Name: 肿瘤细胞可处理的 体内 重编程为 1 型常规树突状细胞样细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习将小鼠肿瘤细胞在体内重编程为1型常规树突状细胞样细胞的方法，通过表达PU.1、IRF8和BATF3转录因子，将免疫冷肿瘤转化为免疫热肿瘤，从而增强抗肿瘤免疫反应。

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我们感谢造血与免疫细胞重编程实验室的 Mariana Lopes 和 Camille Chatelain 对手稿的编辑和校对。
本研究是在瑞典研究理事会资助的国家先进治疗医药产品研究学院（National ATMP Research School）的框架下完成的。本文讨论的项目还获得了欧洲研究理事会欧盟“地平线2020”研究与创新计划（866448-TrojanDC 和 101189370）、诺和诺德基金会（Novo Nordisk Fonden，NNF22C0079466）、欧洲创新理事会（European Innovation Council，101130218-RESYNC）、瑞典癌症基金会（Cancerfonden，23 2932 Pj）、瑞典研究理事会（2020-00615）、瑞典创新局（Swedish Innovation Agency，2024-02178）、ALF（44410）、葡萄牙科学技术基金会（FCT，2022.02338.PTDC）以及葡萄牙复苏与弹性计划通过“下一代欧盟”基金（NextGenerationEU，C644865576-00000005）的共同资助。谨此感谢克努特和爱丽丝·瓦伦伯格基金会（Knut and Alice Wallenberg Foundation）、隆德大学医学院和斯科讷地区（Region Skåne）提供的慷慨财政支持。
材料可用性：
用于重编程的载体和质粒可从Asgard Therapeutics公司通过材料转移协议获得。评估本文结论所需的其他所有数据均包含在正文或补充材料中。

<ol><li>Oliveira, G., Wu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+specificities+of+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).</li>
<li>Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-year+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).</li>
<li>Adams, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+monotherapy+for+previously+untreated%2C+PD-L1-positive%2C+metastatic+triple-negative+breast+cancer%3A+cohort+B+of+the+phase+II+KEYNOTE-086+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study.</a> Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).</li>
<li>Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+trial+of+trifluridine%2Ftipiracil+plus+nivolumab+in+patients+with+heavily+pretreated+microsatellite-stable+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).</li>
<li>Reardon, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+phase+3+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+nivolumab+vs+bevacizumab+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%3A+CheckMate+143%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143.</a> Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+as+orchestrators+of+anticancer+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).</li>
<li>Heras-Murillo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+with+conventional+type-1+dendritic+cells+induces+immune+memory+and+limits+tumor+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse.</a> Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).</li>
<li>Theisen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WDFY4+is+required+for+cross-presentation+in+response+to+viral+and+tumor+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens.</a> Science. 362 (6415), 694-699 (2018).</li>
<li>Meiser, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+stimulatory+cDC1+subpopulation+amplifies+CD8%2B+T+cell+responses+in+tumors+for+protective+anti-cancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity.</a> Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).</li>
<li>Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-residing+Batf3+dendritic+cells+are+required+for+effector+T+cell+trafficking+and+adoptive+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy.</a> Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).</li>
<li>Hubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-III+is+selectively+produced+by+cDC1+and+predicts+good+clinical+outcome+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer.</a> Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).</li>
<li>Mahadevan, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+conventional+dendritic+cells+facilitate+immunotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer.</a> Science. 384 (6703), eadh4567(2024).</li>
<li>Ascic, E., Pereira, C. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).</li>
<li>Silk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+tumour+antigens+by+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+CD141%2B+XCR1%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells.</a> Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).</li>
<li>Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+generation+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and generation of human dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).</li>
<li>Makino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cDC-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).</li>
<li>Balan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+human+dendritic+cell+differentiation+revealing+Notch-dependent+lineage+bifurcation+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity.</a> Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).</li>
<li>Ascic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+cell+reprogramming+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy.</a> Science. 386 (6719), eadn9083(2024).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+antigen-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).</li>
<li>Rosa, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+informs+efficient+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+cross-presenting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells.</a> Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).</li>
<li>Zimmermannova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+tumor+immunogenicity+with+dendritic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming.</a> Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).</li>
<li>Bouquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RapaCaspase-9-based+suicide+gene+applied+to+the+safety+of+IL-1RAP+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells.</a> Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+primary+human+fibroblasts+with+only+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).</li>
<li>Rojas, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+RNA+neoantigen+vaccines+stimulate+T+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer.</a> Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).</li>
<li>Guan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).</li>
<li>Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+cancer+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells.</a> Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).</li>
<li>Cabrita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+lymphoid+structures+improve+immunotherapy+and+survival+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma.</a> Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).</li>
<li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+endogenous+retroviruses+promote+lung+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy.</a> Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).</li>
</ol>

C.-F.P. 在 Asgard Therapeutics AB 拥有股权利益，并担任管理职务，该公司基于体内树突状细胞重编程技术开发癌症免疫疗法。C.-F.P. 是 Asgard Therapeutics 持有的已授权专利 US 11,345,891、JP 7303743 和 CN ZL201880005047.3 以及专利申请 WO 2018/185709 和 WO 2022/243448（与 E.A. 共同发明）的发明人，这些专利涵盖了本文所述的细胞重编程方法。

