Name: 增强嵌合抗原受体-细胞外囊泡 （CAR-EV） 技术：癌症治疗的未来 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 探索嵌合抗原受体细胞外囊泡（CAR-EV）技术用于癌症靶向治疗的方法。本研究通过离子交换色谱法优化分离流程，显著提高了CAR-EV的产量和纯度，为实体瘤和炎症性疾病的无细胞治疗策略提供了新途径。

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作者谨此感谢 Siena Barton、Hiba Rashid、Sara Nikseresht、Shayalini Wignarajah 和 Abel Sujeev 对本实验室工作的贡献。作者感谢所有内部和外部合作者，本研究由 INOVIQ Ltd 资助并提供资金支持。

注意：所有活细胞操作均须在经认证的生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中进行，并穿戴适当的个人防护装备（如手套、实验服）。含有活细胞的生物危害性材料（如细胞沉淀）必须使用终浓度为10%的次氯酸钠（漂白剂）溶液进行去污染处理。
1. 细胞培养和条件培养基收集
<ol>
	<li>CAR细胞的培养 
	注意：尽管本研究中使用的慢病毒转导的CAR细胞为外包获得，但该方案仍适用于实验室自制的CAR-T/NK细胞 通过 标准细胞工程技术
	<ol>
		<li>在无异源成分培养基（添加100 IU/mL IL-2的生长培养基）中培养CAR NK/T细胞，细胞密度维持在0.5–1 × 10⁶ cells/mL6/mL，在37 °C（5% CO₂）的加湿培养箱中2，21% O₂2每2-3天监测一次，由于传代能力限制，每周细胞计数不超过3次。</li>
		<li>验证CAR表达 通过 显微镜观察，确保细胞具有荧光（若已进行适当标记）。健康细胞团块的存在表明CAR细胞培养状态良好。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CM 收集
	<ol>
		<li>当细胞培养达到80%融合度时，评估细胞活力并确定活细胞密度 通过 台盼蓝自动细胞计数分析</li>
		<li>300 × 离心细胞 g 室温下离心5分钟以形成沉淀。</li>
		<li>小心收集上清液，并在 3,000 × g 4 °C下离心10分钟以澄清。</li>
		<li>将澄清的CM储存于-80 °C，直至进行EV富集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞外囊泡的分离与富集
注意：以下方法概述了两种细胞外囊泡（EV）富集策略：IEX 方法，专为功能研究中的 EV 分离而开发 体外 分析，以及适用于下游表征研究的泛外泌体捕获高通量方法。
<ol>
	<li>功能CAR胞外囊泡的富集 通过 离子交换层析 
	注意：所有体积参数均以柱体积（CV）表示，反映试剂体积与色谱柱中树脂床体积之间的比例关系。
	<ol>
		<li>将离子交换柱（参见 材料清单 将色谱柱在使用前静置15分钟，使其升至室温（RT）（有关所用色谱柱的详细信息，请参见）。加入10个柱体积的再生缓冲液，随后用10个柱体积的等渗平衡缓冲液（pH 7.4）进行平衡（参见 材料表 有关缓冲液的详细信息）。 
		注意：切勿使柱子长时间干涸。始终将柱子保持直立状态。</li>
		<li>将CM解冻后，经0.22 µm聚醚砜（PES）滤器过滤。</li>
		<li>将样品加入已平衡的层析柱中（最多至31.2个柱体积），随后加入10个柱体积的等渗洗涤缓冲液（pH 7.4）。加入2.5个柱体积的高渗洗脱缓冲液（见 材料表并收集流出液，此即为EV洗脱样品。</li>
		<li>使用市售超滤离心滤器（截留分子量30 kDa）和等渗溶液作为稀释液，对EV洗脱液进行缓冲液置换，确保最小稀释倍数为100倍。缓冲液置换后的目标体积可由用户根据实验参数自行确定。</li>
		<li>使用0.22 µm滤器进行最终过滤步骤，以对浓缩的EVs进行灭菌 体外 功能检测</li>
		<li>使用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定CAR-EV的粒径分布、浓度和产量8,9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高通量全外泌体细胞外囊泡分离通过 自动纯化系统，于室温（RT）下操作，用于有限或大量样本的表征分析10,11.
	<ol>
		<li>准备三个96深孔（DW）板，每孔加入1 mL 1×PBS。</li>
		<li>通过向每个孔中加入 35 µL 1% 十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液，制备“洗脱”板。</li>
		<li>准备一个“结合”板，每孔含有1 mL CM样本和30 µL EXO-NET全外泌体捕获磁珠。</li>
		<li>在自动化分离系统上设置以下参数：
		<ol>
