Name: 在低密度脂蛋白存在下使用中性粒细胞细胞外陷阱刺激血管内皮细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 了解中性粒细胞胞外陷阱与低密度脂蛋白协同刺激人主动脉内皮细胞的方法。本研究分离人血浆LDL并制备NETs，分析炎症反应机制，为心血管疾病治疗提供新见解。

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本研究部分由日本促进科学振兴会（JSPS）科研费（课题编号 23K10897 和 19K07069）资助。我们感谢 Editage（www.editage.jp）对英文文本的语言润色。

低密度脂蛋白（LDL）制备方案已获得昭和药科大学药学院伦理委员会批准（编号：231）。所有参与者均按照《赫尔辛基宣言》的要求签署书面知情同意书，并自愿参与本研究。细胞操作均在超净工作台中无菌进行。纳入标准为年龄在22至65岁之间。排除标准包括吸烟史、已存在的心血管疾病（如冠心病、脑卒中和外周动脉疾病）、严重肝功能障碍，以及未得到控制的慢性疾病，包括糖尿病、高血压、血脂异常、严重炎症性疾病和癌症。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 从人血浆中分离低密度脂蛋白（LDL）
<ol>
	<li>从健康人类志愿者采集全血，加入抗凝剂肝素（10 单位/mL）。</li>
	<li>将肝素管中获取的 45–50 mL 人全血离心（700 × g，4 °C 下 15 分钟）。确保缓慢降低离心机转速。收集上层含血浆组分的液体。</li>
	<li>以与步骤 1.2 相同的减速条件进行两次离心（700 × g，4 °C 下 15 分钟），以去除血细胞。加入 1:1,000 体积的 250 mM EDTA（pH 7.4），防止二价金属离子介导的脂蛋白氧化。</li>
	<li>将 2.7 mL 血浆置于 4 mL 聚碳酸酯（4PC）管中，覆盖 900 µL 含 250 µM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS/EDTA），然后进行超速离心（600,000 × g，4 °C 下 7 分钟）。</li>
	<li>弃去上层 900 µL 液体以去除乳糜微粒。在血浆上层叠加 900 µL PBS/EDTA，然后进行超速离心（600,000 × g，4 °C 下 2.5 小时）。</li>
	<li>弃去上层 900 µL 液体以去除极低密度脂蛋白（VLDL）。此步骤至关重要，可防止其他脂蛋白组分污染低密度脂蛋白（LDL）。</li>
	<li>加入 540 µL 的 0.5 g/mL KBr 溶液，将密度调节至 d = 1.063，随后用移液器轻轻混匀，再进行超速离心（600,000 × g，4 °C 下 2.5 小时）。</li>
	<li>收集上层 540 µL 含 LDL 的液体。出现黄色至橙色层表明 LDL 分离成功9。转移至透析膜中。</li>
	<li>将 LDL 组分在 4 °C 避光条件下，用 2 L PBS/EDTA 透析三次，以去除 KBr。</li>
	<li>将 LDL 储存于 4 °C 避光环境中，待用。</li>
</ol>
2. 聚-L-赖氨酸或明胶包被孔板的制备
<ol>
	<li>通过将0.1%的聚-L-赖氨酸溶液用无菌水稀释，配制0.01%的聚-L-赖氨酸溶液10，然后用0.2 µm无菌滤器过滤。使用前于4 °C保存。</li>
	<li>向12孔板的每孔中加入152 μL的0.01%聚-L-赖氨酸溶液，孵育至少5 min。</li>
	<li>吸除溶液，然后每孔用&#160;200 μL&#160;无菌水洗涤一次，并干燥至少2 h。</li>
	<li>在制备NETs前，于室温下保存。</li>
</ol>
3. 明胶包被孔板的制备
<ol>
	<li>使用前，用无菌水稀释2%明胶溶液，制备0.1%明胶溶液。</li>
	<li>向12孔板的每孔中加入152 μL的0.1%明胶溶液，并孵育至少5分钟11。</li>
	<li>移除溶液，然后每孔加入200 μL无菌水洗涤一次，并干燥至少2小时。</li>
	<li>使用前于室温下保存。</li>
</ol>
4. 人主动脉内皮细胞（HAECs）的培养与制备
<ol>
	<li>根据制造商说明书，使用含有2%胎牛血清（FCS）、5 ng/mL表皮生长因子、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL胰岛素样生长因子、0.5 ng/mL血管内皮生长因子、1 µg/mL抗坏血酸、22.5 µg/mL肝素和0.2 µg/mL氢化可的松的完全培养基，在未包被的培养瓶中培养原代人支气管上皮细胞（HAECs）。每隔一天换液一次，直至细胞融合度达到70%–80%。</li>
	<li>进行刺激实验时，将HAECs接种于明胶包被的12孔板中。每隔一天更换培养基，直至细胞达到完全融合。实验应在第4至第7代之间进行。</li>
</ol>
5. 中性粒细胞样 HL-60 细胞的制备及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的诱导
<ol>
	<li>使用未处理的培养皿，以添加了5%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基培养HL-60细胞。</li>
	<li>为制备HL-60来源的中性粒细胞样细胞，培养2 × 106 每10 mL HL-60细胞在含2 µM全反式维甲酸的RPMI-1640培养基中培养4天转 视黄酸（AtRA）</li>
</ol>
6. 用LDL制备NETs
<ol>
	<li>在用 2 µM AtRA 处理 4 天后收集 HL-60 细胞。HL-60 细胞向类中性粒细胞分化后，细胞体积变小。</li>
	<li>离心细胞（220 × g，18–22 °C 下离心 4 分钟）。吸除上清液，并用等体积的无血清 RPMI-1640 培养基洗涤细胞。</li>
	<li>再次离心细胞（220 × g，18–22 °C 下离心 4 分钟），然后用无血清 RPMI-1640 培养基重悬细胞。</li>
	<li>计数细胞，然后将细胞重悬于无血清 RPMI-1640 培养基中，调整细胞密度至 2 × 106 个细胞/mL，并将 0.5 mL 细胞悬液接种至预先用多聚-L-赖氨酸包被的 12 孔板各孔中。培养至少 30 分钟。</li>
	<li>向孔中加入 100 µL 无血清 RPMI-1640 培养基，其中含或不含佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（PMA），使 PMA 的终浓度为 0 或 50 nM。继续培养 30 分钟。</li>
	<li>移除培养基，用无血清 RPMI-1640 培养基洗涤细胞一次。更换为含或不含 20 µg/mL 低密度脂蛋白（LDL）的无血清 RPMI-1640 培养基，继续培养 2 小时。</li>
	<li>收集培养上清液，离心（700 × g，18–22 °C 下离心 3 分钟）以去除细胞碎片。</li>
</ol>
7. 用 NETs 和 LDL 刺激 HAECs
<ol>
	<li>更换为 0.5 mL 新鲜培养基，在刺激前至少培养 30 分钟。</li>
	<li>向 HAEC 培养皿中加入含有 NETs 和 LDL 的培养基（步骤 6.7）以及 LDL，共 167 µL。观察刺激 12 小时或更长时间后 HAECs 的形态学变化。</li>
</ol>