在此方案中，我们描述了一种可操作的方法，用于生成类似cDC1的细胞 体内 实体瘤中癌细胞的重编程。我们的结果表明，PU.1、IRF8 和 BATF3 的过表达可驱动肿瘤微环境（TME）中的细胞逐渐获得 cDC1 表型，直至第 9 天，此后类 cDC1 细胞从肿瘤中耗竭。最终，这导致到第 3 天时 CD45+ 细胞向 TME 的浸润增加，从而引发肿瘤微环境的重塑 &#34;免疫冷&#34; 肿瘤微环境的形成 &#34;免疫热型&#34;.
目前生成cDC1的方案包括从外周血富集自体DC，或由CD34+ 造血祖细胞，或由多能干细胞分化而来14,15,16,17,18,19然而，这些方法存在一些限制因素：成熟度不足、抗原呈递能力降低以及细胞因子/趋化因子产生能力下降 体内，对免疫抑制的易感性、树突状细胞的高度异质性以及所产生细胞数量较少7在此，我们提供一种可实现cDC1样细胞规模化生成的实验方案 体内 用于功能与机制研究。
通过该方法，我们检测了转录因子组合 PU.1、IRF8 和 BATF3 的表达是否足以驱动 体内 重编程。该方案能够精确控制递送效率，因为改变直接植入的基因修饰细胞剂量会直接影响治疗效果。我们此前已证明，2%的转导细胞（相当于0.15% CD45）+ 和 MHC-II+ cDC1样细胞足以诱导抗肿瘤免疫反应20此外，第3天观察到的快速免疫细胞浸润表明，部分重编程的类似cDC1细胞具有功能活性。 体内，因为在此时间点并未观察到完全重编程的类cDC1细胞数量有显著增加。未来，利用携带自杀基因的改良载体，在特定时间点诱导特定细胞群体死亡，以探究部分重编程与完全重编程的类cDC1细胞在抗肿瘤效应中的功能差异，将十分有意义。24该方案还可用于探索与表观遗传佐剂联用，以提高重编程效率25最后，该方法也可用于制备其他树突状细胞亚型。 在体内，启动不同类型的免疫反应，例如抗病毒反应或耐受性反应14此外，我们可以利用 体内 将重编程作为一种平台，用于开展条形码筛选，以筛选转录因子组合来生成多种免疫细胞类型。这一可能性有望通过利用特定免疫细胞亚群的多样化功能特性，提高治疗策略的灵活性。
在我们之前的研究中，我们已证明免疫抑制的体内环境并不会阻碍将人类癌细胞重编程为具有免疫原性的cDC1细胞20。本文中，我们表明在小鼠中，体内重编程的速度和效率均高于体外，提示这种在体内增强的重编程现象在两个物种间具有保守性。然而，该方法的一个局限性在于初始载体递送过程中缺乏体内环境，因此无法判断环境信号是否影响体内递送效率。这一问题应通过比较不同递送体系在原位进行评估。我们已发现腺病毒载体在原位递送方面优于慢病毒载体20&#160;，未来可将其与非病毒递送体系进行比较，例如线性RNA、环状RNA、自我扩增RNA或小分子化合物组合26,27。
我们先前已证明，在黑色素瘤模型中，cDC1重编程可赋予癌细胞分泌促炎性细胞因子和招募淋巴细胞的趋化因子的能力，并实现MHC-I和MHC-II上的专业性抗原加工与呈递23,28这会导致肿瘤微环境（TME）从一种状态重塑为另一种状态 &#34;免疫冷&#34; 到一个 &#34;免疫富集型&#34; 通过诱导三级淋巴结构（TLS）形成，促进细胞毒性效应T细胞、NK细胞和B细胞的浸润，同时减少调节性T细胞和耗竭性T细胞等免疫抑制性细胞群体。20在患者中，对免疫治疗的积极反应与肿瘤内三级淋巴结构（TLS）的存在相关，此类结构可对肿瘤抗原持续启动T细胞和B细胞，从而产生针对肿瘤的特异性抗体应答29,30在未来，我们设想采用这种易于操作的 体内 cDC1重编程方案，用于揭示不同癌症类型中诱导三级淋巴结构新生、肿瘤微环境重塑及抗肿瘤免疫的机制，并鉴定是否刺激了肿瘤特异性抗体的产生。
我们此前观察到协同作用存在于 在体 cDC1重编程与抗PD-1或抗CTLA-4的免疫检查点阻断20。这表明 &#34;免疫富集型&#34; 由cDC1重编程所创造的肿瘤微环境可能为与其他免疫疗法（如过继性细胞治疗，包括T细胞受体-T细胞、嵌合抗原受体-T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞）的联合应用提供有利条件。该方法的另一优势在于可进行大规模无偏倚的组合筛选或CRISPR筛选，在耐药性肿瘤类型中对类cDC1细胞过表达或敲除免疫相关受体、细胞因子、趋化因子或淋巴毒素，从而揭示不同信号通路在增强cDC1介导的免疫应答中的作用。总之，本实验方案为广泛的科研群体提供了宝贵的资源，因为 体内 cDC1重编程是癌症免疫治疗中机制研究与治疗创新的灵活而强大的平台。