			<li>步骤1：吸取枪头：确保分离方案开始时，仪器先安装96深孔枪头盒，以便在整个分离过程中操控磁珠。</li>
			<li>步骤2：将CM样本与磁珠在持续低速条件下混合30分钟，以确保细胞外囊泡（EVs）高效捕获到磁性颗粒上。混合完成后，进行5次、每次30秒的磁珠捕获循环，以确保磁珠的充分回收。</li>
			<li>步骤3：确保三个洗涤步骤中的每一步均采用轻柔的低速混合30秒，以去除非特异性结合的污染物，同时保持结合的细胞外囊泡（EVs）的完整性。与之前相同，该步骤最后通过5个循环、每个循环30秒的操作来捕获磁珠。</li>
			<li>第4步：EV蛋白洗脱（裂解）：通过两相过程确保结合的EV被裂解以回收蛋白。首先进行30秒的混合（底部混合），随后暂停孵育7分30秒，期间吸头位置保持在孔上方。时间结束后，进行第二次30秒混合，并再次暂停7分30秒。最后，进行5个循环，每个循环30秒。</li>
			<li>步骤5：此时应确保蛋白质已进入缓冲液中，而磁珠仍吸附在吸头末端。洗脱步骤完成后，弃去使用过的吸头梳，即完成整个实验流程。 
			注意：EXO-NET 全外泌体捕获磁珠含有 0.05%（w/w）防腐溶液。尽管根据美国职业安全与健康管理局（OSHA）规定不被归类为危险物质，但在操作时应使用适当的个人防护装备（PPE），尤其是在处理生物液体时。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞外囊泡（EVs）的表征 通过 蛋白质印迹法
注意：以细胞作为对照，通过蛋白质印迹法（颗粒酶B和钙联蛋白）对CAR-EV进行表征。
<ol>
	<li>通过每样本加入 10 µL 含蛋白酶抑制剂的 1x 放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液制备细胞裂解液 &#8239;1 × 106 细胞。冰上孵育30分钟，然后在4°C下以14,000 × g离心15分钟，以去除细胞碎片。EVs可使用相同缓冲液或1% SDS进行裂解。</li>
	<li>使用二辛可宁酸（BCA）法（或合适的纳米分光光度计）定量蛋白质含量。</li>
	<li>按照制造商说明书在电泳装置中组装一块4-12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。使用Laemmli缓冲液制备蛋白质裂解液。 
	注意：不同品牌的凝胶系统可能存在差异</li>
	<li>每孔加入5 µg样品，以200 V电压电泳20分钟。</li>
	<li>使用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜进行蛋白质印迹转膜，随后在含0.1% Tween 20的1×Tris缓冲盐水（1×TBST）中加入5%牛血清白蛋白（BSA）封闭膜。</li>
	<li>将印迹膜在一抗单克隆抗体（颗粒酶B和Calnexin，按1:500比例溶于含5% BSA的1×TBST溶液）中孵育，静置（不振荡），4 °C过夜。</li>
	<li>次日，加入10–15 mL 1×TBST缓冲液，室温下洗涤印迹膜，每次5分钟，共洗涤3次，随后加入二抗（根据物种选择，用含5% BSA的1×TBST溶液将二抗稀释至1:1,000，室温孵育1小时）。采用增强型化学发光法（ECL）检测蛋白条带，并采集图像 通过 电荷耦合器件（CCD）数字相机</li>
</ol>
4. 功能检测通过 MTS
注意：细胞毒性通过以下方法评估 体外 MTS [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑] 检测法，细胞可将四氮唑化合物还原为可溶性的有色甲臜产物，于490 nm波长处测定吸光度。在三个独立实验中，分别用递增浓度（0–500,000 粒子/细胞）的CAR-EVs处理MCF-7乳腺癌细胞和K-562血癌细胞，最长处理时间为3天。
<ol>
	<li>每孔接种5,000个受体细胞（50 µL/孔），使用多通道移液器在96孔板中进行。预留一列用于空白培养基（用于MTS试剂背景扣除）。避免使用边缘孔，向其中加入200 µL无菌水。 
	注意：贴壁细胞应在处理前一日接种，以确保细胞充分贴附于培养板表面。</li>
	<li>加入不同递增剂量的EVs（例如., 2.5 x 105 和 4.5 x 105，或每细胞0.5、0.75和100万个EV）。设置对照组：“无EV”、1倍PBS“EV缓冲液”以及阳性细胞杀伤对照（例如靶向特异性小分子抑制剂或0.1% TX-100）。</li>
	<li>在37 °C（5% CO₂）的加湿培养箱中孵育细胞2，21% O₂22-3天。</li>
	<li>在指定的处理时间点，观察细胞 通过 显微镜观察。每孔加入 MTS 试剂（每 100 µL 培养基加入 20 µL）。在 1–4 小时内孵育，并使用酶标仪每小时于 490 nm 处测定吸光度。</li>
	<li>减去空白培养基的吸光度读数以进行数据分析。两组比较采用学生t检验进行统计分析，三组或以上比较则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合多重比较。</li>
</ol>

