Name: 非侵入性气管内脂多糖给药以诱发啮齿动物急性肺损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: 了解利用喉镜对大鼠进行非侵入性气管内脂多糖给药以诱发急性肺损伤的方法。该技术可精确递送药物，支持重复给药，为研究肺损伤修复机制和开发靶向治疗提供可靠的动物模型。

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通讯作者 SR 感谢印度政府生物技术部 Ramalingaswami 资深研究员项目（编号：BT/RLF/Re-entry/13/2019）提供的经费支持。作者们感谢 Govind Yadav 博士、Ramajayan Pandian 博士以及 CSIR-IIIM 动物房工作人员给予的支持。

所有动物的护理和使用均遵循机构和CPCSEA指南。手术后持续监测动物，以确保其健康状况，并符合查谟CSIR-印度整合医学研究所机构动物伦理委员会（IAEC）批准号468/87/8/2025下的动物伦理指南。本方案概述了采用直接可视化递送方法进行脂多糖（LPS）非侵入性气管内滴注的技术，该方法此前已有报道，本研究中引入了一些方法学上的改进26,27,28。该技术经过优化，可实现对急性肺损伤（ALI）的可控且一致的诱导，确保实验结果的可靠性，同时维持高标准的动物护理。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 麻醉与脂多糖制备
<ol>
	<li>动物体重测量与LPS剂量计算
	<ol>
		<li>使用校准的天平称量每只动物，以计算精确的LPS剂量。选择体重在140–160 g之间的Wistar大鼠用于研究。</li>
		<li>通过稀释冻干的LPS制备LPS溶液 大肠杆菌 在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中配制LPS，以达到所需浓度。新鲜配制的LPS溶液（5 µg/g 体重）29,30&#160;被使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉诱导与关键时间点
	<ol>
		<li>麻醉动物 通过 使用1 mL注射器腹腔注射新鲜配制的氯胺酮-赛拉嗪混合溶液（氯胺酮：75 mg/kg，赛拉嗪：10 mg/kg）。注射后，静置动物约2–5分钟，待麻醉起效，期间避免干扰动物。</li>
		<li>通过确认动物无自发性运动且足趾夹捏反射呈阴性，以验证麻醉效果充分。给予LPS 通过 在麻醉诱导后5-8分钟进行气管内灌注。在实验结束当天，于麻醉诱导后4-7分钟进行气管切开术和胸腔切开术。 
		注意：适当的麻醉深度对于成功进行气管内滴注至关重要。麻醉过深可能抑制咽反射，而麻醉不足则可能导致动物在操作过程中出现不适或移动。应使用新鲜配制的脂多糖（LPS）以确保实验间的一致性。操作期间及操作后需密切监测动物状态，以保障其福利。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 气管内滴注LPS
<ol>
	<li>麻醉充分性评估：给予麻醉混合剂后，使用镊子或手指对足趾施加有力的夹捏，以评估麻醉深度。若动物出现反应，则需要加深麻醉。确认动物处于麻醉状态后，开始进行滴注操作。将大鼠&#160;置于半卧位，用门齿悬挂在坚固的支撑平台上。</li>
	<li>气管可视化：打开麻醉动物的口腔，用镊子轻轻夹住舌头，小心插入喉镜，并精确对齐，以获得气管开口的最佳视野。确保光源正确指向，照亮喉部区域，以便无障碍操作。</li>
	<li>舌头操作：使用弯曲的钝头镊子轻柔夹住舌头，并向上外侧方向轻轻牵拉。 
	注意：使用手持放大镜以增强喉部解剖结构的清晰度，并确保滴注装置精确对齐，提高操作准确性。</li>
	<li>LPS给药：将100 µL LPS溶液吸入注射器，连接至16 G大鼠气管插管；将LPS溶液滴注至气管开口附近。滴注后立即使用钝头镊子轻轻夹闭鼻孔2–4秒，以促进LPS溶液经气管吸入肺部。使用带光源的喉镜持续监测给药过程，确认给药准确且完全。</li>
	<li>术后监测：成功给予LPS后，小心将舌头复位至正常解剖位置。将动物转移至笼中，并密切观察至少1分钟，注意是否有呼吸障碍或呛咳等异常表现。</li>
	<li>关键注意事项
	<ol>
		<li>视觉清晰度：确保喉镜精确对齐，以实现准确的LPS递送。使用放大工具以提高精确性和操作效果。</li>
		<li>小心夹持舌头，并将其固定于下颌或口腔边缘，以保持稳定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样本采集
<ol>
	<li>按照先前研究中所述方法进行支气管肺泡灌洗（BAL），并稍作修改31,32,33。气管切开后，将 2 mL 冷 PBS 轻柔注入肺部，随后回收灌洗液。</li>
	<li>将收集的灌洗液在 4 °C 条件下以 5000 x g 离心 5 分钟，取上清液用于炎症标志物检测。收集肺组织用于组织病理学检查，或进行匀浆以检测髓过氧化物酶（MPO）活性。在样品收集过程中始终将样品置于冰上，以保持样品完整性。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

