增强型嵌合抗原受体-细胞外囊泡（CAR-EV）技术：癌症治疗的未来

我们的研究聚焦于基于外泌体的诊断与治疗技术的开发。目标是开发基于嵌合抗原受体外泌体的治疗手段，相较于细胞治疗，其具有更高的安全性、有效性及可及性，用于治疗旁侧肿瘤。我们的EXO-NET和EXO-ACE平台能够实现可扩展、可重复且符合GMP标准的外泌体分离，具有高得率和高纯度，克服了传统方法在研究与治疗应用中的局限性。

EXO_NET 网络和 EXO-ACE 可实现快速、可扩展且符合 GMP 标准的细胞外囊泡（EV）分离，具有更高的纯度和可重复性，在用于研究、诊断和治疗应用时优于离心法和沉淀法。我们已开发出一种快速、可扩展且经过验证的方法，用于制备 CAR-EV，以递送新一代无细胞、靶向性治疗药物。该方法提供了一种稳健的工作流程，可应用于其他存在临床需求的疾病状况。

我们的下一个目标是利用已开发并验证的方法，生成用于递送RNA治疗药物以治疗实体瘤及其他炎症性疾病的CAR-EVs。首先，将离子交换柱直立放置15分钟，使其升至室温。使用移液器加入10个柱体积的再生缓冲液，随后加入10个柱体积的平衡缓冲液。

将THOD条件培养基通过0.22微米的聚醚砜滤器过滤。随后，向已平衡的层析柱中加入最多31.2柱体积的过滤样品。接着加入10柱体积的洗涤缓冲液，再加入2.5柱体积的洗脱缓冲液。

收集含有富集的细胞外囊泡的穿流液。使用30千道尔顿的超滤离心滤器和稀释液，对细胞外囊泡洗脱液进行缓冲液置换，确保至少100倍的稀释。根据实验需求调整置换后溶液的最终体积。

将富集的细胞外囊泡样品通过0.22微米滤器，以实现体外实验的无菌化处理。使用纳米颗粒跟踪分析法测定CAR细胞外囊泡的粒径分布、浓度和得率。对于高通量全外泌体细胞外囊泡分离，开启仪器并登录系统。

配置参数以建立高通量细胞外囊泡蛋白分离方案。通过将排枪头梳插入96孔深孔板中来制备排枪头梳板。向每个孔中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），以准备三块洗涤板。

现在，通过将35微升1% SDS缓冲液加入96孔板的每个孔中来制备洗脱板。然后通过向结合板中加入1毫升条件培养基来制备结合板。在自动化分离系统上，选择程序“HT EV Protein Isolation Protocol”并点击播放按钮，开始运行程序。

打开仪器以开始加载板。根据仪器提示，先将制备好的洗脱板放入仪器，随后放入三洗深孔板。在加载结合板之前，向每个孔中加入 30 微升广谱外泌体捕获微珠。

将结合板放入仪器中，然后加载吸头梳板，关闭仪器以启动结合程序。系统将以低速持续混合条件培养基样本与磁珠30分钟，以高效捕获细胞外囊泡。结合步骤完成后，让系统执行三次洗涤步骤，每次以低速混合30秒，以去除非特异性污染物。

启动自动化系统，通过30秒底部混匀开始细胞外囊泡裂解以回收蛋白质。在孵育期间，仪器将暂停7分30秒，同时保持移液吸头位于各孔上方。随后进行另一次30秒混匀，接着再次暂停7分30秒。

当程序结束后，系统将提起已使用的吸头梳，使溶液留在96孔板中，而磁珠则附着在吸头末端。最后，仪器将进入放置步骤，将吸头梳放回吸头梳板中。打开仪器并取出各孔板。

绿色荧光蛋白（GFP）荧光证实了慢病毒转导T细胞中CAR的表达，荧光信号在细胞簇中清晰可见，通过明场与GFP荧光通道叠加图像可验证其共定位。纳米颗粒追踪分析显示，与条件培养基相比，EGFR和HER2 CAR构建体的富集细胞外囊泡（EV）组分中细胞外囊泡浓度显著升高。Western blot检测证实，颗粒酶B存在于表达CAR的细胞及分离得到的细胞外囊泡中，而内质网分子标志物钙联蛋白（calnexin）在细胞外囊泡中未被检出，表明无细胞污染。

靶向EGFR的CAR外泌体使MCF-7乳腺癌细胞活力显著降低70%，K-562血癌细胞活力降低40%；而靶向HER2的CAR外泌体仅使MCF-7乳腺癌细胞活力降低约10%，对K-562血癌细胞则无明显影响。