近年来，癌症免疫治疗手段取得了显著进展，包括免疫检查点阻断（ICB）、过继性细胞治疗（ACT）和疫苗等，这些进展已改变了癌症治疗的格局1。在黑色素瘤中，针对程序性死亡蛋白1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的抑制治疗反应率可达60%2。然而，仍有超过40%的黑色素瘤患者对ICB无反应，而在免疫原性较低的癌症（如乳腺癌、微卫星稳定型结直肠癌和胶质母细胞瘤）中，治疗反应率仍低于5%，凸显出当前临床治疗中的不足3,4,5。实现广泛临床疗效的主要障碍之一是细胞毒性T细胞应答的激活不足，而该应答依赖于肿瘤微环境（TME）中有效的抗原呈递6。
传统1型树突状细胞（cDC1s）虽稀少，但在启动肿瘤特异性免疫中不可或缺，可提供三种关键信号以启动T细胞应答：（1）在主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子上专业性地加工和呈递抗原；（2）通过CD80和CD86提供共刺激信号；（3）包括IL-12在内的促炎性细胞因子信号。7,8在树突状细胞（DC）亚群中，cDC1s 擅长将肿瘤细胞相关抗原交叉呈递给初始 CD8 T 细胞以启动其活化，或重新激活记忆 CD8 T 细胞+ T细胞或驱动CD4+ T细胞向1型辅助性T细胞（TH1) 细胞9此外，cDC1细胞是趋化因子C-X-C基序趋化因子配体9和10（CXCL9/10）的主要产生者，这些趋化因子介导T细胞向肿瘤组织的募集。10,11,12,13近年来，大量研究强调，肿瘤排斥以及对免疫检查点阻断（ICB）或过继性细胞治疗（ACT）的有效应答，与肿瘤内cDC1细胞的存在密切相关12,13因此，cDC1细胞已成为癌症免疫治疗的一个极具吸引力的靶点，成功利用其独特特性可能具有重要的转化潜力。
目前生成cDC1的方法基于血液分离或从CD34分化+ 前体细胞或多能干细胞14,15,16主要的临床策略依赖于从血液中分离出自体树突状细胞（DC）亚群的混合物，并对其进行刺激 离体 通过Toll样受体激动剂或促炎性细胞因子诱导成熟、具有免疫原性的程序，然后回输16然而，这些策略受到细胞成熟度差、肿瘤微环境中的免疫抑制屏障以及输注的树突状细胞混合物中细胞亚群异质性的限制，其中仅有一小部分为cDC1细胞7此外，由于cDC1s在外周血中数量极低，将其单独分离用于癌症免疫治疗或疫苗接种具有较大挑战性（&#60;0.3%)16此外，cDC1 可由 CD34 产生+ 使用细胞因子和NOTCH信号通路从祖细胞或诱导性多能干细胞诱导分化。然而，这些方法需要复杂的长期操作流程，且获得的树突状细胞亚群数量较少且具有异质性17,18,19.
为了解决这些局限性， 体内 重编程为癌症免疫治疗提供了一种合适的策略，可生成类似cDC1的细胞，这些细胞在表型、转录及功能特性上均类似于cDC1细胞20通过过表达cDC1特异性的最小基因调控网络——PU.1、IRF8和BATF3（统称为PIB），成纤维细胞、基质细胞和癌细胞被逐步重编程为类似cDC1的细胞，能够进行肿瘤抗原在MHC I类和II类分子上的加工与呈递，通过CD80和CD86提供共刺激信号，并分泌包括CXCL9/10和IL-12在内的细胞因子和趋化因子20,21,22,23cDC1 重编程在人类异种移植瘤中进展更快且效率更高 体内 且独立于免疫抑制，生成具有成熟免疫原性特征的类似cDC1细胞20在同基因型黑色素瘤肿瘤中，我们观察到 cDC1 样细胞重塑了其肿瘤微环境（TME），诱导三级淋巴结构（TLS）的形成，并招募和扩增了多克隆 T 细胞H1 以及细胞毒性记忆T细胞，从而诱导长期的系统性免疫20最后，我们开发了一种基于 原位 通过瘤内注射腺病毒载体将癌细胞重编程为类cDC1细胞20这些发现为将cDC1重编程作为一种新型癌症免疫治疗策略的临床转化铺平了道路，该策略可利用cDC1的功能特性。
在此，我们提出一种可操作的方案，基于肿瘤微环境（TME）中生成类似cDC1细胞的方法 体内 cDC1重编程。通过慢病毒将PIB递送至癌细胞，随后将转导的癌细胞与未转导的亲本癌细胞按特定比例混合并植入，可实现 体内 在肿瘤微环境（TME）内对受控比例的癌细胞进行重编程。此外，该方法不受以下因素限制 原位 病毒载体的递送效率20我们概述了高效慢病毒载体生产、功能滴定的步骤以及 体内 以同源性黑色素瘤模型 YUMM1.7 为例的 cDC1 重编程。我们详细描述了实验设计及用于分析的设门策略 体内 通过流式细胞术在肿瘤解离后对重编程的类cDC1细胞进行分析。我们还提供了评估肿瘤微环境（TME）变化的步骤，包括肿瘤组织的冷冻保存、切片及免疫荧光染色，随后进行共聚焦显微镜观察。最后，我们阐述了如何通过监测肿瘤生长和生存情况来评估cDC1诱导的免疫反应。该方法具有良好的可操作性和可扩展性，为研究人员提供了一种评估联合治疗策略的有力工具 体内 cDC1重编程，用于表征不同癌症模型中肿瘤微环境及三级淋巴结构新生的变化，或开展大规模筛选以调控多种免疫通路（例如抗原呈递或细胞因子/趋化因子分泌）的表达，并揭示其对抗肿瘤免疫的影响。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;mu;m 低蛋白结合滤膜，150 mL 瓶顶真空过滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>15983297</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 单克隆抗体（克隆：30-F11），大鼠 IgG2b，&amp;kappa;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl（CD45.1）</td><td>杰克逊实验室</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD Micro-Fine U-100 胰岛素注射器（0.5 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11395751</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon 细胞筛（适用于 50 mL 离心管）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS352340</td><td></td></tr><tr><td>Corning 盖玻片 24 × 50 mm&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 可固定活力染料 eFluor 450</td><td>Invitrogen</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 免疫组化抗原修复液 - 低 pH（10×）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4955-58</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片介质</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体 [Alexa Fluor 594]</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-308AF594</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM/F-12 营养混合物（DMEM/F-12）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM 非必需氨基酸溶液（100×）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 丙酮酸钠（100 mM）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 台盼蓝溶液，0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，多克隆，Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>六亚甲基溴化物（Polybrene）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>Cytiva</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 青霉素-链霉素溶液（100×）（Pen/Strep）</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Cytiva</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮注射液（100 mg/mL）</td><td>MSD 动物健康瑞典公司</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片 - C35</td><td>pfm medical</td><td>207500005</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD45.2（104），表面标记，APC，单克隆</td><td>Biolegend</td><td>109814</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 MHCII（M5/114.15.2），表面标记，PE-Cy7，单克隆</td><td>Biolegend</td><td>107630</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>正常大鼠血清（无菌）</td><td>Abcam</td><td>ab7488</td><td></td></tr><tr><td>敞口薄壁聚丙烯管</td><td>贝克曼库尔特生命科学</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，16% w/v 水溶液，无甲醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>043368.9M</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Batf3，编码小鼠 Batf3 的单顺反子表达盒</td><td>Addgene</td><td>139837</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Irf8，编码小鼠 Irf8 的单顺反子表达盒</td><td>Addgene</td><td>139838</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-Pu.1，编码小鼠 Pu.1 的单顺反子表达盒</td><td>Addgene</td><td>139839</td><td></td></tr><tr><td>质粒 pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>质粒 psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>质粒 SFFV-eGFP（eGFP）</td><td>实验室内部克隆</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>质粒 SFFV-mCherry（mCherry）</td><td>实验室内部克隆</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>质粒 SFFV-PIB-eGFP，&amp;nbsp; 编码小鼠 PU.1、IRF8 和 BATF3（PIB）的多顺反子表达盒&amp;nbsp;</td><td>实验室内部克隆</td><td>-</td><td>用于重编程的质粒和载体可通过与 Asgard Therapeutics 公司签订材料转让协议获取</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI），线性，分子量 25000，转染级</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>ReadyProbes 防水屏障标记笔</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R3777</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 黏附载玻片</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1×），无酚红</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>TT Cryomold 中号方模（15 × 15 × 5 mm）</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪注射液（20 mg/mL）</td><td>VM Pharma</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr><tr><td>YUMM1.7 细胞</td><td>Antineo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