经气管滴注法提供了一种非侵入性、可重复且靶向性强的肺部给药途径，可有效避免外科手术干预的需要。该方法显著降低了与手术创伤相关的风险，例如组织损伤，同时还能减少术后感染以及侵入性操作可能引起的非预期器官损伤。通过将药物直接递送至肺部，经气管途径可实现精确的局部治疗，在维持良好安全性的同时增强治疗效果。因此，在实验模型中，该方法相较于侵入性的气管内滴注等技术更具优势且更为可靠。
在本研究中，通过气管插管以无创方式将脂多糖（LPS，5 µg/g 体重）递送至肺部，从而在肺叶中引发显著的炎症反应，建立了一种可靠的急性肺损伤（ALI）模型。大鼠使用氯胺酮-赛拉嗪混合物进行麻醉。借助带有光源的喉镜，通过大鼠气管插管经气管将LPS递送至肺部。via 支气管肺泡灌洗（BAL）在LPS给药后24小时和120小时对这些动物进行。收集的BAL液体被用于分析白细胞介素-1β（IL-1β）——一种参与炎症级联反应的关键促炎性细胞因子；髓过氧化物酶（MPO）——中性粒细胞浸润的标志物，以及总蛋白水平，以评估ALI的严重程度。在LPS给药后24小时，IL-1β水平、MPO活性及总蛋白水平均显著...

