Name: 从小鼠卵母细胞制备减数分裂染色体扩散，用于评估突触和重组 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解VISHAM-KG多模态知识图谱框架的设计与实现方法。该框架整合多种数据源以增强知识表示和检索能力，为神经科学和数据科学研究提供可视化支持。

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本项目获得了尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（HD112986，授予 TH）K99 奖项的资助。

所有动物操作和实验程序均经康奈尔大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循第2004-0063号协议进行。
1. 卵母细胞第一次减数分裂前期染色体铺片的制备
<ol>
	<li>在傍晚时分，将 C57BL/6J 雌性小鼠（2 - 6 月龄）与雄性小鼠（2 - 12 月龄）进行定时交配。从次日起，每天早晨（上午 9 点前）检查雌鼠是否出现交配栓。发现交配栓当天的中午定义为 0.5 天妊娠期（dpc）。</li>
	<li>在处死妊娠小鼠前，完成以下准备工作：
	<ol>
		<li>准备一个内含室温 H2O 的湿化室。</li>
		<li>配制 10 mL 低渗提取缓冲液（HEB；见表 1），其中包含 30 mM Tris-HCl、50 mM 蔗糖、17 mM 柠檬酸钠、5 mM EDTA、2.5 mM DTT 和 0.5 mM PMSF，溶剂为 Milli-Q 水。在加入 DTT 和 PMSF 前，使用 50 mM 硼酸将 pH 调至 8.2 - 8.4。HEB 需现配现用，并在加入 DTT 后 2 小时内使用。</li>
		<li>将 342 mg 蔗糖溶于 10 mL 超纯 H2O 中，配制成 100 mM 蔗糖溶液。不使用时置于 4 °C 保存。</li>
		<li>将超纯 H2O 在普通微波炉中加热 1 分钟（至 90 - 95 °C）。在通风橱中，将加热后的超纯 H2O 加入 0.5 g 多聚甲醛（PFA）中，加入两滴 1 N NaOH，涡旋混匀后冷却至室温。用 50 mM 硼酸将 pH 调至 9.2 - 9.3，并加入 Triton X-100 至终浓度 0.15 %（v/v）。用超纯 H2O 定容至 50 mL（即 1% PFA 固定液），将固定液倒入 50 mL 玻璃 Coplin 染色缸中。 
		注意：本方案优化时使用接近沸腾的水配制 PFA；但需注意，将 PFA 溶液加热至 65 °C 以上可能导致其降解并释放有毒气体。也可选择在水浴中将超纯 H2O 预热至 60 °C。</li>
		<li>用 70% 乙醇清洁载玻片。使用疏水屏障 PAP 笔在载玻片上画出最多三个方格（每个约 20 × 20 mm；见图 1E）。一对卵巢提供的材料足以制备六个方格（即两张载玻片，每张三个方格）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据 IACUC 指南，通过 CO2 窒息联合颈椎脱位法处死 14.5 - 18.5 dpc 的妊娠小鼠。
	<ol>
		<li>图 1A 列出了 C57BL/6J 小鼠减数分裂前期 I 各阶段富集的最佳时间点。根据 Evans 等（1982）31 的数据，提供了各发育时间点处于减数分裂前期 I 各阶段的卵母细胞大致比例。获取偶线期卵母细胞选择 16.5 dpc；早粗线期选择 17.5 dpc；中粗线期至双线期选择 18.5 dpc。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用解剖剪刀打开腹腔，取出子宫角。</li>
	<li>从子宫角、蜕膜组织和卵黄囊中分离出胎鼠，并将其置于盛有 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的 100 mm 培养皿中。</li>