可操作的 体内 将肿瘤细胞重编程为类似1型传统树突状细胞的细胞

Tractable In Vivo Reprogramming of Tumor Cells to Type 1 Conventional Dendritic Cell-like Cells

癌症免疫治疗的疗效依赖于1型传统树突状细胞（cDC1s）对实体瘤的细胞毒性T细胞反应的募集与激活。然而，用于癌症免疫治疗的cDC1s制备面临诸多限制，包括细胞产量低、功能异质性以及在肿瘤微环境（TME）中易受免疫抑制的影响。我们近期开发了一种基于 体内 将肿瘤细胞重编程为具有免疫原性的类似cDC1的细胞，使肿瘤细胞能够像cDC1细胞一样呈递肿瘤抗原，从而激发多克隆细胞毒性T细胞反应并产生持久的系统性抗肿瘤免疫。本文介绍一种可行的实验方案：通过在肿瘤细胞中过表达最小的cDC1特异性基因调控网络——PU.1、IRF8和BATF3（ collectively referred to as PIB），在肿瘤微环境（TME）内生成类似cDC1的细胞，随后皮下植入经转导的细胞与亲本细胞的混合物。PIB的过表达促使肿瘤细胞逐步获得造血标志物CD45以及专业的抗原呈递复合物MHC II类分子，这些分子可作为细胞表面的检测指标 体内 cDC1 重编程。与重编程过程相比 体外 YUMM1.7小鼠黑色素瘤模型的重编程 体内 表现出更快的动力学特性和更高的效率。cDC1样细胞在前3天内通过募集宿主免疫细胞，迅速重塑肿瘤微环境（TME），并在第9天时促进三级淋巴结构的形成。重编程的cDC1样细胞在肿瘤中至少存留9天，但在第15天时未被检测到。 体内 此处描述的cDC1重编程方案提供了一种可行且稳健的方法，可有效将“免疫冷”肿瘤转化为“免疫热”肿瘤。总体而言，该方案为研究cDC1介导的抗肿瘤免疫机制以及探索其与其他癌症免疫治疗方式的协同组合提供了强有力的平台。