急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的炎性病症，其特征为动脉低氧血症、肺水肿、内皮-上皮屏障完整性受损，以及大量免疫细胞浸润肺组织1。ALI 的病理生理机制复杂，涉及凝血、组织损伤以及肺部和全身性炎症等多种相互重叠和相互作用通路的协同与紊乱。及时抑制这种炎症反应对于恢复组织稳态至关重要。若未及时治疗，这种快速进展的疾病常会恶化为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），后者是一种以难治性低氧血症为特征的更严重状态。ALI 的发病机制与肺损伤以及肺泡上皮细胞和微血管内皮细胞的损伤或死亡密切相关1,2,3,4。
导致急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的病因包括多种感染性和非感染性因素，可源自对肺部的直接或间接损伤5。直接原因包括肺炎6、近乎溺水7、胃内容物误吸8、有毒物质吸入（如氯气）9、细菌感染10,以及病毒感染（如SARS-CoV-2）11,12,13,14。间接原因则来自对肺部产生继发性影响的全身性病理过程，包括脓毒症15、创伤16、胰腺炎17、药物过量以及输血18。
本方法的主要目标是通过气管内给予内毒素，建立一种可重复且非侵入性的啮齿类动物急性肺损伤（ALI）模型。via 开发该技术的依据源于传统给药方法的局限性。该技术旨在实现向肺泡的精确直接递送，最大限度减少全身暴露，并&#160;使其成为未来靶向肺部治疗的一种有前景的方法。鼻内滴注存在多种挑战，其中一些可能显著影响研究结果，例如对深部肺区的靶向性差以及动物间呼吸差异19。其他因素，如给药体积有限和潜在的鼻腔刺激，重要性较低，但仍可能影响实验一致性。相比之下，气管内给药可更准确、直接地将药物递送至下呼吸道，确保更好的肺部靶向性和剂量均一性，动物间变异最小，使该途径在肺部暴露研究中更为有效和可靠20。吸入途径由于其非侵入性，在临床上具有相关性，但在临床前研究中也存在某些局限性，例如上呼吸道药物损失以及对远端肺区靶向效率降低。这些局限性在严重疾病模型中更为突出，包括二次打击损伤模型或涉及基因敲入或敲除小鼠的遗传修饰模型。相比之下，气管内给药在复杂临床前模型中也能实现更一致的直接药物递送至下呼吸道，减少药物损失，并实现有效靶向21。临床前研究中另一种相关的给药途径是侵入性气管内递送。尽管该方法有效，但存在手术应激、感染风险、检测结果变异以及需要维持体温等局限性22。相比之下，气管内方法提供了一种可靠的非侵入性替代方案，特别适用于需要在较长观察期内进行多次评估的研究。
该方法可应用于急性肺损伤（ALI）以外的动物模型，包括哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺炎及感染性肺部疾病。它在过敏性反应、心脏骤停和心律失常等临床前研究领域也具有相关性。值得注意的是，经气管给药方法在临床实践中已用于某些药物的给药，具体取决于病情的紧急程度和临床情况23,24,25。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;Prism 8</td><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂&amp;nbsp;</td><td>印度Himedia公司</td><td>ML106-500 ML&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>印度Himedia公司&amp;nbsp;</td><td>RM525-25G</td><td></td></tr><tr><td>伊红&amp;nbsp;</td><td>印度 Loba Chemie</td><td>3660</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Loba Chemie，印度</td><td>6381926</td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td></td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich，美国&amp;nbsp;</td><td>HT501320</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>SDFCL</td><td>74108G05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>印度Himedia</td><td>MB016</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>阿夫拉，印度</td><td>7722841</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮&amp;nbsp;</td><td>印度 Neon Laboratories Ltd</td><td>-&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>喉镜</td><td>中国医疗资源有限公司&amp;nbsp;</td><td>MS-LA500FV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌O55:B5脂多糖&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>L2880&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>邻联二茴香胺二盐酸盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>D3252-5G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen，美国</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>印度Himedia</td><td>IN26185530500</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>大鼠IL-1&amp;beta; ELISA试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技，美国</td><td>BMS630</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>印度Himedia公司</td><td>TC046M</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>印度 Himedia</td><td>GRM7502</td><td></td></tr><tr><td>原钒酸钠</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>默克，美国</td><td>MA3M722243</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher，美国</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪&amp;nbsp;</td><td>印度免疫学有限公司，印度</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

Non-Invasive Endotracheal Administration of Lipopolysaccharide to Induce Acute Lung Injury in Rodents