<ol><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in homeostasis and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 235(2024).</li>
<li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thromb Haemost. 107 (3), 597-598 (2012).</li>
<li>Meher, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+IL+%28Interleukin%29-1%CE%B2+in+neutrophil+extracellular+trap+formation+and+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel role of IL (Interleukin)-1β in neutrophil extracellular trap formation and abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (4), 843-853 (2018).</li>
<li>Borissoff, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+circulating+DNA+and+chromatin+are+independently+associated+with+severe+coronary+atherosclerosis+and+a+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (8), 2032-2040 (2013).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-specific+deletion+of+Peptidylarginine+Deiminase+4+mitigates+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-specific deletion of Peptidylarginine Deiminase 4 mitigates atherosclerosis.</a> Front Immunol. 9, 1680(2018).</li>
<li>Zhai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+from+activated+vascular+smooth+muscle+cells+drive+the+progression+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps from activated vascular smooth muscle cells drive the progression of atherosclerosis.</a> Nat Commun. 13 (1), 7500(2022).</li>
<li>Abdo, A. I., Rayner, B. S., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+modified+by+myeloperoxidase+oxidants+induces+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein modified by myeloperoxidase oxidants induces endothelial dysfunction.</a> Redox Biol. 13, 623-632 (2017).</li>
<li>Mueller, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+lipoprotein+%28a%29+Isolation+from+a+small+volume+of+plasma+with+applications+for+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A method for lipoprotein (a) Isolation from a small volume of plasma with applications for clinical research.</a> Sci Rep. 12 (1), 9138(2022).</li>
<li>Hosseinzadeh, A., Messer, P. K., Urban, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+redox-cycling+nitroxide+tempol+inhibits+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable redox-cycling nitroxide tempol inhibits NET formation.</a> Front Immunol. 3, 391(2012).</li>
<li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+endothelial+cells+induce+neutrophil+extracellular+traps+and+are+susceptible+to+NETosis-mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death.</a> FEBS Lett. 584 (14), 3193-3197 (2010).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+action+of+oxidized+low-density+lipoproteins+and+neutrophils+on+endothelial+inflammatory+responses+through+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cooperative action of oxidized low-density lipoproteins and neutrophils on endothelial inflammatory responses through neutrophil extracellular trap formation.</a> Front Immunol. 10, 1899(2019).</li>
<li>Schröter, J., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorinated+phospholipids+and+fatty+acids%3A+Patho%29physiological+relevance%2C+potential+toxicity%2C+and+analysis+of+lipid+chlorohydrins%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid+Med+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Chlorinated phospholipids and fatty acids: Patho)physiological relevance, potential toxicity, and analysis of lipid chlorohydrins.</a> Oxid Med Cell Longev. 2016, 8386362(2016).</li>
<li>Nose, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+perilipin-3+%28TIP47%29+in+formation+of+lipid+droplets+and+PGE2+production+in+HL-60-derived+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Crucial role of perilipin-3 (TIP47) in formation of lipid droplets and PGE2 production in HL-60-derived neutrophils.</a> PLoS One. 8 (8), e71542(2013).</li>
<li>Manda-Handzlik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+agents+differentiating+HL-60+cells+toward+granulocyte-like+cells+on+their+ability+to+release+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of agents differentiating HL-60 cells toward granulocyte-like cells on their ability to release neutrophil extracellular traps.</a> Immunol Cell Biol. 96 (4), 413-425 (2018).</li>
<li>Ermert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections.</a> J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Ohinata, H., Obama, T., Makiyama, T., Watanabe, Y., Itabe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+suppresses+neutrophil+extracellular+traps+enhanced+by+oxidized+low-density+lipoprotein+or+oxidized+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein suppresses neutrophil extracellular traps enhanced by oxidized low-density lipoprotein or oxidized phospholipids.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 13992(2022).</li>
<li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+derived+from+macrophages%2C+mast+cells%2C+eosinophils%2C+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils, and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> J Pathol. 247 (4), 505-512 (2019).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+eosinophils+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of eosinophils in cardiovascular disease.</a> Nat Rev Cardiol. 22 (3), 165-182 (2025).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了由低密度脂蛋白（LDL）共存条件下诱导dHL-60细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）并对其进行制备，随后用于分析人主动脉内皮细胞（HAEC）的反应。本方案的重要之处在于使用含有NETs和LDL的新鲜培养基刺激细胞，而许多其他研究则采用在-20 °C冷冻保存的NETs储备液。由于脂蛋白是脂质-蛋白质复合物，其完整结构和特性在冻融过程中会丧失，导致LDL发生变性和聚集。当前方法的一个优势在于，类中性粒细胞释放的NET形成产物（如去浓缩DNA、组蛋白、髓过氧化物酶（MPO）和弹性蛋白酶）以及脂蛋白均保持完整，并可立即应用于HAEC。因此，在NET形成过程中由类中性粒细胞释放的酶活性得以维持。值得注意的是，本方案的结果可能反映了NETs共孵育对LDL改变的影响。先前有研究报道，天然LDL不会增强PMA处理的dHL-60细胞释放DNA或MPO12。这些数据表明，HAEC的反应可能是由中性粒细胞来源成分诱导的天然LDL改变所引起的。考虑到髓过氧化物酶（MPO）产生的次氯酸反应生成的酶促氧化脂质（包括氯化磷脂和脂肪酸）可诱导炎症反应13，...

