与分离更加困难；尽管这并非绝对禁忌，但可能会影响操作的成功率或限制其实现。除上述限制外，肠系膜淋巴结切除术可实现对淋巴结的高度可控且高度选择性的干预。该方法最适合用于探究淋巴结及其相关的常驻免疫细胞与肠道各节段（例如近端结肠、远端结肠、小肠）之间局部相互作用的相关科学问题。
<img alt="Mouse intestinal anatomy, segmented microscopic image showing intestinal vessels and labeled sections." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68696/68696fig1.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="Figure 1"> 
图尿素 1: 解剖学标志物在各站点的位置 的 肠系膜淋巴结链. (A未标记的和（B四个主要肠系膜淋巴结站的标记示意图 原位近端结肠的引流主要为 通过 1号区域主要为近端结肠，小肠主要位于2/3号区域，远端结肠主要位于4号区域。（DC=远端结肠，ICV=回结肠血管，PC=近端结肠，CEC=盲肠，IV/JV=回肠血管/空肠血管，SI=小肠）。比例尺：1.5 cm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68696/68696fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>麻醉回路</td><td>任何</td><td></td><td>或可注射麻醉剂</td></tr><tr><td>BD LSRII 流式细胞仪（或同等设备）</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>配备 FACS Diva 软件（用于流式细胞术）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>长效丁丙诺啡</td><td>任何</td><td></td><td>用于镇痛</td></tr><tr><td>细胞培养基&amp;nbsp;</td><td>任何</td><td></td><td>（用于活细胞技术；例如 DMEM 或 RPMI）</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td>工作浓度：15 ug/mL</td></tr><tr><td>乙醇（70% 水溶液）</td><td>任何</td><td></td><td>用于清洗</td></tr><tr><td>FITC标记的抗小鼠CD45.2（104）</td><td>Biolegend</td><td>109806</td><td>工作浓度：5 ug/mL</td></tr><tr><td>镊子：弯头精细尖头镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>材料：Dumoxel；型号 #5，45 度角；尖端尺寸 0.1 × 0.06 mm</td></tr><tr><td>镊子：尖头镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-4960</td><td>材料：Dumostar；型号 #1；尖端尺寸：0.20 × 0.12 mm</td></tr><tr><td>镊子：尖头镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-4966</td><td>材料：Dumostar，生物尖头；型号 #3；尖端尺寸：0.08 × 0.04 mm</td></tr><tr><td>利多卡因</td><td>任何</td><td></td><td>用于镇痛</td></tr><tr><td>金属灌胃针</td><td>任何</td><td></td><td>20/22 号可重复使用直型口服灌胃针，不锈钢材质。</td></tr><tr><td>持针器</td><td>Roboz</td><td>RS-6410</td><td>Castroviejo持针器；直型</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;可选：&lt;/em&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 双颈/双臂显微镜LED灯</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;可选：&lt;/em&gt; 伊文思蓝染料</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>用于可选的淋巴示踪。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;可选：&lt;/em&gt; 手术显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ9.5</td><td>Leica Mz9.5 体视显微镜</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>任何</td><td></td><td>用于皮肤准备/消毒</td></tr><tr><td>剪刀：超细尖头剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>McPherson-Vannas；3 mm 切割刃；弯型 &lt;em&gt;（适用于3/4号位点）&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>剪刀：尖头剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5650SC</td><td>Surecut Castroviejo 剪刀 &lt;em&gt;（适用于1/2/3号节点）&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>剪刀：中号剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td>诺伊斯；13毫米切割刃；直型</td></tr><tr><td>手术胶</td><td>任何</td><td></td><td>3M Vetbond 组织粘合剂</td></tr><tr><td>缝线：6-0 蓝色单丝聚丙烯</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr><tr><td>缝线：9-0黑色单丝尼龙缝线</td><td>任何</td><td></td><td>（可选）也可使用稍大的8-0规格缝线。</td></tr><tr><td>组织固定剂</td><td>任何</td><td></td><td>（用于计划进行组织学检测；例如，10%中性缓冲甲醛或4%多聚甲醛）</td></tr><tr><td>温水循环加热垫</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肠系膜淋巴结切除术以选择性阻断特定区域肠道的淋巴通路

Murine Mesenteric Lymphadenectomy for Selective Disruption of Lymphatic Communication with Region-Specific Gut

