可用于野外的无透镜成像平台用于自然杀伤细胞活化的快速无标记分析

我们的目标是通过无标记、无透镜成像技术实时定量自然杀伤细胞（NK细胞）的活化情况，从而快速评估免疫功能，以增强免疫监测能力。我们已证明，先天免疫指数（I3）能够可靠地区分健康供体与免疫功能低下供体的NK细胞活性，并且与细胞因子及流式细胞术标志物具有强相关性。现有的NK细胞检测方法需要使用标记物、大型仪器以及较长的孵育时间。

我们的LSIT平台通过简单的光电技术实现了快速、经济且无需标记的检测，填补了这一空白。我们的无标记LSIT平台利用阴影参数，在30秒内即可在单细胞水平上区分自然杀伤（NK）细胞的活化状态，从而无需染色和昂贵的流式细胞术。我们将进一步拓展LSIT的应用，用于监测T细胞和B细胞的活化，并整合深度学习算法，实现对不同免疫细胞状态的高通量分类。

首先，从冰箱中取出自然杀伤细胞（即NK细胞）分离试剂盒，放置至室温（15至28摄氏度）。准备好所需设备，包括磁力分离器、带无菌吸头的移液器，并将培养箱或加热块预热至37摄氏度。使用移液器将0.5毫升全血加入含有抗体混合液的绿色盖子反应管中。

用移液器轻轻吹打管内液体5到6次，使内容物混匀。然后将管子孵育5分钟。用移液器将绿色盖离心管中的全部内容物转移至红色盖分离管一中，并用移液器轻轻吹打管内液体5到6次，使其混匀。

将红色管盖的离心管置于磁力架上，室温孵育10分钟。保持磁力架位置不变，用移液器将约1.5毫升上清液转移至紫色管盖的分离管二中。用移液器轻柔吹打5至6次，使管内液体充分混匀。

现在，将带有紫色管盖的试管置于磁力架上，孵育10分钟。在磁力架仍处于固定状态时，用移液器将约1毫升上清液转移至带有灰色管盖的回收管中，并通过移液操作轻轻混匀管内物质。接下来，将100微升分离得到的自然杀伤细胞悬液加入载体管中，另取100微升加入激活刺激物混合液（即ASC）管中。

使用涡旋混合器轻轻混匀两根试管中的内容物，以确保均匀分布。将试管置于设定为 37 摄氏度的加热块或培养箱中孵育一小时。打开 LSIT 平台。

启动LSIT捕获软件。输入您的ID和密码进行登录，然后选择“校准”以进入校准模式。按下触摸屏上的“打开”按钮，或使用物理滑动门按钮打开抽屉。

抽屉打开后，取出校准玻片并妥善保存。现在，单击“设置背景”以校准光强。将校准玻片放回抽屉中，然后关闭抽屉。

然后，单击“开始校准”以完成该过程。从包装袋中取出一片检测板，标记样品信息，然后将其放置在干净、平坦的表面上。

用移液器将10微升的对照样品加入A和B通道，然后用移液器将10微升的ASC刺激样品加入C和D通道。现在，按“打开”按钮弹出抽屉。取下校准载玻片并放入储存盒中。将准备好的检测载玻片插入抽屉，然后按“关闭”按钮固定。

返回主菜单，从主屏幕中选择“NK细胞活性与检测”。输入样本编号或扫描条形码以加载样本信息，然后按“捕获”开始图像记录。

拍摄图像后，单击“分析”以开始处理。查看屏幕上显示的自然杀伤细胞活性百分比和细胞计数。通过触摸屏菜单将结果下载到U盘或打印。

在LSIT主界面选择细胞计数和检测。使用移液器将10 µL新样本加入到新的检测滑片通道中。将滑片插入抽屉。

使用触摸屏或按钮关闭抽屉，并在系统中输入样本编号。如果适用，请在触摸屏上输入稀释因子，然后按“计数”以开始细胞定量。在屏幕上查看以每微升细胞数表示的结果。

分析完成后，按下“打开”按钮或拨动物理开关以打开抽屉。戴上手套，取出抽屉中已使用的载玻片。最后，将校准载玻片重新放回抽屉中，以保护传感器，并通过触摸屏或物理拨动开关关闭抽屉。

集成软件的LSIT平台通过比较活化细胞与未刺激对照细胞的CSP值，对NK细胞活化进行定量评估，并提供包含汇总统计表的免疫报告。ASC刺激可诱导NK细胞发生明显的形态学变化，包括细胞体积增大和胞质复杂性增加，这在30分钟和两小时后的Hema 3染色Cytospin样本中可见。

阴影图像显示，与对照组相比，ASC刺激的细胞表现出明显更复杂的衍射图样，提取的参数表明峰-峰距离增加、细胞质颗粒度增强以及综合阴影参数升高。综合阴影参数值能够清晰区分健康供体与癌症患者，在活化与非活化自然杀伤细胞的单细胞分布中重叠极少。在ASC刺激后，健康供体的先天免疫指数值显著高于癌症患者。