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）由活化的中性粒细胞在细菌感染以及非感染性但生理上合理的条件下产生，会释放去浓缩的DNA和蛋白质，例如组蛋白、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶1。由于这些组分可破坏边缘细胞和组织，导致持续性炎症，NET的形成已被认为是多种急性和慢性疾病发生与发展的致病因素，包括类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病、阿尔茨海默病、癌症转移以及心血管疾病2。对人类动脉粥样硬化3和腹主动脉瘤4血管病变的组织学分析显示，中性粒细胞浸润与NET形成在空间上共定位。在循环血液中，NET标志物（如瓜氨酸化组蛋白、NET-DNA和MPO）的水平随冠状动脉疾病严重程度而升高5。在动脉粥样硬化的早期阶段，NET的形成通常先于由巨噬细胞驱动的泡沫细胞形成所介导的脂质积聚6,7。这些现象强烈提示，NET形成过程中释放到细胞外的MPO和蛋白水解酶不仅可作用于血管组织，还可作用于血液成分，例如脂蛋白。脂蛋白是脆弱的脂质-蛋白质复合物，可被NET来源的蛋白质（如MPO）所损伤8；因此，NET的形成可导致脂蛋白的结构和生物化学改变，从而影响血管稳态。然而，NET形成与脂蛋白在血管细胞诱导的失调及炎症反应中的协同作用仍不明确。
本文提供了一种研究人血管内皮细胞在经由HL-60来源的类中性粒细胞制备的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）以及自人血浆中分离的低密度脂蛋白（LDL）处理后所诱导的细胞反应的方法。代表性结果展示了通过超速离心法从人血浆中分离LDL的过程，以及LDL共孵育后NETs刺激人主动脉内皮细胞（HAECs）所引发的细胞反应。该方法可广泛应用于涉及其他脂蛋白的血管细胞研究。