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</ol>

Asari K、Chelvaretnam C、Mom KT、Bhuiyan S、Pham Q、Fitri A、Palma C、Shojaee M、Khanabdali R、Hinch L 和 Rice G 是 INOVIQ Ltd 的员工。

将经过验证的CAR疗法与基于细胞外囊泡（EV）疗法的潜在优势相结合，可能提高癌症治疗的效果，这一点已在针对乳腺癌和肺癌的研究中得到证实12,13CAR-EV 治疗策略旨在克服当前 CAR 疗法存在的局限性，例如递送难题及相关毒性问题，同时利用细胞外囊泡（EVs）的生物相容性和靶向能力。整合这两种模式可能促进新型癌症治疗策略的开发，拓展 EVs 在临床环境中的应用前景。此外，对功能性 EVs 进行工程化改造与富集可提供更安全的通过 细胞毒性载荷的包封）以及更精确的递送方法（例如，添加靶向结构域），尤其适用于向肿瘤核心、骨髓以及血脑屏障或血睾屏障等屏障保护区域等难以到达的部位递送治疗性载荷14,15,16尽管超速离心法用于细胞外囊泡（EV）富集已较为成熟，但仍存在若干局限性，主要包括：可扩展性差、杂质共分离以及生产后得率有限17大规模生产治疗性EVs的工艺亟需改进。
这项概念验证研究表明，离子交换层析（IEX）是一种可扩展且高效的方法，可用于生产、分离和富集功能性CAR-EV，其输入材料为表达CAR细胞的澄清条件培养基（CM）。IEX支持高通量处理，适用于研究级和cGMP规模的生产，并可在整个工作流程中实现质量控制——从EV的生成到最终药物产品的检测18,19。尽管EV的表征对于确认其功能至关重要，但产量可能因样本体积、输入浓度以及EV特有的性质（如表面电荷和结合特性）不同而存在显著差异。使用MCF-7细胞的内部数据显示，纯化前平均产量约为~2.85 × 108 粒子/mL，纯化后浓度通常在3 × 1011 至1 × 1012 粒子/mL之间。通过在缓冲液置换过程中调整重悬体积，可将这些浓度水平调节至满足下游应用的需求。鉴于上述变异性，强烈建议用户根据其特定实验体系所用的CM优化本方案，以确保获得可重复且稳定的产量。
在本方案中，多个步骤对于成功制备CAR-EVs至关重要，尤其需重点关注样品上样和洗脱阶段。这些步骤直接影响柱子对EV的捕获效率，进而影响总体得率。缓冲液置换步骤尤为关键，若未能充分去除过量溶质，可能破坏EV的稳定性，导致其随时间发生降解。随后可采用纳米颗粒追踪分析（NTA）或蛋白质组学分析等方法对EV进行表征。若CAR-EVs将用于功能学实验，如细胞摄取研究或治疗性干预，则无菌性至关重要。最终的“终端”除菌过滤（0.22 µm）步骤必不可少，以防止微生物污染，避免干扰实验结果或带来生物安全风险。鉴于上述因素，强烈建议操作者在这些步骤中格外谨慎，以确保最终EV制备物的可重复性与功能完整性。
