可操作的 体内 将肿瘤细胞重编程为类似1型传统树突状细胞的细胞

我们研究在体内将癌细胞重编程为类似cDC1细胞的新型免疫治疗策略。旨在确定该方法是否可将免疫冷肿瘤转化为免疫热肿瘤，从而激发抗肿瘤免疫反应。针对现有体内生成cDC1策略的局限性，我们提出一种直接在肿瘤内将癌细胞转化为具有免疫原性的类似cDC1细胞的实验方案，以实现在原位研究由cDC1驱动的免疫应答。

我们可操作的体内编程方案能够稳定地生成成熟的具有免疫原性的类似cDC1的细胞，克服了肿瘤微环境的抑制作用。由于这些细胞直接在体内生成，该方法避免了体外免疫细胞制备的需求。我们的研究结果为将转录因子介导的体内重编程技术转化为临床应用奠定了基础，提出了一种即用型但又个性化的癌症免疫疗法，可诱导持久的抗肿瘤免疫应答。未来，我们正在探究cDC1样细胞重编程是否能够促进三级淋巴结构及支持性基础设施的形成，以及这种效应是否可转化为体液免疫应答。

此外，我们还在探索其与其他免疫治疗策略的潜在协同作用。首先，将 HEK 293T 细胞培养至融合度达到 70% 至 80%。接着，将含有转移质粒的转染混合物充分涡旋振荡 1 分钟，然后在室温下孵育 15 分钟，以促进 DNA-脂质复合物的形成。

吸出 HEK 293T 细胞的培养基，加入 10 毫升不含青霉素-链霉素但添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基。然后将转染混合物逐滴加入 150 毫米培养皿中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。孵育结束后，更换为 20 毫升完全 DMEM 培养基（补充 1 毫摩尔的丁酸钠），并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下继续孵育细胞 24 小时。

随后，在转染后48小时和60小时，将含有慢病毒的上清液收集至50毫升锥形管中。第一次收集后，每块150毫米培养板加入12毫升预热的完全DMEM，用于第二次收获。使用0.45微米低蛋白结合聚醚砜滤器过滤收集的液体。

用移液器将37克含慢病毒的培养基加入38.5毫升开口薄壁聚丙烯管中。将管子置于摆桶转子中，在4摄氏度下以25,000 G离心90分钟。离心后，吸除上清液，注意不要扰动沉淀。

将开口的薄壁聚丙烯管倒置在实验室擦拭纸或类似的吸水材料上五分钟，以去除多余的液体并干燥沉淀。接着，向每个沉淀中加入 200 µL 冰冷的含 HEPES 的 DMEM 或 PBS，并将混合物转移至置于 50 mL 锥形管中的微量离心管内。将沉淀在 4 °C 下孵育过夜，以确保完全重悬。

将所有重悬的沉淀合并至一个容器中，将病毒原液分装为50至200微升的小体积 aliquot，并于-80摄氏度保存以长期使用。在癌细胞扩增后，制备细胞悬液用于转导，以在第3天达到EGFP阳性细胞与EGFP阴性细胞接近1:1的比例。向细胞悬液中加入8微克/毫升的polybrene，随后加入先前确定的适量慢病毒。

轻轻混匀内容物，避免产生气泡。现在，将含有1×10⁵个细胞的2毫升制备好的细胞悬液移入6孔组织培养板的每个孔中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。24小时后，从每个孔中移除含有慢病毒的培养基。

用 PBS 洗涤孔板两次。每孔加入 500 µL 胰蛋白酶，于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 5 至 10 分钟。随后在光学显微镜下观察各孔，以确认细胞已完全从培养板上脱离。

然后，使用完全培养基将细胞收集到50毫升锥形管中。在350 ×g 条件下离心5分钟，使细胞沉淀。用PBS洗涤沉淀。

取一份等分试样，使用血细胞计数板和台盼蓝染色法评估活细胞数量。随后，将最终的细胞沉淀重悬于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，调整细胞浓度至每毫升2×10⁷至4×10⁷个细胞，相当于每50微升肿瘤接种液中含有1×10⁶至2×10⁶个细胞。将细胞置于冰上，并转移至动物实验区域。

麻醉 CD45.1 小鼠后，将其置于加热垫上以防止低体温。涂抹眼膏以防止小鼠在麻醉期间发生眼部脱水。使用剃刀剃除小鼠右侧 flank 区域的毛发。

可选地，使用耳标钳对小鼠进行标记。用70%乙醇浸湿的棉签对剃毛区域进行消毒，并清除残留的毛发。然后，使用P1000移液器充分重悬癌细胞。

将完全重悬的细胞悬液加入一支配有30号针头的0.5毫升注射器中。用两根手指轻轻提起小鼠脱毛后侧腹部的皮肤，将注射器针头插入抬起皮肤所形成的褶皱中。在用一只手固定注射器的同时，松开提起的皮肤。

用另一只手的两个手指拉伸皮肤顶部。缓慢注射 50 µL 癌细胞悬液，使注射部位形成可见的椭圆形皮下肿胀。注射操作完成后，监测动物直至其从麻醉状态完全苏醒，以确保存活。

转染SFFV-PIB-eGFP质粒的HEK 293T细胞在转染后24小时显示出清晰的eGFP表达，证实质粒递送成功。转导72小时后，黑色素瘤细胞表明重编程因子和eGFP成功递送。细胞植入后第九天，体内重编程产生的完全重编程的CD45阳性、MHC-II阳性、类似cDC1的细胞比例高于体外条件。

植入后第三天，PIB-eGFP 肿瘤中 CD45 阳性免疫细胞的浸润程度明显高于 eGFP 对照组，表明早期免疫重塑的发生。至第九天时，PIB-eGFP 肿瘤每单位肿瘤区域的 CD45 平均荧光强度仍显著高于对照组。到第九天时，PIB-eGFP 肿瘤中可检测到三级淋巴结构的形成，提示肿瘤微环境中发生了结构性的免疫改变。