急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的炎症性疾病，其特征为动脉低氧血症、肺泡水肿、肺泡上皮-内皮毛细血管屏障完整性受损，并伴随炎性细胞浸润肺组织，常进展为更严重的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），最终常导致急性呼吸衰竭。由脂多糖（LPS）诱导的小鼠ALI模型是研究肺部炎症机制及其治疗策略的重要工具。直接与间接啮齿类动物肺损伤模型各有其优势与局限性，尤其体现在存活率、炎症-消退阶段持续时间、手术创伤及感染风险等方面。本研究采用一种无创经气管灌注技术建立大鼠直接ALI模型。该技术可确保将LPS或待测物质精准递送至肺部 通过 借助基础喉镜经气管插管途径进行操作。该操作首先对大鼠实施麻醉，并将其置于半卧位。随后，将连接大鼠气管插管的注射器置于气管开口附近，注入LPS溶液。在实验结束时，采集肺组织或灌洗样本，以评估炎症参数及肺组织结构。该技术在速度、特异性和可靠性方面优于其他模型，可实现精准靶向给药，组织损伤小，死亡率低，且几乎不引起非靶部位的炎症反应。该方法在急性肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以及过敏性反应或心脏骤停等相关疾病的临床前研究中具有重要价值。相较于其他方法，该技术更易于与活体显微成像等先进影像技术结合，实现对药物分布和疾病进展的实时监测。

通过检测LPS滴注后24小时和120小时的炎症标志物（包括IL-1β水平、MPO活性、总蛋白含量以及组织病理学）对模型进行了验证。研究包含三个实验组：对照组 （未处理）和两组接受LPS滴注的实验组，其中一组在滴注后24小时实施安乐死，另一组在120小时实施安乐死（遵循机构批准的实验方案）。
与对照组相比，LPS暴露组在24小时处死时，IL-1β水平显著升高，同时伴有MPO活性和总蛋白含量的上升（图1A-C）。肺组织病理学显示肺泡结构破坏、肺泡壁肿胀、出血及严重的中性粒细胞浸润（图2），证实LPS滴注后24小时已成功诱导急性肺损伤（ALI）。然而，在LPS滴注后120小时，炎症已基本消退，表现为IL-1β、MPO和总蛋白水平恢复至接近基线水平（图1A-C），肺组织结构也得到修复（<strong class=...

在本研究中，采用一种非侵入性气管内滴注技术，通过基本的喉镜确保将脂多糖（LPS）精确递送至肺部，从而在大鼠中建立急性肺损伤（ALI）模型。LPS被滴注入气管 通过 使用喉镜插入气管插管。在多个时间点评估肺损伤程度。

急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）是一种危及生命的炎症性疾病，其特征为动脉低氧血症、肺泡水肿、肺功能受损……

本研究的目的是开发一种具有临床相关性的非侵入性急性肺损伤模型，以改进临床测试。现代肺生物学研究结合了先进的肺模型、纳米载体和气溶胶技术，以在生理相关模型中优化并研究靶向药物递送。首先，使用校准的天平称量每只动物的体重。通过将冻干的埃希氏大肠杆菌脂多糖溶于无菌磷酸盐缓冲液中，配制所需浓度的脂多糖溶液。将大鼠麻醉后，检查麻醉深度，并将其置于半卧位，门齿悬挂在坚固的支撑平台上。随后打开麻醉动物的口腔。使用弯头钝端镊子轻轻夹住舌头，并将其向上和向外牵拉。然后小心插入喉镜，精确调整位置，以获得气管开口的最佳视野。接着，用注射器吸取 100 µL 脂多糖溶液，并将其连接到 16 号大鼠气管插管上。在气管开口附近给予脂多糖溶液。滴注后立即使用钝头镊子轻轻闭合鼻孔 2 至 4 秒，以促进溶液经气管吸入肺部。随后，在脂多糖给药完成后，小心将舌头复位至其正常的解剖位置。将动物放回笼中，并密切观察至少一分钟，注意是否有呼吸困难或窒息的迹象。在进行支气管肺泡灌洗和气管切开术后，向肺部缓慢注入2毫升冷PBS，然后小心回收液体。将收集的灌洗液在4°C条件下以5,000 G离心5分钟。使用上清液检测炎症标志物。收集肺组织进行组织病理学检查，或将其匀浆以检测髓过氧化物酶活性。与对照组相比，在脂多糖注入后24小时处死的小鼠组中，白细胞介素-1β水平显著升高，髓过氧化物酶活性增加，总蛋白含量也更高。脂多糖处理后120小时，白细胞介素-1β、髓过氧化物酶活性及总蛋白水平已恢复至接近基线值。脂多糖处理后24小时的肺组织病理学显示肺泡结构解体、肺泡壁肿胀、溶血以及严重的中性粒细胞浸润。脂多糖处理后120小时，肺组织结构得到恢复。通过非侵入性经气管肺部给药，我们建立了可自我限制的急性肺损伤模型，用于测试靶向治疗药物并研究肺组织修复过程。该方法的关键优势在于其精确且无创的给药方式，可在同一动物体内实现重复给药，并可根据特定研究目标进行定制化操作。未来急性肺损伤的研究将聚焦于开发靶向疗法以及深入理解肺损伤与修复机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