在CAR-EV制备过程中，可能需要对多个实验步骤进行优化，以解决常见问题。产量过低通常是由条件培养基（CM）上样量不理想所致，即上样量超出或未达到层析柱的结合能力。为确定最佳上样体积，建议开展CM滴定实验，逐步增加上样量，以确定EV回收率最高的最佳点。滤膜堵塞通常发生在最终的无菌过滤步骤，往往源于样品浓度过高和黏度过大，这可能促进EV聚集。在此情况下，建议对最终的EV制剂进行稀释。如果无法进行稀释，则可在缓冲液置换前进行无菌过滤；但此方法要求后续所有操作均须在严格的无菌条件下进行，以维持无菌状态。
将EVs开发为癌症治疗手段需要可重复的生产工艺以及针对靶向癌细胞系疗效的可靠验证。离子交换层析（IEX）在EV富集中的一个常见局限性是会共分离出非EV颗粒——这一问题可通过EV特异性标志物的下游分析加以识别，并可通过优化方法予以降低 通过 进一步优化条件培养基。EVs 的对照释放表征应包括：纳米颗粒追踪分析（NTA）以确定颗粒数量、大小及富集后的 EV 浓度；CAR 结构表达的基因及转录本分析；CAR、经典 EV 生物标志物和细胞溶解标志物的细胞及 EV 蛋白表达检测（例如, 颗粒酶B和穿孔素）；以及靶向效应和脱靶效应。结合其他技术，如透射电子显微镜（TEM），可提供形态学验证，以补充基于尺寸的表征，支持更全面的分析。为确保质量控制，EV产品应进行支原体和内毒素污染检测，以验证其无菌性及适用于临床生产。采用适合的制剂用于功能性CAR-EVs的长期保存，可能有助于提高其稳定性，包括维持质量、数量和治疗功效。持续评估功能性能对于确保产品质量至关重要。值得注意的是，本研究中使用的MTS检测法可对细胞毒性进行间接评估。 通过 代谢活性的检测。未来的研究若能整合标准化的细胞毒性检测方法，例如乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、Annexin V/PI染色或caspase激活谱分析，将有助于更准确地界定细胞毒性效应。此外，引入CAR细胞对照（本研究因获取限制未纳入），单独或与CAR-EVs联合使用，并平行处理对照的非癌细胞系，可进一步提升研究结果的解释价值。
本研究强调了EGFR/HER2 CAR EVs作为特定癌症可行治疗策略的潜在应用价值。通过多次给药或预先激活亲本T细胞以增强其细胞毒性，可提高CAR EVs的疗效。此外，新兴方法的进展，如siRNA载荷，以及对EGFR/HER2的优化改进&#160;结合能力为优化这些治疗平台的设计提供了机遇20,21双嵌合抗原受体（dual-CARs）在细胞治疗中的前景应用为该领域的发展提供了新的机遇。通过在治疗中利用双嵌合抗原受体的细胞外囊泡（EV）形式，可能成为拓展其治疗范围并增强治疗手段的关键步骤。22,23实时监测CAR-EV介导的癌细胞杀伤效应（例如.，caspase 3/7 激活、阻抗读数）为确定最佳给药方案提供了有价值的见解，有助于顺利推进至后续研究 在体 应用。