可处理系统的示意图概述 体内 重编程方案如下所示 图1. 首先，我们构建了编码cDC1诱导性重编程因子PU.1、IRF8和BATF3的多顺反子慢病毒载体SFFV-PIB-IRES-eGFP（PIB-eGFP），其后接内部核糖体进入位点（IRES）和增强型绿色荧光蛋白（eGFP），并在HEK 293T包装细胞系中进行生产。为排除慢病毒本身可能引起的免疫原性影响，我们同时构建了对照用的空载体SFFV-MCS-eGFP（eGFP），该载体包含多克隆位点（MCS）和IRES-eGFP，但不含有上述重编程因子。病毒生产完成后，收集含病毒的上清液，并通过超速离心进行浓缩。随后对病毒进行功能滴定，以确定实现转导细胞（eGFP阳性）与非转导细胞比例为1:1所需的病毒用量+）至未转导（eGFP-) 细胞，我们在转导后第3天对其进行评估。随后，利用所得病毒量在第-1天转导选定的癌细胞系。24小时后，收集细胞并将其皮下植入以建立肿瘤。该策略确保了转导的细胞重编程为类似cDC1的细胞 体内，于移植后的指定时间点，我们切除肿瘤并进行后续分析，包括对解离的肿瘤细胞进行流式细胞术，以定量分析 体内 重编程效率，或对冷冻保存的肿瘤切片进行免疫荧光染色以表征肿瘤微环境（TME）中的变化。
首先，为了确保产生高滴度的慢病毒，我们在转染前监测了HEK 293T细胞，使其达到70–80%的融合度，并在转染24小时后通过荧光显微镜观察eGFP表达情况以评估转染效率（图2A）。接着，我们在转染后48小时和60小时收集含病毒的培养基，进行超速离心，并将病毒分装后储存于-80 °C（图2B）。然后，我们确定了在YUMM1.7黑色素瘤细胞中实现eGFP+与eGFP-细胞1:1比例所需的最适病毒感染量。将105个YUMM1.7细胞接种于6孔板的每个孔中，用逐渐增加体积的慢病毒感染细胞，并在24小时后将含病毒的上清液更换为新鲜的DMEM/F12完全培养基（图2C）。在第3天，我们首先通过荧光显微镜检测eGFP的表达，随后通过流式细胞术精确量化eGFP+细胞的比例（图2C）。为了量化eGFP+与eGFP-细胞的比例，我们设门选取活的单细胞群体，以排除死细胞和双联体细胞（图2D）。最终确定所制备的慢病毒批次中，PIB-eGFP病毒和对照eGFP病毒的最适感染体积均为每105个YUMM1.7细胞使用2 µL，分别导致eGFP+细胞比例为50.0 ± 0.3%和63.0 ± 0.9%（图2E）。
接下来，为了评估 体内 重编程效率，我们构建了一个荧光标记（mCherry）+) 癌细胞系（YUMM1.7-mCherry）。这使得我们能够通过活细胞中mCherry的信号设门，以区分癌细胞与基质细胞或免疫细胞+ 流式细胞术分析中的细胞（图3A，B）。随后，我们用每10⁵个YUMM1.7-mCherry细胞加入2 µL PIB-eGFP病毒或对照eGFP病毒进行转导5 细胞以实现1:1的eGFP+ eGFP- 比例。我们皮下植入了1.6 × 106 每只CD45.1小鼠肿瘤中的细胞数，并保留部分细胞用于培养 体外 用于比较。我们通过流式细胞术评估重编程效率，圈选活的 mCherry+ eGFP+ 和 CD45.1- 细胞，以排除已吞噬 eGFP 或 mCherry 的宿主免疫细胞（图3B）。从第1天到第9天，我们观察到CD45.2和/或MHC-II表达的逐步获得，标志着部分重编程的类似cDC1细胞（CD45.2+ MHC-II- 或 CD45.2- MHC-II+）以及完全重编程的类cDC1细胞（CD45+ MHC-II+) (图3C）。我们验证了小鼠癌细胞的重编程 体内 第9天时，cDC1样细胞的比例高于 体外 条件（9.54 ± 1.54% CD45+ MHC-II+ 体内 vs. 4.72 ± 1.1 % CD45+ MHC-II+体外，P = 0.018）。重编程的动力学过程也得到加速，早在第4天即可观察到更高比例的类似cDC1细胞（8.7 ± 3.3% CD45+ MHC-II+体内 vs. 0.3 ± 0.1% CD45+ MHC-II+体外，P = 0.05），表明环境信号的存在可促进向类似cDC1细胞的更快且更高效的重编程19。尽管 体外 重编程的类cDC1细胞持续存在至第15天， 体内 cDC1样细胞持续存在9天，但在第15天时未被检测到，提示其被宿主免疫系统从肿瘤微环境中清除（图 3C).
最后，我们旨在表征肿瘤微环境（TME）在早期发生的变化 体内 前9天内cDC1的重编程。我们对表达eGFP和PIB-eGFP的肿瘤组织在冷冻保存并切片后，分别于第3天和第9天进行了免疫荧光染色 体内 重编程，重点关注表达泛造血细胞标记物CD45的免疫细胞浸润。值得注意的是，与表达eGFP的肿瘤相比，cDC1样细胞在第3天即可显著促进更多CD45阳性细胞浸润至肿瘤微环境（每肿瘤区域CD45染色的平均荧光强度：49.6 ± 17.0 vs. 8.0 ± 5.8）。 图 4A，B）。有趣的是，我们在肿瘤治疗9天后于肿瘤微环境（TME）中检测到了TLS。 体内 重编程。这表明cDC1样细胞可在3天内迅速将肿瘤微环境（TME）从“免疫冷”状态重塑为“免疫热”状态，继而于第9天诱导三级淋巴结构（TLS）的形成。
<img alt="Polycystronic lentiviral vector experiment diagram; cell transduction, reprogramming, tumor analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig1.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Figure 1"> 
图1生成类cDC1细胞的方案概述 体内 癌细胞重编程 慢病毒载体 SFFV-PIB-IRES-eGFP 编码 PU.1、IRF8 和 BATF3，其多顺反子表达盒受脾灶形成病毒启动子（SFFV）调控，eGFP 位于内部核糖体进入位点（IRES）之后，用于通过流式细胞术和荧光显微镜追踪转导细胞——该载体在 HEK 293T 包装细胞系中生产。随后，慢病毒载体经超速离心浓缩并进行功能滴定，以确定以 1:1 比例转导癌细胞所需的病毒量+ 未转导的 eGFP- 细胞。对于 体内 重编程实验中，于第-1天将癌细胞以最佳量的慢病毒感染进行铺板。次日，将转导了GFP的细胞以1:1比例混合+ 和未转导的GFP- 细胞经洗涤后收集，用于在小鼠中建立皮下肿瘤。平行 体外 在第3天通过流式细胞术验证转导效率并维持培养。每2至3天监测动物的肿瘤生长情况和存活率。在预定时间点收集肿瘤组织，解离后进行表面标志物染色，用于流式细胞术分析。 alternatively，将完整组织固定、冷冻保存并切片，用于免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析。 体内 通过流式细胞术分析评估重编程效率，同时利用共聚焦成像表征肿瘤微环境的变化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Lentivirus production in HEK 293T cells, chart showing transfection and ultracentrifuge steps." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig2.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Figure 2"> 