	<li>每次解剖一只雌性胎鼠的卵巢，其余胎鼠保持在 1× PBS 中。根据 IACUC 指南，通过断头法处死胎鼠。使用不锈钢标本针将胎鼠躯干腹面朝上固定在解剖盘的硅胶垫上。</li>
	<li>使用显微解剖剪刀在脐下方做腹部切口，注意避免损伤动脉。用精细镊子移开肠道，直至可见胎鼠的子宫角。</li>
	<li>为定位卵巢，从膀胱处沿每侧子宫角向外追踪至肾脏。卵巢和输卵管表现为子宫角末端的小球状结构，位于肾脏下方，靠近腹膜腔后部（图 1B）。</li>
	<li>用精细镊子夹取卵巢，并将其收集至盛有 750 µL 1× PBS 的小表玻璃皿中。</li>
	<li>将卵巢从周围组织中分离出来，将两侧卵巢放入盛有 750 µL HEB 的表玻璃皿中，注意确保卵巢完全浸没（见图 1C 和 1D）。室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>用移液器将 35 µL 100 mM 蔗糖溶液滴加至凹面载玻片上。用精细镊子将两侧卵巢从 HEB 中转移至蔗糖溶液中。</li>
	<li>用 25G 针头固定一侧卵巢，同时用另一支针头（斜面朝下）轻压卵巢以挤出卵母细胞。
	<ol>
		<li>当卵巢变得透明且呈胶状时，将其从 HEB 中取出，并对另一侧卵巢重复此操作。轻轻吹打溶液以分散细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片浸入盛有 PFA 的 Coplin 染色缸中，然后轻轻将玻片边缘在纸巾上轻拍。当 PFA 溶液在每个方格的疏水边界内聚集成小液滴时（图 1E），用移液器将 5 µL 卵母细胞-蔗糖混合液加入每个 PFA 液滴中。</li>
	<li>通过轻轻前后倾斜载玻片，使卵母细胞均匀分布在方格区域内。注意避免任一方格中的溶液溢出至相邻方格。</li>
	<li>将载玻片放入湿化室中，继续制备其他载玻片，直至&#160;卵母细胞-蔗糖混合液用尽。</li>
	<li>重复步骤 1.6 - 1.15，直至所有雌性胎鼠均被使用。将载玻片置于湿化室中，室温孵育 2 小时。</li>
	<li>孵育结束后，打开湿化室。由于大多数（或全部）液体/固定液仍保留在载玻片表面（每个方格区域约 10 µL），将载玻片轻轻转移至纸巾上，在实验台室温下完全自然晾干（通常需 30 - 60 分钟，具体时间取决于局部湿度）。 
	注意：也可在通风橱中晾干载玻片，以减少对残留 PFA 气体的暴露风险，此方法可将干燥时间缩短至约 20 - 30 分钟。</li>
	<li>将载玻片在含 0.4% 润湿剂的超纯 H2O 中洗涤 2 分钟。待载玻片完全干燥。 
	注意：此时载玻片可于 -80 °C 保存；但某些抗原表位不稳定（例如，据我们经验，MLH1 染色效果差，SYCP3 染色在冻存后会出现明显假象）。强烈建议立即进行免疫染色。</li>
</ol>
2. 前期 I 染色体铺片的免疫荧光染色
<ol>
	<li>配制10倍抗体稀释缓冲液（ADB；见表2），其中包含10% (v/v) 正常山羊血清、3% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）和0.05% Triton X-100，溶于1×PBS中。使用0.45 µm滤膜过滤除菌，并于4 °C保存，最多可保存2周。</li>
	<li>将载玻片置于含0.4%润湿剂的1×PBS Coplin染色缸中洗涤10分钟。再将载玻片置于含0.1% Triton X-100的1×PBS Coplin染色缸中洗涤10分钟。最后将载玻片在1×ADB的Coplin染色缸中封闭10分钟。</li>
	<li>将所选的一抗用10×ADB稀释（抗体列表及其相应稀释比例见材料表）。
	<ol>