CAR细胞疗法已获批准用于治疗血液系统恶性肿瘤，然而仍存在重大挑战和局限性1。值得注意的是，在评估患者是否适合接受CAR疗法时，CRS和ICANS的风险仍是关键因素，这凸显了治疗策略需持续改进的必要性2。
源自CAR细胞的细胞外囊泡（CAR-EVs）已成为一种更有效且潜在更安全的同种异体治疗选择。这类囊泡具有多项优势，包括免疫原性降低、细胞因子释放综合征（CRS）风险更低、肿瘤浸润能力增强、适用于重复给药、可用于联合治疗，以及高效的生产和储存流程3。来源于生物体的细胞外囊泡可被改造以表达靶向癌细胞的分子，这些分子能够高亲和力地结合癌细胞表面的特定受体。经过修饰后，这些设计型囊泡为选择性递送治疗性载荷提供了一种极具前景的策略，有望最大限度减少脱靶效应。源自CAR细胞的这些“武装化”囊泡表现出增强的功能特性，可实现更精确和强效的治疗递送。其固有特性赋予了多种优势，共同促进了治疗效果的提升。
临床应用EVs的两个主要障碍是规模化和疗效。本文所述的方法具有内在的可扩展性，并可轻松适应广泛的实验范式。将EVs生产扩大到临床级制造是当前活跃的研究领域，但仍需进一步优化，以产生足量的临床级材料4重要的是，最近的研究已证明了若干可提高细胞外囊泡（EV）功效的有前景方法，例如用白细胞介素对亲代细胞进行预处理（如., IL-7、IL-15、IL-21）并在低氧条件（1-2% O₂）下生成EVs2条件5,6,7.
本研究旨在探讨靶向表皮生长因子受体（EGFR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的CAR-EV的治疗潜力 体外，使用 MCF-7 乳腺癌细胞和 K562 髓系白血病细胞。从 CAR 细胞条件培养基（CM）中分离并富集细胞外囊泡（EVs） 通过 IEX 通过纳米颗粒追踪和蛋白质印迹分析进行表征，并进行功能检测。携带内源性细胞毒性载荷的 CAR EVs 能有效诱导细胞死亡 体外 所获得的数据证实了大规模靶向生产细胞外囊泡用于治疗应用的可行性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>EV 富集</td></tr><tr><td>1% 十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma</td><td>L3771-100G</td><td>将1 g SDS粉末溶解于10 mL超纯水中</td></tr><tr><td>含吐温-20的1倍三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（TBST）</td><td>赛默飞世尔科技化学品</td><td>J77500.K2</td><td>用超纯水稀释，配制成1x溶液（或者，在1x Tris缓冲盐水中配制0.1%聚山梨酯-20/Tween-20溶液）</td></tr><tr><td>96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板，无菌</td><td>康宁</td><td>3595</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 功能检测</td></tr><tr><td>Bolt Bis-Tris Plus Mini Protein Gels，4-12%，1.0 mm，WedgeWell 格式</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>细胞/细胞外囊泡表征</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>细胞/细胞外囊泡表征</td></tr><tr><td>钙联蛋白抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>2433S</td><td>细胞/细胞外囊泡表征</td></tr><tr><td>CAR-NK/T细胞</td><td>ProMab Biotechnologies</td><td>视具体情况而定</td><td>CAR 胞外配体结合域取决于靶细胞上的优选靶点</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS）</td><td>普洛麦格</td><td>G3580</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 功能检测</td></tr><tr><td>cOmplete，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td>细胞裂解</td></tr><tr><td>ECL Western 印迹检测试剂</td><td>Amersham</td><td>RPN2232</td><td>细胞/细胞外囊泡表征</td></tr><tr><td>洗脱缓冲液</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV 富集/分离</td></tr><tr><td>平衡缓冲液</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV 富集/分离</td></tr><tr><td>EXO-ACE IEX 柱</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>用于下游功能检测的EV富集/分离&lt;br/&gt; 专利号 AU2024901931</td></tr><tr><td>EXO-NET 全外泌体捕获微珠</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>用于下游表征的EV分离&lt;br/&gt; 专利号 WO/2014/011673</td></tr><tr><td>颗粒酶B抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>4275</td><td>细胞/细胞外囊泡表征</td></tr><tr><td>人IL-2 IS，优级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td>T/NK细胞的无异源培养</td></tr><tr><td>iBlot 2 转膜堆栈，PVDF</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>细胞/细胞外囊泡表征</td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF（cGMP）</td><td>Stemcell Technologies</td><td>100-0956</td><td>T/NK细胞的无异源培养</td></tr><tr><td>K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 功能检测</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 功能检测</td></tr><tr><td>Millex-GP 注射器滤器，0.22 μm &amp;micro;m</td><td>默克密理博</td><td>SLGPR33RS</td><td>终端过滤</td></tr><tr><td>再生缓冲液</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV 富集/分离</td></tr><tr><td>RIPA缓冲液（10X）</td><td>细胞信号技术</td><td>9806</td><td>细胞裂解</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>细胞活力与密度评估</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td>INOVIQ</td><td></td><td>EV 富集/分离</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数器</td><td>Invitrogen</td><td>Countess II FL</td><td>细胞活力与密度评估</td></tr><tr><td>台式自动化提取仪器</td><td>Invitrogen</td><td>KingFisher Apex 系统</td><td>高通量自动化纯化系统&lt;br/&gt; 详见以下链接中的实验方案详情：https://www.inoviq.com/site/technology/resources</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>蔡司</td><td>Axio Observer 7</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>纳米颗粒跟踪分析（NTA）</td><td>Particle Metrix GmbH</td><td>Zetaview PMX-130</td><td>颗粒分析</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTROstar Nano</td><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 功能检测</td></tr><tr><td>冷藏台式离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>Avanti J-15R</td><td>细胞培养 &amp;和EV富集处理</td></tr><tr><td>SDS-PAGE微型凝胶电泳槽</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td>细胞/细胞外囊泡表征</td></tr><tr><td>Western blot 转膜系统</td><td>Invitrogen</td><td>iBlot 2</td><td>细胞/细胞外囊泡表征</td></tr></tbody></table>