非侵入性气管内脂多糖给药以诱发啮齿动物急性肺损伤

一种用于研究急性肺损伤的呼吸机诱导肺损伤小鼠模型 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位...

压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

来源：Radulovic, K., et al. 向小鼠注射脂多糖以模拟肠道屏障受损后微生物来源产物的进入。 J. Vis. Exp.

小鼠腹腔注射细菌脂多糖以研究全身免疫反应

来源：Yuan, Z., et al. 脂多糖诱导的脓毒症肺损伤中的支气管肺泡灌洗外泌体。 J. Vis. Exp.

小鼠脂多糖诱导急性肺损伤用于外泌体与免疫分析

宿主对病原体感染的免疫反应是一个受到严密调控的过程。利用小鼠脂多糖肺暴露模型，可对与疾病发病机制相关的复杂机制进行高分辨率评估。...

利用经口咽气管内给予PAMP及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

我们介绍了一种通过雾化吸入脂多糖激发中性粒细胞性肺部炎症以模拟急性肺损伤的方法。此外，还描述了肺隔离、气管插管和支气管肺泡灌洗的基本外科技术。...

使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

本方案在小鼠中诱导急性肺损伤，其病理发生过程与人类观察到的酸性肺炎高度相似。我们通过开放式气管造口术结合环周压力释放，产生最大程度的急性非致死性低pH肺损伤，并考虑了啮齿类与人类在呼吸系统解剖结构上的差异。...

开放气管切开胃酸误吸小鼠急性肺损伤模型可诱导最大程度的急性非致死性肺损伤

本文介绍了一种通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的逐步操作方法，以及对血液样本、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行流式细胞术分析的方法。该方法具有侵入性小、操作简便、可重复性好以及可滴定疾病严重程度等优点。...

通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤

经臭氧与细菌内毒素联合暴露的小鼠表现出广泛的细胞死亡，包括中性粒细胞的死亡。我们观察到细胞发生多种适应性变化，例如细胞骨架片状伪足结构的破坏、支气管肺泡灌洗液中复合体V...

可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化

此处，我们提出一种经气管递送脂多糖（LPS）的实验方案 通过 无创经口咽气管插管。该方法可最大限度地减少手术操作对动物造成的创伤，并能准确地将LPS输送至气管，进而进入肺部。...

小鼠非侵入性气管内脂多糖滴注

我们提供了一种通过输注脂多糖建立猪实验性内毒素血症休克模型的实验方案。...

脂多糖输注作为猪内毒素血症休克模型

本方案描述了一种新生仔猪急性肺损伤模型的建立方法，该模型模拟早产肺中发生的早期致病事件，包括表面活性物质不足、高氧暴露、高压通气以及炎症反应，旨在促进对支气管肺发育不良分子触发机制的理解，并推动治疗策略的转化应用。...

建立一种新生仔猪急性肺损伤模型以重现早产儿肺部早期环境

了解利用喉镜对大鼠进行非侵入性气管内脂多糖给药以诱发急性肺损伤的方法。该技术可精确递送药物，支持重复给药，为研究肺损伤修复机制和开发靶向治疗提供可靠的动物模型。

非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

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