图2：慢病毒的制备与功能滴定 体内 cDC1重编程 （A） 当 HEK 293T 细胞融合度达到约 70–80% 时，使用转染混合物进行转染，混合物包含 10 µg 转移质粒 SFFV-PIB-eGFP（PIB-eGFP）或空载慢病毒对照质粒 SFFV-eGFP（eGFP），以及 7.5 µg psPAX2、2.5 µg mPD2.G 和 60 µL 1 mg/mL PEI。转染后 24 小时拍摄 HEK 293T 细胞的明场与荧光显微镜图像，显示 eGFP 表达，表明质粒成功递送。比例尺 = 200 µm。 （B） 浓缩慢病毒的超速离心工作流程示意图。转染后48小时和60小时收集含慢病毒的HEK 293T细胞上清液，经0.45 µm低蛋白结合PES滤膜过滤后，使用台秤称取37 g于开口薄壁聚丙烯管中。将管子置于摆动桶转子中进行超速离心，吸除上清液后将沉淀在室温下干燥5分钟。随后将沉淀重悬于冰上预冷的含HEPES的DMEM培养基中，4°C孵育过夜，分装后于-80 °C保存。 (C) 功能滴定实验策略，用于确定实现GFP+与GFP-细胞1:1比例的最佳病毒感染剂量。转导72小时后YUMM1.7黑色素瘤细胞中eGFP表达的明场与荧光显微镜图像，显示重编程因子及eGFP成功递送。比例尺 = 100 µm。 (D) 代表性流式细胞术图示，展示用于定量 eGFP 比例的设门策略+ 细胞。活细胞通过排除死细胞染料（DAPI）阳性群体进行门控，随后排除双联体。 (E) 流式细胞术定量分析不同病毒剂量下的转导效率，以确定实现1:1 GFP的最适体积+/GFP- 细胞。对于 PIB-eGFP 和 eGFP 慢病毒，每 105 细胞达到预期比例。缩写：cDC1s = 1型传统树突状细胞；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PIB = PU.1、IRF8 和 BATF3；PEI = 聚乙烯亚胺。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="In vivo cDC1 reprogramming, flow cytometry analysis; involves PIB-eGFP, CD45.1 mice; charts." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig3.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Figure 3"> 
图3评估 体内 cDC1重编程效率 (A) 体内cDC1重编程效率评估实验流程示意图。首先将癌细胞用表达mCherry的慢病毒感染，以生成荧光标记的细胞系（YUMM1.7-mCherry），随后在第-1天以优化剂量的PIB-eGFP慢病毒进行二次感染。之后将细胞以eGFP与mCherry标记细胞1:1的比例皮下注射+/eGFP- 第0天将细胞植入CD45.1小鼠以建立肿瘤，并使PIB转导的细胞在肿瘤微环境（TME）中重编程为类似cDC1的细胞。随后在指定时间点分离肿瘤组织，进行消化处理，并通过流式细胞术对CD45.1、CD45.2和MHC-II进行染色检测。由此可排除CD45.1宿主来源的免疫细胞，从而定量分析 体内 通过表达 CD45.2 和 MHC-II 评估 cDC1 重编程效率。平行实验 体外 在各个时间点均保留培养物作为对照 体内 重编程 （B） 代表性流式细胞术图示，展示第9天的设门策略。细胞根据mCherry进行设门+ 和GFP+ 以鉴定成功转导的癌细胞。通过排除CD45.1标记物来排除宿主免疫细胞。+ 细胞 (C) 定量分析 体内 重编程效率（左侧）通过流式细胞术检测YUMM1.7-mCherry细胞中CD45阳性细胞的百分比+ MHC-II+ 细胞（完全重编程）和CD45.2+ HLA-DR- 或 CD45.2- HLA-DR+ cDC1样细胞（部分重编程）在eGFP门控内+ mCherry+ 细胞。代表性流式细胞术图谱（右）显示，在指定时间点，经PIB-eGFP转导的YUMM1.7-mCherry细胞中CD45.2和MHC-II表达的逐步获得情况。以eGFP转导的YUMM1.7-mCherry细胞作为对照 体外 重编程的类cDC1细胞被用于比较。(数据见于)C) 表示 3 至 5 次生物学重复实验的均值 ± 标准差。( 中的统计分析C对 CD45 进行了检测+ MHC-II+ 使用Mann-Whitney检验对细胞进行分析。*P &lt; 0.05。缩写：cDC1s = 1型传统树突状细胞；PIB = PU.1、IRF8 和 BATF3；TME = 肿瘤微环境。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Tumor microenvironment remodeling: fluorescence microscopy of eGFP, CD45; analysis chart included." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68739/68739fig4.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Figure 4"> 
图4：分析肿瘤微环境中的免疫浸润 体内 cDC1重编程。（A） 代表性共聚焦图像显示 CD45+ 皮下植入PIB-eGFP或对照eGFP转导细胞（转导细胞与亲本细胞比例为1:1）后第3天和第9天YUMM1.7肿瘤中的细胞。比例尺＝500 µm。 （B） PIB处理组与对照组eGFP转导的YUMM1.7肿瘤在第3天和第9天CD45染色MFI的定量分析。(数据见B) 表示 3 至 6 次生物学重复实验的平均值 ± 标准差。( 中的统计分析B) 采用 Mann-Whitney 检验进行分析。*P &lt; 0.05 和 ***P &lt; 0.001. 缩写：cDC1s = 1型传统树突状细胞；PIB = PU.1、IRF8和BATF3；MFI = 平均荧光强度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68739/68739fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了 体内 通过强制表达转录因子 PU.1、IRF8 和 BATF3，在肿瘤微环境中将小鼠癌细胞重编程为类似 1 型树突状的细胞。