增强型嵌合抗原受体-细胞外囊泡（car-ev）技术：癌症治疗的未来

Enhancing Chimeric Antigen Receptor-Extracellular Vesicles (CAR-EV) Technology: The Future of Cancer Therapy

CAR细胞疗法已显著推动了多种血液系统恶性肿瘤的个体化治疗。目前已有七种CAR-&#8239;细胞产品已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准&#8239;由欧洲药品管理局（EMA）批准用于治疗淋巴瘤、多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病。尽管如此，仍存在若干挑战与局限，其中以细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）最为显著。无细胞疗法（如CAR-EV）相较于细胞疗法具有显著优势，包括增强的肿瘤浸润能力，以及可在降低CRS、ICANS及其他不良副作用风险的同时实现重复给药。此外，通过在CAR-EV中工程化地引入细胞毒性药物和功能调节性核糖核酸（RNAs），可调节其效力。本文报道了一种可扩展的CAR-EV平台的开发，用于生产可调控效力的CAR-EV。该平台包括对EV生产细胞的工程化改造与预处理（例如., CAR-T 和 CAR-自然杀伤（CAR-NK）细胞、使用符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的离子交换色谱（IEX）平台分离和富集CAR-EV、全自动高通量EV亚群分析，以及 体外 评估CAR-EV的功能性细胞毒活性。该平台已利用CAR-NK-EV和CAR-T-EV在血液系统肿瘤和实体瘤细胞系中得到验证。CAR-EV平台代表了一种有前景的策略，可用于快速开发针对特定疾病适应症的即用型治疗性CAR-EV，并有望降低与基于CAR细胞的疗法相关的不良副作用。

