基因组编辑技术的改进 通过 基于输卵管核酸递送的 在体 内 电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

本研究的目的是通过在体子宫内电穿孔技术，将基因组编辑组分直接递送至怀孕雌性小鼠的输卵管，从而简化基因敲除小鼠的制备过程。传统的原核显微注射方法需要维持大量动物，包括供体雌鼠、受体雌鼠以及输精管结扎雄鼠。因此，能够减少动物使用数量的实验方案更具优势。

使用 Nepa21 系统对受精卵进行电穿孔，可在单步操作中高效地生成靶向基因敲除小鼠，其效率可与传统的基于核显微注射的技术相媲美。首先，利用计算分析工具鉴定靶向目标基因的潜在单导向 RNA 序列。选择位于外显子中且尽可能靠近目标突变位点的序列。使用基因组浏览器比对外显子结构，并优先选择存在于大多数剪接异构体中的序列。

使用该工具集成的评分系统分析每条向导序列的预测脱靶活性。选择脱靶结合可能性最低的序列。为生成线性双链DNA模板，根据下表中指定的组分配制PCR主混合液。

最后加入聚合酶，并将主混合液置于冰上以保持酶的稳定性。然后，使用以下热循环条件进行PCR反应。接着，使用指定组分配制体外转录主混合液，并在37摄氏度下使用热循环仪孵育反应1.5小时，以确保温度控制的一致性。

然后，向反应体系中加入 2 µL DNase I。在 37 °C 下额外孵育 30 分钟以消化 DNA 模板，随后在 75 °C 下孵育 5 分钟以灭活酶。经 TRIzol 法纯化 RNA 后，使用分光光度计测定 RNA 浓度，并检测 A260/A280 和 A260/A230 比值。

为转染制备核糖核蛋白复合物时，使用无核酸酶水将一摩尔 Tris-HCl 缓冲液稀释至 100 毫摩尔浓度。用孔径为 0.022 微米的注射器滤器过滤溶液。分装成每份 10 微升，于 4 摄氏度保存，直至使用。

接下来，在无核酸酶的离心管中，使用spCas9核酸酶、单链向导RNA和用DEPC水稀释的Tris-HCl配制转染混合物。将转染混合物在37摄氏度孵育10分钟，以促进核糖核蛋白复合物的形成。然后，将转染混合物分装成适合单次I-GONAD实验的小份体积，并置于4摄氏度保存，以维持试剂活性。

将CD1雌性小鼠与单只饲养的CD1雄性小鼠过夜交配后，检查每只雌鼠是否存在交配栓。仅将观察到明显交配栓的雌鼠转移至新笼中，用于后续实验操作。使用前需对所有不锈钢手术器械进行高压灭菌，以确保无菌状态。

然后，使用电子天平称量选定的插头=阳性雌性小鼠的体重，再进行麻醉。监测麻醉后小鼠是否失去脚趾夹捏反射，以确认麻醉效果充分。将小鼠置于加热垫上，以在操作过程中维持其体温。

然后，在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。使用精细剪刀，在下背部区域的皮肤上做一个0.7厘米长的纵向切口。接着，将剪刀的尖端略微张开并向两侧轻轻分离，以将皮肤切口轻柔地延长至约1.3厘米。

随后，仔细在腹膜上做一个0.7厘米的切口，以暴露腹腔。将腹膜切口向两侧延伸至1.1厘米，用剪刀尖稍张开并轻轻向两侧推开。找到与卵巢相连的脂肪垫，用镊子轻轻将其向外牵拉，直至暴露卵巢、输卵管和子宫。

使用血管夹固定脂肪垫，以稳定生殖结构。接下来，用移液枪将2 µL核糖核蛋白注射混合物吸入一次性塑料毛细管中。使用显微剪刀，在壶腹部上游几毫米处的输卵管壁上做一个0.2 cm的切口。

将连接在剥离式移液器上的塑料毛细管插入输卵管切口，小心地推出注射混合液，避免引入空气。轻轻将塑料毛细管从输卵管中抽出，完成注射。按下前面板上的电源开关，启动电穿孔仪。

根据屏幕上的提示设置电穿孔仪的参数。使用镊子型电极轻轻夹住输卵管，按下 Kiloohm 按钮以测量电阻。测量电阻后，立即按下 Start 按钮开始电穿孔，并等待 Ohm 按钮上出现结束信号。

完成第一输卵管的电穿孔后，轻柔地将生殖道复位至腹腔内。使用4-0聚乙醇酸外科缝线关闭切口。进行基因型鉴定时，设计长度为18至21个核苷酸、熔解温度接近60摄氏度的引物，以扩增出300至600个碱基对的PCR产物。

为确认每对引物的特异性，需针对小鼠基因组数据库进行BLAST比对，以排除非特异性扩增的风险。接下来，进行DNA提取：使用耳缘打孔法，从小鼠耳朵采集约两毫米大小的小块组织样本，加入100 µL裂解缓冲液。

将样品在 95 摄氏度孵育 60 分钟，每 20 分钟涡旋振荡一次，以确保有效的裂解。完成 Sanger 测序后，分析结果以评估基因组编辑效果。进行 ICE 分析时，需上传 Sanger 测序文件，输入向导 RNA 序列，并选择 CRISPR 实验中使用的相应核酸酶。

接下来，使用 TIDE 时，上传 AB1 格式的对照和实验测序文件，并输入向导 RNA 序列。ICE 分析在 Cas9 切割位点处检测到三种不同的插入缺失变异：42% 的序列中存在一个碱基对的缺失，25% 的序列中存在三个碱基对的缺失，27% 的序列中存在 23 个碱基对的缺失。模型拟合值为 0.94，敲除评分为 69，表明具有较强的预测相关性，且很可能实现基因敲除。

测序色谱图证实，在经编辑的样本中，Cas9 切割位点处序列发生中断，而对照样本的色谱图在同一位置显示序列完整。在六只电穿孔处理的小鼠中，仅有四只产下携带突变的仔鼠，总体编辑效率为 60%。六只电穿孔小鼠的所有窝仔数均减少，每只小鼠仅产下 3 至 4 只仔鼠。