		<li>为多重免疫染色准备四种抗体组合：(1) SYCP332,33、SYCP133、HORMAD133；(2) SYCP332,33、RAD5132,33、MLH332；(3) SYCP332,33、MSH432、MLH332；以及(4) SYCP334、MLH132,33,34、CREST35。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从ADB中取出载玻片，轻拍去除多余液体，将载玻片放入盛有室温水的湿盒中。每张载玻片的每个方格区域加30 µL稀释后的一抗，注意避免抗体从一个方格溢出至相邻方格。</li>
	<li>盖上湿盒，于室温孵育过夜。</li>
	<li>次日早晨打开湿盒，轻拍去除载玻片上的稀释抗体。重复步骤&#160;2.2。</li>
	<li>将所选的二抗用10×ADB稀释（见材料表）。 
	注意：自此步骤起，载玻片和抗体均对光敏感。所有后续孵育操作均需在避光条件下进行。</li>
	<li>从ADB中取出载玻片，轻拍去除多余液体，将载玻片放入盛有室温水的湿盒中。每张载玻片的每个方格区域加30 µL稀释后的二抗，注意避免抗体从一个方格溢出至相邻方格。</li>
	<li>盖上湿盒，于室温孵育2小时。</li>
	<li>将载玻片在含0.4%润湿剂的1×PBS Coplin染色缸中洗涤3次，每次5分钟。随后在含0.4%润湿剂的超纯H2O Coplin染色缸中洗涤5分钟。</li>
	<li>加入一小滴（约10 µL）含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或等效核酸染料的抗荧光淬灭封片剂。将60 mm × 24 mm、No. 1.5的玻璃盖玻片覆盖在每张载玻片上，并小心吸去多余液体。 
	注意：可用透明指甲油或橡胶胶水密封载玻片。若使用固化型封片剂，则无需额外密封。载玻片应存放于载玻片盒或文件夹中，置于4 °C保存。尽管建议染色后尽快成像，但根据我们的经验，避光保存于4 °C的载玻片其信号强度可维持数月到一年。如需长期保存，可将载玻片置于-20 °C保存数年，信号质量无明显下降。</li>
	<li>使用落射荧光显微镜在63倍镜下进行细胞成像（见材料表）。使用图像分析软件（如Zen或ImageJ，见材料表）测量沿染色体轴线的所有通道的联会复合体（SC）长度和荧光强度。从着丝粒（CREST或DAPI浓染区域）开始，追踪每条染色体轴（SYCP3）的长度。
	<ol>
		<li>对于HORMAD1和SYCP1的分析，记录荧光信号峰的长度。计算HORMAD1或SYCP1峰的总长度，并将其除以染色体轴的长度。</li>
		<li>对于MSH4的分析，量化每次SYCP3测量中荧光信号峰的数量。记录每个细胞核中MSH4峰的总数以及与MLH3峰重叠的MSH4峰数量。通过将MSH4峰与相应的焦点计数进行比较，验证计数结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于观察交叉的终变期/前中期制片
<ol>
	<li>为了获得最大数量的具有减数分裂能力的卵母细胞，应使用幼年雌性小鼠（25–28日龄）。 
	注意：为提高卵母细胞产量，可在收集卵母细胞前48小时通过腹腔注射5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）对雌鼠进行刺激。然而，在进行交叉分析时，未刺激雌鼠体内亦可收集到足够数量的生发泡（GV）期卵母细胞。</li>
	<li>在处死小鼠前，准备好以下试剂和溶液。
	<ol>
		<li>让M2（每只小鼠3 mL）和KSOM（每只小鼠1 mL）在细胞培养孵育箱（37 °C，5 % CO₂）中平衡2至少 1 小时。 
		注意：可在卵母细胞采集前一晚将冷冻培养基分装管放入培养箱中，并将管盖略微松开，以进行约14小时的平衡。</li>
		<li>配制含有2.5 µM 米力农（一种可防止减数分裂恢复的磷酸二酯酶同工酶抑制剂）的M2培养基36用移液器将五滴20 µL的M2 + 米力农溶液滴入35 mm培养皿中，并用轻质矿物油覆盖图 2C).</li>
		<li>将五滴20 µL KSOM液滴滴入35 mm培养皿中，并覆盖轻质矿物油（图2C). 