免疫监视与抗原耐受在肠道微环境中处于精细的平衡状态，其中循环T细胞在局部淋巴结中的启动作用已被广泛认知。在T细胞启动之后，近期文献开始揭示一类定居于器官引流淋巴结中的非循环T细胞具有独特且不可替代的功能。这一现象在肠道中可能尤为显著，因为肠道的淋巴引流具有高度特异性。然而，为了真正理解这些局部T细胞的独特作用与全身性功能冗余之间的差异，科学界亟需一种描述清晰的方法，以分离并选择性干扰这些淋巴结。本文介绍了一种可在肠系膜淋巴结链上四个不同部位安全实施、耐受性良好的小鼠肠系膜淋巴结切除存活手术。该手术方法可灵活调整，以选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠的淋巴引流通路。文中提供了详细的步骤说明、可视化辅助图示、提高手术成功率的实用技巧，以及针对术后存活不佳情况的故障排除方案。如需进一步下游分析，切除的淋巴结可立即用于后续处理。该技术最适合需要选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠淋巴引流的研究应用。

为验证该操作的准确性，对11只年龄、性别和基因型匹配的4至6周龄C57BL/6J品系同窝小鼠进行了肠系膜淋巴结切除术。每只小鼠的操作时间在5至15分钟之间。所有小鼠均耐受良好，围手术期存活率为100%。切除的样本立即置于冰上PBS中。所有样本均迅速沉降，表明脂肪含量较低。将切除的样本（以及另外4个独立的内脏脂肪对照样本）通过100 µm细胞筛网研磨，并用PBS洗涤。细胞悬液在4°C下以450 × g离心5分钟，随后在冰上用100 µL PBS孵育60分钟，加入以下抗体及浓度：FITC标记的抗小鼠CD45.2（104）小鼠单克隆抗体（1:100；5 μg/mL）以及用于检测活率的DAPI（1:100；15 μg/mL）。细胞用PBS洗涤后，在4°C下以450 × g离心5分钟，并在冰上用1%多聚甲醛固定20分钟。最后再用PBS洗涤一次，4°C下以450 × g离心5分钟，重悬于PBS中。
流式细胞术在耶鲁大学流式细胞术中心完成。使用本方案成功提取淋巴结的结果在11/11个样本中得到验证，CD45+活细胞比例均达到或超过80%，相比...

本方案描述了一种可存活的小鼠肠系膜淋巴结清扫术，该手术安全且耐受性良好，可沿肠系膜淋巴结链的四个站点分别进行。本方案具有可调整性，可用于选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠的淋巴通路。

免疫监视与抗原耐受在肠道微环境中处于精妙的平衡状态，其中循环T细胞发挥着关键作用……

我们的研究重点是T细胞对新抗原和外周组织的应答，而这些应答在很大程度上受到启动过程的影响，因此我们主要关注这些启动事件发生的位置。目前，用于阻断淋巴结与组织之间迁移的唯一广泛应用的方法是系统性干预手段，例如S1P受体激动剂和整合素阻断。但这种广泛的抑制使我们无法研究特定局部淋巴结的贡献。本方案详细描述了在四个主要肠系膜淋巴结区域进行高选择性淋巴结切除术的操作步骤。由于这些淋巴结对其引流的肠道节段具有高度特异性，因此这种耐受性良好的存活手术可实现对肠道淋巴轴特定节段的破坏，同时保留其余部分完整。通过夹捏后肢足部确认麻醉深度适当后，使用无菌手术剪在麻醉小鼠腹部正中做一长度为0.5至1厘米的皮肤切口。用无菌镊子将皮肤与腹壁分离，暴露并识别腹白线。然后通过腹白线再做一个0.5至1厘米的切口，以进入腹膜腔。使用钝头灌胃针，向腹膜腔内注入1毫升体温的无菌生理盐水。润湿无菌敷料，为肠管定位做准备。为了切除第一站淋巴结，将外置的肠管置于湿润的敷料上，使盲肠位于下方，近端结肠位于上方，回肠末端朝向术者。辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。使用有角度的精细镊子，将闭合的镊子插入结肠系膜淋巴结链与回结肠血管之间，轻轻张开镊子，钝性分离第一站淋巴结与回结肠血管。为降低邻近淋巴结发生副损伤血流的理论风险，可使用单丝尼龙缝线和尖头镊子，在第一淋巴结站近端1毫米和远端1毫米处，沿淋巴结链进行可选的缝扎结扎，采用间断单缝法。轻柔地向尾侧牵拉该淋巴结站，然后使用精细剪刀，从头侧向尾侧方向切除目标淋巴结站。观察回结肠血管、回肠血管和空肠血管的远端分支，以确认血供保持完整。为了切除第二淋巴结站，轻柔地将小肠还纳，并将外置的肠管置于湿润的敷料上，使盲肠位于下方，近端结肠位于上方，小肠朝向术者的右侧。接着，辨认沿结肠纵向走行的第二淋巴结站，其起始于回肠与空肠血管的汇合处。使用有角度的精细镊子，钝性分离第二淋巴结站与结肠血管。为降低邻近淋巴结发生侧支血流的理论风险，可使用单丝尼龙缝线和尖头镊子，在第二淋巴结站近端1毫米和远端1毫米处，沿淋巴结链进行可选的缝扎结扎，采用单个间断缝合。轻柔地向尾侧牵拉第二淋巴结站，然后使用精细剪刀，从头侧向尾侧方向切除该淋巴结站。检查手术区域，确保止血完全。为了切除第四组淋巴结，轻柔地将整个小肠游离至后方固定点。将肠管置于湿润的敷料上，使盲肠朝下，近端结肠朝上，小肠朝向术者右侧。找到位于降结肠内侧、第三组淋巴结外侧的第四组淋巴结站。使用斜角精细镊子或超细尖剪刀，钝性分离第四组淋巴结，使其远离肠系膜血管及周围脂肪组织。为降低邻近淋巴结之间潜在的侧支血流风险，可选择性地对每个可识别的淋巴结进行缝扎结扎，通常在距离淋巴结约1毫米处使用单股尼龙缝线和精细镊子进行间断缝合。然后轻柔地将第四组淋巴结向头侧牵拉。使用精细或超细尖头剪刀，从尾侧向头侧方向切除淋巴结站。对第四淋巴结站中的第二个淋巴结重复此操作。仔细分离该淋巴结，必要时进行缝线结扎，并将其切除。检查手术区域以确认止血完全。将腹腔内容物还纳至腹膜腔后，向腹腔内注入1毫升体温的无菌生理盐水，以补偿蒸发导致的液体丢失。分两层关闭腹腔：首先缝合腹壁，然后使用6-0单丝聚丙烯缝线连续缝合皮肤。通过肠系膜淋巴结切除术提取的组织样本 consistently 表现出较低的脂肪含量，这可通过在 PBS 中迅速下沉得到证实。流式细胞术分析证实了肠系膜淋巴结的成功提取，来源于肠系膜淋巴结切除术的样本中超过 95% 的细胞被鉴定为 CD45 阳性，而内脏脂肪组织对照组中仅有 7% 的细胞为 CD45 阳性。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