癌症免疫治疗的疗效依赖于1型传统树突状细胞对实体瘤细胞毒性T细胞反应的募集与激活

我们研究在体内将癌细胞重编程为类似cDC1细胞的新型免疫治疗策略。旨在确定该方法是否可将免疫冷肿瘤转化为免疫热肿瘤，从而激发抗肿瘤免疫反应。针对现有体内生成cDC1策略的局限性，我们提出一种直接在肿瘤内将癌细胞转化为具有免疫原性的类似cDC1细胞的实验方案，以实现在原位研究由cDC1驱动的免疫应答。我们可操作的体内编程方案能够稳定地生成成熟的具有免疫原性的类似cDC1的细胞，克服了肿瘤微环境的抑制作用。由于这些细胞直接在体内生成，该方法避免了体外免疫细胞制备的需求。我们的研究结果为将转录因子介导的体内重编程技术转化为临床应用奠定了基础，提出了一种即用型但又个性化的癌症免疫疗法，可诱导持久的抗肿瘤免疫应答。未来，我们正在探究cDC1样细胞重编程是否能够促进三级淋巴结构及支持性基础设施的形成，以及这种效应是否可转化为体液免疫应答。此外，我们还在探索其与其他免疫治疗策略的潜在协同作用。首先，将 HEK 293T 细胞培养至融合度达到 70% 至 80%。接着，将含有转移质粒的转染混合物充分涡旋振荡 1 分钟，然后在室温下孵育 15 分钟，以促进 DNA-脂质复合物的形成。吸出 HEK 293T 细胞的培养基，加入 10 毫升不含青霉素-链霉素但添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基。然后将转染混合物逐滴加入 150 毫米培养皿中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。孵育结束后，更换为 20 毫升完全 DMEM 培养基（补充 1 毫摩尔的丁酸钠），并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下继续孵育细胞 24 小时。随后，在转染后48小时和60小时，将含有慢病毒的上清液收集至50毫升锥形管中。第一次收集后，每块150毫米培养板加入12毫升预热的完全DMEM，用于第二次收获。使用0.45微米低蛋白结合聚醚砜滤器过滤收集的液体。用移液器将37克含慢病毒的培养基加入38.5毫升开口薄壁聚丙烯管中。将管子置于摆桶转子中，在4摄氏度下以25,000 G离心90分钟。离心后，吸除上清液，注意不要扰动沉淀。将开口的薄壁聚丙烯管倒置在实验室擦拭纸或类似的吸水材料上五分钟，以去除多余的液体并干燥沉淀。接着，向每个沉淀中加入 200 µL 冰冷的含 HEPES 的 DMEM 或 PBS，并将混合物转移至置于 50 mL 锥形管中的微量离心管内。将沉淀在 4 °C 下孵育过夜，以确保完全重悬。将所有重悬的沉淀合并至一个容器中，将病毒原液分装为50至200微升的小体积 aliquot，并于-80摄氏度保存以长期使用。在癌细胞扩增后，制备细胞悬液用于转导，以在第3天达到EGFP阳性细胞与EGFP阴性细胞接近1:1的比例。向细胞悬液中加入8微克/毫升的polybrene，随后加入先前确定的适量慢病毒。轻轻混匀内容物，避免产生气泡。现在，将含有1×10⁵个细胞的2毫升制备好的细胞悬液移入6孔组织培养板的每个孔中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。24小时后，从每个孔中移除含有慢病毒的培养基。用 PBS 洗涤孔板两次。每孔加入 500 µL 胰蛋白酶，于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 5 至 10 分钟。随后在光学显微镜下观察各孔，以确认细胞已完全从培养板上脱离。然后，使用完全培养基将细胞收集到50毫升锥形管中。在350 ×g 条件下离心5分钟，使细胞沉淀。用PBS洗涤沉淀。取一份等分试样，使用血细胞计数板和台盼蓝染色法评估活细胞数量。随后，将最终的细胞沉淀重悬于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，调整细胞浓度至每毫升2×10⁷至4×10⁷个细胞，相当于每50微升肿瘤接种液中含有1×10⁶至2×10⁶个细胞。将细胞置于冰上，并转移至动物实验区域。麻醉 CD45.1 小鼠后，将其置于加热垫上以防止低体温。涂抹眼膏以防止小鼠在麻醉期间发生眼部脱水。使用剃刀剃除小鼠右侧 flank 区域的毛发。可选地，使用耳标钳对小鼠进行标记。用70%乙醇浸湿的棉签对剃毛区域进行消毒，并清除残留的毛发。然后，使用P1000移液器充分重悬癌细胞。将完全重悬的细胞悬液加入一支配有30号针头的0.5毫升注射器中。用两根手指轻轻提起小鼠脱毛后侧腹部的皮肤，将注射器针头插入抬起皮肤所形成的褶皱中。在用一只手固定注射器的同时，松开提起的皮肤。用另一只手的两个手指拉伸皮肤顶部。缓慢注射 50 µL 癌细胞悬液，使注射部位形成可见的椭圆形皮下肿胀。注射操作完成后，监测动物直至其从麻醉状态完全苏醒，以确保存活。转染SFFV-PIB-eGFP质粒的HEK 293T细胞在转染后24小时显示出清晰的eGFP表达，证实质粒递送成功。转导72小时后，黑色素瘤细胞表明重编程因子和eGFP成功递送。细胞植入后第九天，体内重编程产生的完全重编程的CD45阳性、MHC-II阳性、类似cDC1的细胞比例高于体外条件。植入后第三天，PIB-eGFP 肿瘤中 CD45 阳性免疫细胞的浸润程度明显高于 eGFP 对照组，表明早期免疫重塑的发生。至第九天时，PIB-eGFP 肿瘤每单位肿瘤区域的 CD45 平均荧光强度仍显著高于对照组。到第九天时，PIB-eGFP 肿瘤中可检测到三级淋巴结构的形成，提示肿瘤微环境中发生了结构性的免疫改变。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