		注意：卵母细胞体外成熟过程中温度和pH的控制至关重要。卵母细胞的采集应在预热（37 °C）的实验台面上进行。所有培养基在使用前均应保存在培养箱中，且培养皿应逐个取出，以尽量减少因暴露于环境空气而造成的干扰。</li>
		<li>用70%乙醇清洁玻璃载玻片，并使其自然晾干。在玻璃载玻片背面，用金刚石笔轻轻划刻或用防水墨水笔绘制一个约4 mm × 4 mm的5 × 5网格（示例如图所示） 图2B 可用于追踪网格。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一次收集一只小鼠的卵母细胞。通过二氧化碳窒息法处死一只雌性小鼠。2 根据IACUC指南进行窒息和颈椎脱位处死。</li>
	<li>使用解剖剪打开腹腔。用精细镊子移开肠道。</li>
	<li>从膀胱开始沿每侧子宫角向肾脏方向追踪。卵巢和输卵管将与靠近肾脏的小脂肪垫相连。</li>
	<li>使用显微解剖剪去除卵巢，并将其置于含米力农的充气M2培养基中。</li>
	<li>使用显微解剖剪将卵巢周围的脂肪及其他组织（包括滑膜囊）完全去除。用25G针头刺破窦状卵泡。</li>
	<li>使用移液管将M2 + 米力农中的卵母细胞在100 mm培养皿中铺成薄层，注意避免液体接触培养皿壁图2C).</li>
	<li>使用解剖显微镜（放大倍数 25x - 50x）观察GV期卵母细胞（图 2F）。GV期卵母细胞可能与卵丘细胞形成卵丘-卵母细胞复合体（COC）。通过反复吹打去除卵丘细胞。</li>
	<li>使用口控玻璃移液管（直径 100 - 150 µm）收集GV期卵母细胞； 图2A). 将GV期卵母细胞转移至含有20 µL M2 + 米力农并覆盖轻质矿物油的液滴中（图 2C不要将超过30个卵母细胞放入同一液滴中。</li>
	<li>当收集完所有GV期卵母细胞后，将其依次通过2至3滴覆盖轻质矿物油的M2 + 米力农溶液（每滴20 µL），以去除任何体细胞。</li>
	<li>将GV期卵母细胞（尽量去除培养基）转移至30 µL KSOM液滴中。通过将卵母细胞依次穿过五个KSOM液滴以洗去米力农。图2C).</li>
	<li>将所有GV期卵母细胞转移至覆盖轻质矿物油的KSOM液滴（20 µL）中，每滴KSOM最多放置30个卵母细胞（图2C）。将卵母细胞置于细胞培养箱中（37 °C，5 % CO₂）2).</li>
	<li>将卵母细胞孵育约5小时。 
	注意：GV破裂（指核膜消失和减数分裂恢复的标志）； 图 2G）通常在培养2小时后发生，但卵母细胞成熟的速率可能因小鼠品系或激素刺激的不同而有所差异。根据我们的经验，在大多数小鼠品系中，培养5小时最有利于获得良好的交叉结构铺展。若培养时间过长，可能发生第一次减数分裂及第一极体排出。图 2H).</li>
	<li>将5-10枚卵母细胞（尽量减少KSOM液体）转移至30 µL低渗溶液（0.9%柠檬酸钠溶于超纯水）液滴中2O）。将卵母细胞在低渗溶液中孵育5 - 10分钟。</li>
	<li>用移液器吸取少量酸化水（50 mL超纯水中加入8滴冰醋酸）(~ 1 µL)，2O）滴加到已准备好的载玻片上的其中一个方格中（图2B).</li>
	<li>使用直径为100–150 µm的口控玻璃移液管，迅速将一个卵母细胞从低渗溶液转移至酸化水滴中。尽量减少随卵母细胞转移的低渗溶液量。使用同一根移液管吸除部分液体，直至卵母细胞粘附于载玻片上。 
	注意：卵母细胞周围的液体体积至关重要。液体应足够多，以防止卵母细胞在固定前干燥，但又不能过多，以免卵母细胞无法黏附于载玻片上。</li>
	<li>迅速更换为直径150 µm的玻璃移液器吸头。向卵母细胞添加一滴新鲜的卡诺固定液（三份无水甲醇与一份冰醋酸混合）。让固定液在载玻片上自然扩散。随着固定液中的酸溶解透明带并导致细胞破裂，卵母细胞应逐渐变得模糊并呈现溶解状。</li>
	<li>当固定液前沿开始收缩时，迅速再加入2至3滴固定液。轻轻向载玻片吹气以加快干燥。</li>
	<li>用低渗溶液中的额外卵母细胞重复步骤 3.16 - 3.19。</li>
	<li>重复步骤 3.15 至 3.20，直至所有卵母细胞固定完毕。使用相差显微镜检查染色体的铺展情况。</li>
	<li>当载玻片完全风干后，将其放入盛有50 mL 4% Giemsa（v/v）溶液（溶于ddH₂O）的考普林染色缸中2O. 室温下用吉姆萨染液染色6分钟。</li>
	<li>将载玻片用ddH₂O洗涤3次，每次3分钟2室温下静置，待载玻片完全干燥。</li>
	<li>在60 mm × 24 mm的1.5号玻璃盖玻片上均匀涂抹一层薄薄的Permount（约60 µL）。将载玻片倒置贴附于盖玻片上，轻轻吸去多余液体。室温避光静置过夜，待完全干燥后，使用63倍明场显微镜进行成像。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

与精母细胞相比，哺乳动物卵母细胞尤其容易发生错误。尽管卵母细胞中较弱的纺锤体组装检查点（SAC）效率是导致这种易感性的原因之一14,52,53，Hassold 和 Hunt 提出，非整倍体的产生是由多种因素共同作用所致，其中重组缺陷是主要因素54。人类研究已将非整倍体与交叉互换保障不足以及交叉互换位置欠佳联系起来55,56。一种主流模型认为，交叉互换成熟在卵母细胞中效率特别低下，导致既出现交叉互换缺失，也形成诱发非整倍体的模式57。因此，对卵母细胞减数分裂重组进行详细研究，对于理解卵子减数分裂出错的原因和机制至关重要。
本方案整合了多种经典染色体铺展技术的改进方法，针对重组事件的深入分析...