针对区域特定肠道淋巴管通讯选择性中断的小鼠肠系膜淋巴腺切除术

为了在同一只小鼠体内随时间追踪免疫反应的进程，可以通过手术依次切除淋巴结。本文将描述如何实施该技术。...

小鼠浅表淋巴结手术

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大鼠模型中肠系膜淋巴管插管采集淋巴液

本文介绍一种在大鼠中对肠系膜淋巴管进行插管的技术，该技术可实现对经肠道给药后通过淋巴系统转运的脂质和药物进行定量分析。该技术可进一步用于评估肠系膜淋巴液中液体、免疫细胞、肽类、蛋白质以及亲脂性分子的浓度和/或转运情况。...

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新生猪肠道淋巴干的长期插管及淋巴液采集

本文介绍一种用于猕猴肝脏和肠系膜淋巴结（MLN）系列取样的微创腹腔镜技术，该方法可提高取样频率，并与开腹手术相比降低手术并发症的风险。...

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介绍了一种通过手术缝合输入淋巴管以阻断淋巴液流动的实验方案。...

通过缝合小鼠传入淋巴管阻断淋巴流

本实验方案详细描述了一种用于分离小鼠十二指肠内营养物质灌注后流动的肠淋巴液的外科手术方法。该方法可用于生理条件下测定总肠道脂质吸收以及乳糜微粒的合成与分泌情况，以响应不同实验性营养物质的刺激。...

小鼠肠系膜引流淋巴液的分离与定量 在体 内 膳食脂质吸收与乳糜微粒分泌的动力学

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小肠和大肠系膜D3区域中结肠和小肠动脉淋巴管束解剖分离的作用

本方案描述了一种安全且耐受性良好的小鼠双侧肾淋巴结切除术的存活手术操作。...

小鼠双侧肾淋巴结切除术

腹腔镜手术广泛应用于右侧结肠癌的治疗，具有多种优势。本文描述了一种尾侧至头侧的手术入路，结合完全结肠系膜切除（CME）和D3淋巴结清扫术，该方法可能降低手术技术难度，且似乎是一种安全的手术方式。...

腹腔镜右半结肠切除术中采用尾侧向头侧入路行完整结肠系膜切除及D3淋巴结清扫

了解小鼠肠系膜淋巴结切除术，用于选择性中断特定肠道节段的淋巴引流。该方法支持研究局部淋巴结在肠道免疫调节中的独特作用，并可获得高纯度CD45+细胞样本用于下游分析。

小鼠肠系膜淋巴结切除术以选择性阻断特定区域肠道的淋巴通路

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