低密度脂蛋白存在下利用中性粒细胞胞外诱捕网刺激血管内皮细胞

中性粒细胞胞外诱捕网参与多种疾病的发生发展，包括心血管疾病。然而，中性粒细胞胞外诱捕网的形成与脂蛋白对血管细胞的协同作用仍不明确。利用本方案，目前仍在持续开展机制分析，以研究人主动脉内皮细胞在经中性粒细胞胞外诱捕网和低密度脂蛋白处理后，其炎症反应的诱导机制。

我们已证明，高密度脂蛋白可抑制中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，而氧化型低密度脂蛋白、氧化型磷脂和溶血磷脂则促进NET的形成。首先，在4摄氏度条件下，将肝素抗凝管中采集的45至50毫升人全血以700 ×g离心15分钟。

离心结束后，缓慢降低离心机转速，然后收集含有血浆组分的上层液体。将血浆组分在4°C条件下以700 ×g离心15分钟，重复两次，以彻底去除血细胞，每次均保持相同的减速设置。随后，每1毫升血浆中加入1微升250毫摩尔/升的EDTA溶液，以防止二价金属离子介导的脂蛋白氧化。

将2.7毫升血浆加入超速离心管中。覆盖900微升含有250微摩尔EDTA的PBS。然后在4摄氏度下以600,000 ×g离心7分钟。

接下来，弃去上层900微升液体，以去除乳糜微粒组分。在剩余血浆上方加入900微升含EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS），并在4°C条件下以600,000 ×g超速离心2.5小时。弃去上层900微升液体，以去除极低密度脂蛋白组分。

然后向血浆中加入540微升浓度为0.5克/毫升的溴化钾溶液，将密度调节至1.063。使用移液器轻轻混匀内容物，并在4摄氏度下以600,000 ×g超速离心2.5小时。收集上层540微升含低密度脂蛋白的部分。

将收集的组分转移至透析膜中，在4°C避光条件下，用含有EDTA的两升PBS缓冲液进行透析，以去除溴化钾。向12孔板的每孔中加入152 µL 0.01%多聚赖氨酸或0.1%明胶溶液，在室温下孵育至少5分钟。随后吸除孔内溶液，用200 µL无菌水洗涤一次，并在室温下让各孔完全干燥。

将制备好的培养板在室温下保存，以备后续使用。按照与多聚赖氨酸相同的程序制备明胶包被的培养板。在添加2微摩尔全反式维甲酸的RPMI-1640培养基中，每10毫升培养2×10⁶个HL60细胞。

用全反式维甲酸孵育四天后，收集 HL60 细胞。在 18 至 22 摄氏度条件下，以 220 ×g 离心 4 分钟。吸除上清液，然后用等体积的无血清 RPMI-1640 培养基重悬细胞并洗涤。

将洗涤后的细胞在18至22摄氏度下以220 G离心4分钟，然后在无血清RPMI-1640培养基中重悬细胞。调整细胞浓度至每毫升2×10⁶个细胞后，将0.5毫升细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的12孔板的每个孔中。每孔加入100微升无血清RPMI-1640培养基，培养基中可含或不含300纳摩尔佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）。

将细胞培养30分钟。随后，移除孔中的培养基。用无血清的RPMI-1640培养基洗涤细胞一次，并更换为含有0或20微克/毫升低密度脂蛋白的无血清RPMI-1640培养基。

继续培养细胞两小时。将每孔中的培养基收集到离心管中，在18至22摄氏度下以700 ×g离心3分钟，以去除细胞碎片。进行刺激时，取人主动脉内皮细胞培养物，弃去旧培养基，加入0.5 mL新鲜培养基，将细胞孵育30分钟。

最后，向人主动脉内皮细胞培养皿中加入167微升含有中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）和低密度脂蛋白（LDL）的类中性粒细胞培养上清液。用中性粒细胞胞外诱捕网刺激人主动脉内皮细胞可诱导其发生剂量依赖性的形态学改变，从铺路石样形态转变为细长形态。当使用LDL诱导生成的中性粒细胞胞外诱捕网进行刺激时，人主动脉内皮细胞的形态学改变更为显著，细长化形态在刺激后6小时即已明显可见。