减数分裂是一种特殊的细胞分裂过程，对于单倍体配子的产生至关重要。在减数第一次分裂前期，同源染色体（每条由黏连蛋白连接的姐妹染色单体组成）必须完成三个关键任务：1）相互识别并配对；2）通过在各自的侧向轴之间形成联会复合体（synaptonemal complex, SC）而紧密配对；3）通过同源重组交换DNA，导致非姐妹染色单体之间形成交叉（crossovers, COs）1,2。交叉形成所产生的物理连接由黏连蛋白维持，可确保在减数第一次分裂中期染色体的正确双极取向和分离3,4,5。
减数分裂前期Ⅰ包含五个阶段，每个阶段由联会的状态定义6。在细线期（leptonema，希腊语意为“细线”），染色体发生凝缩，沿染色体轴形成轴线结构（由SYCP3标记）。在偶线期（zygonema，意为“连接的线”），同源染色体开始联会，联会复合体（SC）的横向元件（SYCP1）在染色体轴之间形成7。在粗线期（pachynema，意为“粗线”），染色体在其全长范围内完成联会。随后在双线期（diplonema，意为“两条线”）联会复合体解聚，同源染色体仅在交换位点（交叉结构，chiasmata）处保持连接。交叉结构是同源重组的产物，该过程始于程序性诱导的DNA双链断裂（DSBs）。在数百个DSB中，仅有约10%最终形成交换（COs）。在小鼠中，大多数（90%–95%）交换通过由MutLγ（MLH1-MLH3）介导的Ⅰ类CO途径形成，其余的CO则由MUS81-EME1通过Ⅱ类CO途径产生8,9,10,11。
配对、联会和重组是高度受调控且相互依赖的过程。错误通常会触发检查点机制，导致细胞死亡。在雌性中，减数分裂前期 I 早期发生的错误引起的生殖细胞丢失可能导致早发性&#160;卵巢功能不全12,13，而晚期错误（例如同源染色体未能形成交叉互换、交叉互换位置异常或黏连蛋白过早丢失）则可能导致染色体错误分离和非整倍性。在人类中，减数分裂错误是导致妊娠丢失和不孕的主要原因。女性减数分裂尤其容易出错。大约20%–80%的人类卵子（相比之下精子为2.5%–7%）携带异常的染色体数目，其中大多数源于第一次减数分裂过程中的错误14,15,16,17。尽管年龄已被确认为母源性非整倍体最主要的诱因，但卵母细胞为何如此易受错误影响的原因仍不明确。
尽管了解卵母细胞高错误率背后的影响因素至关重要，但我们对减数分裂前期 I 事件调控的大部分认识仍主要来自对雄性减数分裂的研究。由于少量成年睾丸组织即可提供足以评估减数分裂及减数分裂后各阶段生殖细胞的材料，雄性减数分裂长期以来更易于被研究人员获取。相比之下，雌性减数分裂以不连续的方式进行。在小鼠中，减数分裂前期 I 在胎儿卵巢中以半同步方式进展，始于交配后约 14 天（dpc； 图1A），性腺性别决定后不久18,19,20出生前后，卵母细胞进入核网期停滞，直至数月（小鼠）或数十年（人类）后排卵时才恢复发育21,22,23因此，减数分裂前期 I 的特定阶段仅在有限的发育时间窗口内可观察到（图1A），在幼年和成年个体中，每次仅有少数卵母细胞发生前期I之后的事件。尽管技术进步已改善了哺乳动物卵母细胞减数分裂的研究，但与男性生殖研究中相应的技术相比，这些方法仍然具有挑战性且耗时较长。
雌性减数分裂分析因粗线期卵母细胞的亚分期受限而更加复杂——这对研究交叉互换的指定和成熟过程至关重要。雄性研究则得益于特征明确的性染色体配对动态，以及组蛋白变体H1t的存在，后者可作为早期、中期和晚期粗线期的标志物24,25,26。然而，目前尚未建立可靠的粗线期卵母细胞亚分期方法。
本文所述方案可对从小鼠减数分裂I前期早期至中期I的卵母细胞中突触形成和重组进行系统分析。本研究在Peters等人27和Tarkowski28建立的经典染色体铺展技术基础上，结合Hunt29以及Sun和Cohen30对该方法的先前改进而发展而来。本方案着重强调以下三个方面：1）富集并鉴定减数分裂I前期特定亚阶段的细胞；2）最大化每对胎鼠卵巢所获取样本的应用数量；3）提供从重组焦点到交叉结构评估突触缺陷和重组事件的全面且易于操作的量化指标。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHAR33SB</td><td>用于制作口吸移液管</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Corning</td><td>46-034-CI&amp;nbsp;</td><td>用于 HEB</td></tr><tr><td>1 mL 无菌注射器，带 25 号、16 mm 针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-125&amp;nbsp;</td><td>用于破裂卵巢</td></tr><tr><td>100 x 15 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-302&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>14.6 cm 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B&amp;nbsp;</td><td>用于制作口吸移液管</td></tr><tr><td>35 x 10 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>40 mm x 0.45 mm #3 不锈钢昆虫学用针</td><td>Amazon</td><td>B0CSSPW5S7</td><td>用于固定胎鼠以进行解剖</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>用于卡诺氏固定液</td></tr><tr><td>校准毛细移液管用吸管管组件</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>用于制作口吸移液管</td></tr><tr><td>B.P.I. 