肿瘤细胞可处理的 体内 重编程为 1 型常规树突状细胞样细胞

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内...

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

本视频展示了一种用于体外生成肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将携带转基因RNA的逆转录病毒载体与脾细胞混合，置于添加白细胞介素-2的培养基中，以促进T细胞的存活与增殖。随后将混合物转移至包被有重组人纤维连接蛋白片段的培养板中，并进行离心，以促进病毒与细胞的融合，从而使RNA整合到宿主基因组中，并表达可靶向肿瘤抗原的细胞表面结合型CAR。...

一种体外生成肿瘤特异性嵌合抗原受体T细胞的技术

本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。...

用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

在同源免疫活性宿主中评估，基于肿瘤干细胞（CSC）的树突状细胞（DC）疫苗相较于使用异质性整体肿瘤细胞致敏的传统DC疫苗，显示出显著更强的抗肿瘤免疫反应。...

利用黑色素瘤和鳞状细胞癌干细胞生成一种新型树突状细胞疫苗

我们介绍一种用于监测非黏附性免疫细胞径向迁移能力的实验方案 体外 使用细胞沉降多联管/载玻片装置，在肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白上追踪细胞迁移。通过明场显微镜和荧光显微镜观察，可评估细胞运动性及细胞毒性功能。...

逆转录病毒复制载体转导的非黏附性同种反应性T淋巴细胞的径向迁移能力与细胞毒性功能

不同的树突状细胞亚群作为稀有群体存在于淋巴器官中，因此难以分离出足够数量和高纯度的细胞用于免疫学实验。本文介绍一种高效、高产量的方法，用于分离目前所知的所有小鼠脾脏树突状细胞主要亚群。...

一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

本实验方案的目的是展示将黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方法。...

由人黑色素瘤肿瘤浸润性淋巴细胞生成诱导性多能干细胞

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本文介绍了一种基于流式细胞术的体内杀伤实验方法，可用于研究细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对模型肿瘤抗原应答中的免疫优势现象。我们提供了该精巧实验方法在机制研究和药物疗效评估中应用的示例。...

定制体内细胞毒性实验以研究肿瘤特异性CD8+ T细胞应答中的免疫显性

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ+单阳性T细胞的方法。...

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

学习将小鼠肿瘤细胞在体内重编程为1型常规树突状细胞样细胞的方法，通过表达PU.1、IRF8和BATF3转录因子，将免疫冷肿瘤转化为免疫热肿瘤，从而增强抗肿瘤免疫反应。

可操作的体内将肿瘤细胞重编程为类似1型传统树突状细胞的细胞

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