CAR T/NK细胞培养、EV分离、表征及在功能检测中利用EV的典型工作流程如图所示 图1收集CAR T/NK细胞培养的条件培养基，用于后续的细胞外囊泡富集及下游表征（包括纳米颗粒跟踪分析）和功能活性评估 通过 多孔板 MTS 检测图1).
可对表达GFP标记的CAR细胞进行可视化观察 通过 通过显微镜观察培养物中CAR结构的表达情况。在收集条件培养基（CM）之前及过程中，应常规进行显微镜检查，以确保转导效率足够高。在评估转导效率时，需叠加明场与GFP荧光通道图像，以识别可能存在的自发荧光。值得注意的是，T细胞具有自然聚集的倾向（自然杀伤细胞中亦可观察到类似现象；数据未显示），当细胞呈现聚集表型时，可清晰观察到荧光信号。图2).
在细胞外囊泡（EV）富集后，可通过纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白质印迹免疫检测对EV进行表征。via NTA分析颗粒产量可证实，与条件培养基（CM）相比，所分离的EV浓度有所增加（图3A）。蛋白质印迹结果进一步证实了CAR细胞及其EV中均表达细胞溶解标志物颗粒酶B，而EV中无钙连蛋白（calnexin）的表达，表明制备物中不含细胞成分。实验中以HEK293T细胞作为无CAR表达的阴性对照（图3B）。
EV功能分析已执行 通过 MTS 法检测细胞活力/增殖能力。通过在 490 nm 波长下测定比色型 MTS 试剂的吸光度（扣除背景信号后），评估靶向 EGFR 和 HER2 的 CAR-EVs 对 MCF-7 乳腺癌细胞和 K562 血液肿瘤细胞活力与生长的影响。本示例中，靶向 EGFR 的 CAR-EVs 使 MCF-7 和 K562 细胞活力降低 70% &amp; 40%。靶向HER-2的CAR-EVs使MCF-7减少了约10%（由测定确定） 通过 学生 t 检验）。考虑到实验设计，应采用非参数检验方法（例如，Mann-Whitney U）可能在后续研究中提供更可靠的见解（图4).
<img alt="CAR-T/NK 细胞培养过程；EV 富集与表征；功能检测（MTS 检测）。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig1.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 1"> 
图 1：CAR-EV 的生成、富集、EV 表征及功能检测。 示意图展示在分析功能之前，富集 CAR-EV 样本的典型工作流程，包括 EV 的生成、生产与表征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CAR expression in transduced T-cells; brightfield, GFP, merged microscope images for cell analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig2.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Figure 2"> 
图2通过检测HER2靶向CAR-T细胞中GFP表达的代表性显微镜分析。 图像已采集 通过 荧光显微镜观察，使用20倍物镜。白色标尺代表50 µm长度。T细胞在解离为单细胞之前具有自然聚集成团的倾向。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CAR-EVs 表征；通过 EXO-ACE 分离方法获得的柱状图（A）和蛋白质分析（B）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig3.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 3"> 
图 3：CAR 细胞和 EVs 的表征。（A）CAR-T 条件培养基（CM）及富集 EVs 的纳米颗粒追踪分析。EVs 的颗粒浓度比 CM 高 1.6–2.1 倍，而蛋白质浓度则降低超过 &gt;80%。组间差异的统计学显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）和 Tukey 多重比较检验进行评估；*** p ≤ 0.001，**** p ≤ 0.0001。（B）转导 T 细胞和富集 CAR-EVs 的 Western 印迹分析证实，细胞毒性颗粒酶 B 在 CAR 细胞和 EVs 中均存在，而在 HEK293T 非 CAR 细胞中未检测到。CAR-EV 中未检测到钙联蛋白（calnexin），表明内质网颗粒污染程度较低。每泳道上样蛋白量 = 5 µg。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Functional efficacy study; absorbance bar charts for EGFR, HER2 CAR-EVs; breast, blood cancer cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68726/68726fig4.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Figure 4"> 
图4CAR-EVs 对靶细胞活力的影响（MCF-7 乳腺癌细胞和 K562 慢性髓系白血病细胞系）。 靶细胞经单次处理，剂量为 4.5 x 105 和 2.5 x 105 EVs/细胞（分别含EGFR或HER2 CAR）或对照（EV缓冲液）处理，最长3天。A) EGFR 靶向 CAR-EV 细胞。B) 靶向HER2的CAR-EVs。在两种细胞系中均观察到吸光度降低（表明治疗有效）。数据表示为均值±标准差（n = 3），采用双尾非配对Student t检验进行分析， p- 表示统计学显著性的数值；** p≤ 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68726/68726fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

细胞外囊泡（EVs）的治疗应用有望革新癌症治疗和药物递送。通过离子交换色谱法分离获得的嵌合抗原受体（CAR）细胞来源的EVs（CAR-EVs）具有更高的载荷能力，显著增强了其功能效能。本研究进一步表征了CAR-EVs，以阐明其生物学活性和治疗潜力。