表面皿</td><td>NDS Technologies&amp;nbsp;</td><td>1580-00</td><td>也可使用 30 mm 直径 × 12 mm 深的胚胎皿（Electron Microscopy Sciences 货号：70543-30）</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-1</td><td>用于调节 HEB 和 PFA 的 pH</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>用于 ADB</td></tr><tr><td>CO2 气罐</td><td></td><td></td><td>用于培养箱</td></tr><tr><td>Corning 显微镜载玻片</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS294875X25</td><td>长 × 宽 75 mm × 25 mm，单面磨砂</td></tr><tr><td>Corning 显微镜载玻片，单面磨砂，一端磨砂</td><td>VWR</td><td>294875X25</td><td></td></tr><tr><td>矩形盖玻片，60 x 24 mm，#1.5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td></td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70540</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>解剖剪刀，尖头，4.5&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>超细尖头镊子</td><td>VWR</td><td>76548-836</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>Millipore Sigma</td><td>GS500-500</td><td>用于染色交叉分布标本</td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td>任何配备 CO2 和水套技术的标准型号</td></tr><tr><td>体外受精工作站</td><td>K-Systems</td><td></td><td>任何带加热台面的型号</td></tr><tr><td>Kodak Photo-Flo 200 溶液</td><td>BH Photo &amp; Video</td><td>1464510</td><td>用于载玻片清洗</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>用于卡诺氏固定液</td></tr><tr><td>MP Biomedicals Coplin 染色缸</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN17006201</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td>用于 ADB</td></tr><tr><td>甲醛，电镜级，纯化颗粒</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19200</td><td></td></tr><tr><td>Permount 中性树胶</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>用于交叉分布标本的封片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>含 NucBlue 染料的 ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36985</td><td>用于免疫荧光染色载玻片的封片</td></tr><tr><td>硅胶管，内径：0.125&quot;，外径：0.25&quot;</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td>用于制作口吸移液管</td></tr><tr><td>二水合柠檬酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td>用于 HEB 和低渗溶液</td></tr><tr><td>StainTray 载玻片染色系统</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71396-B</td><td>用作加湿孵育盒。免疫荧光染色时必须使用黑色盖子。