<table><tbody><tr><td>0.1% 聚-L-赖氨酸</td><td>SigmaAldrich</td><td>P8920-100ML</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>12 孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2% 明胶</td><td>SigmaAldrich</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>4PC 管</td><td>Himac</td><td>S404332A</td><td></td></tr><tr><td>全反式维甲酸</td><td>Wako</td><td>188-01113</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>纤维素透析管</td><td>MISUMI Group Inc.</td><td>0327-23-37-07 (UC18-32-100)</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo</td><td>345-01865</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基 2 试剂盒</td><td>PromoCell</td><td>C-22111</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>肝素钠（5,000 单位/5 mL）</td><td>Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>高速冷冻离心机</td><td>TOMY</td><td>SRX-201</td><td>加速度：9，减速度：7</td></tr><tr><td>人主动脉内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>cc-2535</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>Wako</td><td>168-03475</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>KEYENCE 显微镜软件</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-II Analyzer</td><td></td></tr><tr><td>微量超速离心机</td><td>Himac</td><td>CS150GX</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td>用于延时成像（可选）</td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi3</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机软件</td><td>Nikon</td><td>DS-L4</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122 100ML</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（&amp;times;10）</td><td></td><td></td><td>将 2.6 g NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、29 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、80 g NaCl 和 2.0 g KCl 溶于蒸馏水中，定容至 1 L。&amp;nbsp;（可使用任意供应商产品替代）</td></tr><tr><td>PMA（佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯）</td><td>Wako</td><td>162-23591</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>ReagentPack</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>（CC-5022：HEPES 缓冲盐溶液，CC-5012：胰蛋白酶/EDTA，CC-5002：胰蛋白酶中和液）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>转子</td><td>Himac</td><td>S100AT6-0242</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640（含酚红）</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>RPMI-1640（不含酚红）</td><td>Wako</td><td>186-02155</td><td>可使用任意供应商产品替代</td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Corning</td><td>3275</td><td></td></tr></tbody></table>

低密度脂蛋白存在下利用中性粒细胞胞外诱捕网刺激血管内皮细胞

Stimulation of Vascular Endothelial Cells Using Neutrophil Extracellular Traps in the Presence of Low-Density Lipoprotein

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）已被证实是多种非感染性疾病中的致病因素，并与动脉粥样硬化和血栓形成等心血管疾病密切相关。在血管壁中可观察到NET的形成，且有充分证据表明，NET形成的血浆标志物水平随疾病严重程度升高而增加。中性粒细胞来源的NET组分，包括髓过氧化物酶和蛋白酶，可影响血浆脂蛋白及血管稳态。本文描述了一系列利用在低密度脂蛋白（LDL）存在条件下形成的NET刺激血管细胞的方法。LDL通过超速离心法从人血浆中分离获得。HL-60细胞经全反式维甲酸诱导分化为中性粒细胞样细胞。转 视黄酸诱导其分化为类中性粒细胞，随后用佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）刺激以诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。去除并洗去PMA后，细胞进一步与低密度脂蛋白（LDL）共孵育。收集含有NET和LDL的上清液，立即用于刺激人主动脉内皮细胞（HAECs）。作为代表性反应，NET处理引起的HAECs形态学改变在LDL存在下进一步增强，提示NET形成与LDL联合作用可增强HAECs的反应性。这些方法有助于探究中性粒细胞活化及NET相关炎症状态下LDL对内皮细胞的影响，从而为血浆LDL水平升高相关的心血管疾病发病机制提供新的见解。