增强型嵌合抗原受体-细胞外囊泡（CAR-EV）技术：癌症治疗的未来

CAR 细胞疗法已显著推动了多种血液系统恶性肿瘤的个体化治疗。目前已有七种 CAR 细胞产品……

我们的研究聚焦于基于外泌体的诊断与治疗技术的开发。目标是开发基于嵌合抗原受体外泌体的治疗手段，相较于细胞治疗，其具有更高的安全性、有效性及可及性，用于治疗旁侧肿瘤。我们的EXO-NET和EXO-ACE平台能够实现可扩展、可重复且符合GMP标准的外泌体分离，具有高得率和高纯度，克服了传统方法在研究与治疗应用中的局限性。EXO_NET 网络和 EXO-ACE 可实现快速、可扩展且符合 GMP 标准的细胞外囊泡（EV）分离，具有更高的纯度和可重复性，在用于研究、诊断和治疗应用时优于离心法和沉淀法。我们已开发出一种快速、可扩展且经过验证的方法，用于制备 CAR-EV，以递送新一代无细胞、靶向性治疗药物。该方法提供了一种稳健的工作流程，可应用于其他存在临床需求的疾病状况。我们的下一个目标是利用已开发并验证的方法，生成用于递送RNA治疗药物以治疗实体瘤及其他炎症性疾病的CAR-EVs。首先，将离子交换柱直立放置15分钟，使其升至室温。使用移液器加入10个柱体积的再生缓冲液，随后加入10个柱体积的平衡缓冲液。将THOD条件培养基通过0.22微米的聚醚砜滤器过滤。随后，向已平衡的层析柱中加入最多31.2柱体积的过滤样品。接着加入10柱体积的洗涤缓冲液，再加入2.5柱体积的洗脱缓冲液。收集含有富集的细胞外囊泡的穿流液。使用30千道尔顿的超滤离心滤器和稀释液，对细胞外囊泡洗脱液进行缓冲液置换，确保至少100倍的稀释。根据实验需求调整置换后溶液的最终体积。将富集的细胞外囊泡样品通过0.22微米滤器，以实现体外实验的无菌化处理。使用纳米颗粒跟踪分析法测定CAR细胞外囊泡的粒径分布、浓度和得率。对于高通量全外泌体细胞外囊泡分离，开启仪器并登录系统。配置参数以建立高通量细胞外囊泡蛋白分离方案。通过将排枪头梳插入96孔深孔板中来制备排枪头梳板。向每个孔中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），以准备三块洗涤板。现在，通过将35微升1% SDS缓冲液加入96孔板的每个孔中来制备洗脱板。然后通过向结合板中加入1毫升条件培养基来制备结合板。在自动化分离系统上，选择程序“HT EV Protein Isolation Protocol”并点击播放按钮，开始运行程序。打开仪器以开始加载板。根据仪器提示，先将制备好的洗脱板放入仪器，随后放入三洗深孔板。在加载结合板之前，向每个孔中加入 30 微升广谱外泌体捕获微珠。将结合板放入仪器中，然后加载吸头梳板，关闭仪器以启动结合程序。系统将以低速持续混合条件培养基样本与磁珠30分钟，以高效捕获细胞外囊泡。结合步骤完成后，让系统执行三次洗涤步骤，每次以低速混合30秒，以去除非特异性污染物。启动自动化系统，通过30秒底部混匀开始细胞外囊泡裂解以回收蛋白质。在孵育期间，仪器将暂停7分30秒，同时保持移液吸头位于各孔上方。随后进行另一次30秒混匀，接着再次暂停7分30秒。当程序结束后，系统将提起已使用的吸头梳，使溶液留在96孔板中，而磁珠则附着在吸头末端。最后，仪器将进入放置步骤，将吸头梳放回吸头梳板中。打开仪器并取出各孔板。绿色荧光蛋白（GFP）荧光证实了慢病毒转导T细胞中CAR的表达，荧光信号在细胞簇中清晰可见，通过明场与GFP荧光通道叠加图像可验证其共定位。纳米颗粒追踪分析显示，与条件培养基相比，EGFR和HER2 CAR构建体的富集细胞外囊泡（EV）组分中细胞外囊泡浓度显著升高。Western blot检测证实，颗粒酶B存在于表达CAR的细胞及分离得到的细胞外囊泡中，而内质网分子标志物钙联蛋白（calnexin）在细胞外囊泡中未被检出，表明无细胞污染。靶向EGFR的CAR外泌体使MCF-7乳腺癌细胞活力显著降低70%，K-562血癌细胞活力降低40%；而靶向HER2的CAR外泌体仅使MCF-7乳腺癌细胞活力降低约10%，对K-562血癌细胞则无明显影响。

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