也可用不透明载玻片盒或密封盒底部铺上湿润的纸巾作为加湿孵育环境&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>移液头剥离器 - 100</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-100</td><td>用于口吸移液管</td></tr><tr><td>移液头剥离器 - 150</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-150</td><td>用于口吸移液管</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Millipore Sigma</td><td>S-8501</td><td>用于 HEB 和蔗糖低渗溶液</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>用于 HEB</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100&amp;nbsp;</td><td>用于 PFA、ADB 和 Triton-PBS</td></tr><tr><td>United Scientific Coplin 染色缸</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17495A</td><td>不透明白色塑料，用于添加光敏性二抗后的清洗和封闭载玻片</td></tr><tr><td>United Scientific 玻璃凹面载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>S139533</td><td>厚度 1.3 mm，双孔</td></tr><tr><td>Vannas 显微解剖剪刀，5 mm 直头</td><td>VWR</td><td>76457-358</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager.Z2，Colibri 7</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-2624-307</td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue 3.11 软件</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>图像采集与分析软件</td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的 F(ab')? 片段山羊抗小鼠 IgG，Fc 片段特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-546-071</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的 F(ab')? 片段山羊抗兔 IgG，Fc 片段特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-546-046</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的 F(ab')? 片段山羊抗人 IgG，Fc&amp;gamma; 片段特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>109-606-170</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的山羊抗豚鼠 IgG，Fc 片段特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>106-605-008</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>豚鼠抗 MLH3 多克隆抗体</td><td></td><td></td><td>Thermo-Fisher 定制制备，使用 1:500 稀释度</td></tr><tr><td>豚鼠抗 SYCP1 多克隆抗体</td><td></td><td></td><td>来自 Christer H&amp;ouml;&amp;ouml;g（Kouznetsova 等，2005），使用 1:200 稀释度</td></tr><tr><td>人抗着丝粒蛋白多克隆抗体</td><td>Antibodies Inc.</td><td>15-234</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>小鼠抗 MLH1 单克隆抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550838</td><td>使用 1:100 稀释度</td></tr><tr><td>小鼠抗 SYCP3 单克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>兔抗 HORMAD1 多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>13917-1-AP</td><td>使用 1:500 稀释度</td></tr><tr><td>兔抗 MSH4 多克隆抗体</td><td>Abclonal</td><td>A8556</td><td>使用 1:100 稀释度</td></tr><tr><td>兔抗 RAD51 多克隆抗体</td><td>Millipore</td><td>PC130</td><td>使用 1:500 稀释度</td></tr><tr><td>兔抗 SYCP3 多克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15093</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>Rhodamine Red-X (RRX) 标记的 F(ab')? 