快速优化光诱导系统以调控哺乳动物基因表达

本项目旨在开发一种高通量方法，用于优化和表征一种名为LACE的多组分光遗传学工具，以实现哺乳动物基因表达的调控。首先，将含有HEK 293 T细胞的细胞培养瓶放入生物安全柜中。使用刻度移液管吸除废弃培养基。

用移液器将10毫升DPBS加入培养瓶的一角，轻轻旋转以冲洗细胞。然后吸去洗涤液，并将DPBS和吸出液一同弃入废液容器中。接着向培养瓶中加入1.5毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖瓶内表面，随后进行孵育。

轻轻敲击培养瓶，使细胞从瓶壁表面脱落。接着，用移液器向培养瓶中加入 8.5 毫升新鲜 DMEM 培养基。反复吹打溶液，直至无可见细胞团块，使细胞充分重悬。

然后将九毫升细胞悬液转移至15毫升锥形管中。向培养瓶中加入九毫升新鲜DMEM。将细胞悬液置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养至汇合。

现在，取10微升悬浮细胞与10微升胰蛋白酶染料按1:1比例混合，使用血细胞计数板计算细胞浓度。将约35,000个细胞接种至每孔含100微升培养基的高性能1.5号、黑色、96孔玻璃底板中。将该板置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育24小时。

转染时，首先将11微升预热的无血清DMEM培养基分装至1.5毫升微量离心管中，每孔一份，并额外准备10%过量。配制不同质粒质量比例的CRY2-增强型绿色荧光蛋白与CIBN-向导RNA，将上述制备好的溶液按每孔110纳克分装至各含有无血清培养基的离心管中。然后，为每孔另取单独的离心管，再加入11微升无血清DMEM培养基，用于转染试剂的稀释。

将稀释后的转染试剂加入DNA培养基混合物中，孵育以形成转染复合物。然后用移液器将20微升制备好的转染复合物加入含有HEK 293 T细胞的96孔板的每个孔中。用铝箔纸包裹96孔板，置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育24小时。

启动激活过程时，通过指定的代码行修改微控制器输入代码，以点亮目标孔位。使用指定的代码行将发光二极管的光强设置为 9.27 毫瓦每平方厘米。将脉冲时长调整为 1 秒，然后将脉冲频率设置为 0.067 赫兹，相当于每 15 秒一次。

用70%乙醇喷洒optoPlate的3D打印盖子，然后在生物安全柜中晾干。现在，在暗室中打开红光灯。

将96孔板放入生物安全柜中。用干燥的3D打印盖子替换原孔板盖子。将96孔板放置在LED阵列上，以组装激活装置。

将完全组装好的LED阵列装置放入设定为37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中培养24小时。将微控制器、发光二极管和风扇接口连接至电源。为进行流式细胞术，运行站点专家软件中的系统启动程序。

将两毫升去离子水加入样品加样器中。使用提供的质控微球进行质量控制。设置并指定用于采集的样品孔。

创建侧向散射与前向散射、侧向散射高度与侧向散射面积、侧向散射面积与FITC-A的关系图，以及FITC-A统计表。现在，将V型底96孔板装入流式细胞仪的板架中。选择一个未转染的孔，点击“初始化”，然后点击“运行”。

调节侧向散射光和FITC电压，使目标细胞群在SSC-A与FSC-A图中居中。点击“运行”，然后选择一个转染了巨细胞病毒增强型绿色荧光蛋白的孔。调节FITC电压，使SSC-A与FITC-A图中同时包含自发荧光细胞和荧光细胞。

创建一个多边形以圈选健康细胞群体。在SSC-H与SSC-A图上创建第二个多边形，用于双联体（doublet）的区分。利用未转染细胞的门控作为参考，创建一个多边形门控以区分荧光细胞与非荧光细胞。

以每分钟 60 微升的速度自动记录样本，直至达到 200 秒或采集到 10,000 个事件为止。然后将平均 FITC 值导出为 CSV 文件并分析数据。通过选择日常清洗选项来清洗流式细胞仪。

荧光成像显示，在蓝光激活条件下，当质量比为1:9时，eGFP的最大表达水平低于5:5的比例，且后者在黑暗条件下表现出更高的泄漏表达。流式细胞术结果显示，在所有条件下，P1门控事件中超过95%为单细胞。未转染细胞中eGFP阳性群体比例低于0.1%。

CMV-eGFP 对照组中约有 99% 的细胞为 eGFP 阳性，而 2pLACE 转染组中约有 57% 的细胞为 eGFP 阳性。CMV-eGFP 转染细胞在光照和黑暗条件下均表现出强烈的组成型 eGFP 表达，而未转染的细胞则无可见荧光。该结果也证实了 2pLACE 的成功转染，并表明在蓝光照射下 eGFP 表达被激活，但其表达水平低于 CMV-eGFP 组。与黑暗条件相比，经光照激活的 2pLACE 样品中 eGFP 表达量增加了三倍。

在2pLACE转染样品中，eGFP阳性细胞的比例约为60%。三比七的质量比产生了最高的平均荧光强度和动态范围。该方案利用optoPlate对不同的光照条件和脉冲频率进行编程，从而实现对样品及技术重复的高通量评估。