通过连续超速离心法从人血浆中去除乳糜微粒及极低密度脂蛋白（VLDL）组分后，将人血浆与溴化钾（KBr）溶液混合，调节密度至d = 1.063。此步骤中，残留的沉淀物未完全溶解于溶液中，应避免剧烈混匀以防止产生气泡，从而保持低密度脂蛋白（LDL）的完整性。超速离心后，通过肉眼观察顶部呈现的黄色至橙色层来鉴定LDL9（图1），该颜色可将其与下方无色溶液区分开来。通常情况下，在将收集的LDL组分对磷酸盐缓冲液/乙二胺四乙酸（PBS/EDTA）进行透析后，可从45–50 mL人血中获得约23–25 mL血浆，并从中分离出约4.3 mL的LDL组分，其蛋白浓度约为4 mg/mL。
用 2 µM AtRA 处理 HL-60 细胞可诱导其分化为类似中性粒细胞的细胞（dHL-60），细胞体积减小。值得注意的是，在制备 dHL-60 细胞时，应避免使用贴壁细胞培养皿，因为 dHL-60 细胞容易黏附于培养皿表面，导致细胞收获量减少。此外，与 HL-60 细胞相比，dHL-60...

本文描述了一系列方法，包括从人血浆中分离低密度脂蛋白（LDL）、将HL-60细胞分化为类似中性粒细胞的细胞、在LDL存在条件下制备中性粒细胞胞外陷阱（NETs），以及用NETs与LDL的混合物刺激人主动脉内皮细胞。

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）已被证实是多种非传染性疾病中的致病因素，并与心血管疾病相关……

中性粒细胞胞外诱捕网参与多种疾病的发生发展，包括心血管疾病。然而，中性粒细胞胞外诱捕网的形成与脂蛋白对血管细胞的协同作用仍不明确。利用本方案，目前仍在持续开展机制分析，以研究人主动脉内皮细胞在经中性粒细胞胞外诱捕网和低密度脂蛋白处理后，其炎症反应的诱导机制。我们已证明，高密度脂蛋白可抑制中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，而氧化型低密度脂蛋白、氧化型磷脂和溶血磷脂则促进NET的形成。首先，在4摄氏度条件下，将肝素抗凝管中采集的45至50毫升人全血以700 ×g离心15分钟。离心结束后，缓慢降低离心机转速，然后收集含有血浆组分的上层液体。将血浆组分在4°C条件下以700 ×g离心15分钟，重复两次，以彻底去除血细胞，每次均保持相同的减速设置。随后，每1毫升血浆中加入1微升250毫摩尔/升的EDTA溶液，以防止二价金属离子介导的脂蛋白氧化。将2.7毫升血浆加入超速离心管中。覆盖900微升含有250微摩尔EDTA的PBS。然后在4摄氏度下以600,000 ×g离心7分钟。接下来，弃去上层900微升液体，以去除乳糜微粒组分。在剩余血浆上方加入900微升含EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS），并在4°C条件下以600,000 ×g超速离心2.5小时。弃去上层900微升液体，以去除极低密度脂蛋白组分。然后向血浆中加入540微升浓度为0.5克/毫升的溴化钾溶液，将密度调节至1.063。使用移液器轻轻混匀内容物，并在4摄氏度下以600,000 ×g超速离心2.5小时。收集上层540微升含低密度脂蛋白的部分。将收集的组分转移至透析膜中，在4°C避光条件下，用含有EDTA的两升PBS缓冲液进行透析，以去除溴化钾。向12孔板的每孔中加入152 µL 0.01%多聚赖氨酸或0.1%明胶溶液，在室温下孵育至少5分钟。随后吸除孔内溶液，用200 µL无菌水洗涤一次，并在室温下让各孔完全干燥。将制备好的培养板在室温下保存，以备后续使用。按照与多聚赖氨酸相同的程序制备明胶包被的培养板。在添加2微摩尔全反式维甲酸的RPMI-1640培养基中，每10毫升培养2×10⁶个HL60细胞。用全反式维甲酸孵育四天后，收集 HL60 细胞。在 18 至 22 摄氏度条件下，以 220 ×g 离心 4 分钟。吸除上清液，然后用等体积的无血清 RPMI-1640 培养基重悬细胞并洗涤。将洗涤后的细胞在18至22摄氏度下以220 G离心4分钟，然后在无血清RPMI-1640培养基中重悬细胞。调整细胞浓度至每毫升2×10⁶个细胞后，将0.5毫升细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的12孔板的每个孔中。每孔加入100微升无血清RPMI-1640培养基，培养基中可含或不含300纳摩尔佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）。将细胞培养30分钟。随后，移除孔中的培养基。用无血清的RPMI-1640培养基洗涤细胞一次，并更换为含有0或20微克/毫升低密度脂蛋白的无血清RPMI-1640培养基。继续培养细胞两小时。将每孔中的培养基收集到离心管中，在18至22摄氏度下以700 ×g离心3分钟，以去除细胞碎片。进行刺激时，取人主动脉内皮细胞培养物，弃去旧培养基，加入0.5 mL新鲜培养基，将细胞孵育30分钟。最后，向人主动脉内皮细胞培养皿中加入167微升含有中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）和低密度脂蛋白（LDL）的类中性粒细胞培养上清液。用中性粒细胞胞外诱捕网刺激人主动脉内皮细胞可诱导其发生剂量依赖性的形态学改变，从铺路石样形态转变为细长形态。当使用LDL诱导生成的中性粒细胞胞外诱捕网进行刺激时，人主动脉内皮细胞的形态学改变更为显著，细长化形态在刺激后6小时即已明显可见。