片段山羊抗小鼠 IgG，Fc 片段特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-296-071</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>Rhodamine Red-X (RRX) 标记的 F(ab')? 片段山羊抗兔 IgG，Fc 片段特异性</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-296-046</td><td>使用 1:1,000 稀释度</td></tr></tbody></table>

小鼠卵母细胞减数分裂染色体铺片的制备用于联会与重组的评估

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapsis and Recombination

定义减数分裂前期 I 的三个关键且相互依赖的过程是：同源染色体必须配对，一种称为联会复合体的蛋白质结构形成以将同源染色体连接在一起（联会），以及同源染色体发生重组，通过相互交换遗传物质形成交叉（COs）。这些过程中的错误可能导致卵巢早衰、非整倍体，最终导致妊娠丢失和不育。减数分裂重组在卵母细胞中尤其容易出错，超过 7% 的人类卵母细胞至少含有一对没有交叉的染色体，而卵子中 20%–80% 存在非整倍体，相比之下精子中仅为 2.5%–7%。然而，目前尚不清楚为何染色体错误表现出如此显著的性别差异。本实验方案描述了分别从小鼠胎儿和幼年小鼠制备和分析卵母细胞减数分裂前期 I 和中期 I 染色体铺片的方法。为追踪减数分裂前期 I 过程中的关键染色体动态，本方案采用免疫荧光染色技术，检测减数分裂重组的常用标志物（RAD51 标记双链断裂，MSH4 标记交叉中间产物，MLH1/MLH3 用于鉴定大多数交叉事件）以及联会相关标志物（SYCP3 标记染色体轴，SYCP1 标记已联会区域，HORMAD1 标记未联会区域）。此外，本方案使用 体外 收集卵母细胞并使其成熟，以评估中期I配对染色体（二价体）的数量以及交叉互换（交叉）的总数。这些技术共同提供了一个全面且定量的框架，用于研究调控雌性减数分裂早期染色体动态的机制。

评估类似粗线期细胞中的联会缺陷 
本实验旨在评估粗线期卵母细胞中的联会缺陷，并监测减数第一次分裂前期的进程（图3A）。通过免疫染色检测SYCP3（轴向/侧向联会复合体组分）、SYCP1（中央联会复合体组分）和HORMAD1（未联会/去联会的染色体轴），可实现细胞阶段的判定及联会状态的评估。HORMAD1在偶线期和双线期与SYCP3共定位（分别发生在联会前和去联会后）37,38。在卵母细胞中，区分这两个阶段可能较为困难。偶线期的特征是具有长而细的染色体轴以及分叉状的未联会区域，而双线期则表现为短而粗的联会复合体，并因去联会出现特征性的圆形泡状结构，位于同源染色体轴之间（图3A）。
...

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图1：端到端框架。该图展示了多模态知识图谱VISHAM-KG的端到端框架。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69803/69803fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

定义减数分裂前期 I 的三个关键且相互依赖的过程是：同源染色体必须配对，一种称为……的蛋白质结构

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>距平面距离</td>
			<td>离子束电流</td>
			<td>样品台倾斜调整</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62; 3 µm</td>
			<td>30 kV / 0.5 nA</td>
			<td>+1° (上方) / −1° (下方)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2–3 µm</td>
			<td>30 kV / 0.3 nA</td>
			<td>+1° / −1°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1–2 µm</td>
			<td>30 kV / 0.1 nA</td>
			<td>±0.5°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5-1.0 µm</td>
			<td>30 kV / 50 pA</td>
			<td>±0.3°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#60;0.5 µm</td>
			<td>30 kV / 50 pA</td>
			<td>±0.2°</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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小鼠卵母细胞减数分裂染色体铺片的制备用于联会与重组的评估

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