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科研

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Biochemistry

生物化学

在低密度脂蛋白存在下使用中性粒细胞细胞外陷阱刺激血管内皮细胞

一种体外生成人中性粒细胞胞外诱捕网的技术

本视频展示了利用含有抗中性粒细胞胞质抗体的患者血清，在预标记的中性粒细胞中诱导并可视化中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的方法。此外，通过使用不可穿透细胞膜的DNA染料结合荧光显微镜，可实现对NETs的可视化观察。...

预标记中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网的诱导与可视化

体外刺激与巨噬细胞外陷阱的可视化

中性粒细胞在感染部位与活化的血管内皮细胞黏附是宿主炎症反应的重要组成部分。本报告所述为一种中性粒细胞结合实验，可用于 体外...

定量 体外 测定中性粒细胞在静息条件下对活化的人原代微血管内皮细胞黏附的实验方法

在以下实验方案中，我们描述了一种使用常规试剂从人全血中分离中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）的极为简便的方法。随后，我们展示了如何将分离得到的NETs用于一项 体外...

简化的人类中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）分离与处理

已知脂质在细胞功能中发挥重要作用。本文介绍一种通过高效薄层色谱（HPTLC）和高效液相色谱（HPLC）分析中性粒细胞脂质组成的方法，重点检测胆固醇水平，以更深入理解中性粒细胞胞外诱捕网形成的相关机制。...

研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法

本文介绍了一种方法，即从术后腹腔灌洗液中分离的人类低密度中性粒细胞（LDN）能够大量产生中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），并有效捕获随后生长的游离肿瘤细胞。...

由腹腔灌洗液中获取的低密度中性粒细胞产生的中性粒细胞胞外诱捕网促进肿瘤细胞生长与黏附

本文介绍了一种利用显微镜和荧光染色在活细胞培养中检测巨噬细胞胞外诱捕网（MET）生成的实验方案。该方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色来检测特定的MET蛋白标志物。...

体外刺激与可视化分化人单核细胞来源巨噬细胞的胞外诱捕网释放

本文介绍了一种诱导与分析的方法方案 体外...

由微生物和化学刺激物诱导的中性粒细胞胞外诱捕网的形态学与成分分析

本明确的实验方案描述了一种实时高通量显微镜技术，用于在体外可视化并定量人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的释放。in vitro...

实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

低密度中性粒细胞（LDN）在多种疾病中显著增加。通常通过细胞分选来分离LDN。本文介绍一种获取高纯度且具有活性的LDN的实用方法。外周血经密度梯度离心后，细胞与磁性微珠孵育，随后通过磁性柱分离LDN。...

快速磁珠法高效纯化低密度中性粒细胞

了解中性粒细胞胞外陷阱与低密度脂蛋白协同刺激人主动脉内皮细胞的方法。本研究分离人血浆LDL并制备NETs，分析炎症反应机制，为心血管疾病治疗提供新见解。

低密度脂蛋白存在下利用中性粒细胞胞外诱捕网刺激血管内皮细胞

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