Name: 使用荧光脂肪酸类似物定量内皮脂肪酸摄取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学习使用BODIPY荧光脂肪酸类似物定量检测内皮细胞脂质摄取的方法，该方法可揭示脂质代谢机制，为代谢性疾病治疗提供新靶点。

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Tanisha Choudhury 获得了北卡罗来纳大学教堂山分校本科生研究办公室提供的本科生暑期研究奖学金资助。Boa Kim 获得了美国国立心脏、肺和血液研究所（NHLBI，项目编号 R56HL162660）和美国心脏协会（AHA，项目编号 24CDA1264317）的支持。Ayon Ibrahim 获得了联合学院教师研究基金的资助。

本研究中使用的所有人源内皮细胞（HUVECs）均来自商业渠道提供的去标识化来源，符合机构和供应商关于人源生物材料伦理使用的指南。所有操作步骤均须在层流罩内的无菌环境中进行。所有试剂和设备的列表详见材料表。
1. 96孔板的明胶包被
<ol>
	<li>通过将25 mL的2%明胶储备液稀释于500 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，制备0.1%明胶溶液。</li>
	<li>充分混匀，并使用0.2 µm真空滤器过滤除菌（或进行高压灭菌）。</li>
	<li>向黑色透明底96孔板的每孔中加入100 µL 0.1%明胶溶液。</li>
	<li>在37 °C孵育至少30分钟，或理想条件下过夜孵育。</li>
</ol>
2. 细胞接种
<ol>
	<li>在完全培养基中制备内皮细胞的单细胞悬液。
	<ol>
		<li>通过向适当的基础培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素（两者均为v/v）来制备完全培养基。 
		注：基础培养基将根据具体细胞类型而有所不同；本研究中，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）使用内皮细胞生长培养基-2（EGM-2），EA.hy926细胞则使用杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将100 µL细胞悬液移入每个孔中，接种密度应确保细胞在次日达到汇合状态。</li>
</ol>
3. 治疗试剂的制备与应用
<ol>
	<li>使用含二价阳离子的 PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）配制所有试剂，并预热至 37 °C。
	<ol>
		<li>配制 3-HIB（阳性对照）工作液，浓度为 20 mM。将 1 M 的储备液用双蒸水溶解，于 4 °C 保存。</li>
		<li>配制乳酸（阳性对照）工作液，浓度为 20 mM。将 1 M 的储备液用双蒸水溶解，于 4 °C 保存。</li>
		<li>配制硝氯酚酰胺（阴性对照），终浓度为 1 µM。将 10 mM 的储备液用 DMSO 溶解，分装成小体积以避免反复冻融，并于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用预热的含二价阳离子 PBS 洗涤细胞一次。</li>
	<li>每孔加入 50 µL 相应的处理试剂（3-HIB、乳酸或硝氯酚酰胺），于 37 °C 孵育 30 分钟（硝氯酚酰胺）或 60 分钟（3-HIB 和乳酸）。</li>
</ol>
4. BODIPY-FA：BSA 复合物的制备与应用
<ol>
	<li>制备BODIPY-FA:BSA复合物：在PBS中按2:1的FA:BSA摩尔比，配制终浓度为0.5 µM、1 µM或2 µM的复合物溶液。例如，配制2 µM BODIPY-FA溶液时，需在PBS中加入1 µM无脂肪酸的BSA；配制1 µM BODIPY-FA时，则使用0.5 µM BSA，依此类推。孵育过程中始终避免光照。</li>
	<li>使用前于室温孵育混合物10分钟。</li>
	<li>向处理过的孔中加入50 µL复合物溶液。 
	注意：仅使用中间10列以避免边缘效应。外周列保留作为自发荧光对照，仅向这些孔中加入PBS。</li>
	<li>将培养板在37 °C孵育1分钟、5分钟或10分钟。</li>
</ol>
5. 荧光淬灭与细胞内信号检测
<ol>
	<li>用 PBS 配制 1 µM 无脂肪酸的 BSA 作为洗涤缓冲液，并预热至 37 °C。</li>
	<li>去除 BODIPY-FA:BSA，用 50 µL 预热的 1 µM 无脂肪酸 BSA（溶于 PBS）洗涤整块板两次，每次洗涤持续 1.5 分钟。</li>
	<li>加入 50 µL 0.08% 台盼蓝以淬灭胞外荧光。</li>
	<li>立即使用酶标仪测量胞内荧光，设置如下：激发波长：488 nm，发射波长：515 nm，截止波长：495 nm，检测模式：底部读数。 
	注意：使用第 4 步中未用 BODIPY-FA 处理的细胞（位于外侧列孔中）扣除自发荧光背景。</li>
</ol>
6. 用于细胞归一化的Hoechst细胞核染色
<ol>
	<li>移除台盼蓝溶液，并用 PBS 轻柔洗涤。 
	注意：细胞可能较为脆弱，容易脱落。洗涤时需小心操作。</li>
	<li>在 10% 培养基中加入 4 µg/mL Hoechst，37 °C 孵育 30 分钟。 
	注意：Hoechst 孵育时间可能需要优化。根据细胞类型不同，可能需要 5 至 60 分钟以实现均匀的细胞核标记和足够的信号强度。切勿将 Hoechst 加入外周列孔中。</li>
	<li>用 PBS 洗涤一次培养板。</li>
	<li>加入新鲜 PBS，使用以下参数测定 Hoechst 荧光：激发波长：350 nm，发射波长：461 nm，截止波长：455 nm，检测模式：底部读数。 
	注意：使用外周列孔扣除 Hoechst 的自发荧光背景。</li>
	<li>通过将步骤 5.3 中经自发荧光校正的 BODIPY-FA 荧光值除以步骤 6.4 中获得的相应 Hoechst 值，对 BODIPY-FA 荧光进行细胞数归一化处理。BODIPY 和 Hoechst 信号均应使用背景校正后的数值。 
	注意：最终数值代表经细胞数归一化并校正了 BODIPY 和 Hoechst 通道自发荧光后的 BODIPY-FA 摄取量。</li>
</ol>
7. 统计分析
<ol>
	<li>使用双因素方差分析（two-way ANOVA）对图2进行统计分析，以评估时间、浓度及其交互作用的影响。多重比较采用Tukey事后检验。</li>
	<li>在比较两种条件时，对图3和图4使用非配对双尾Student t检验。对于涉及三种或更多条件的实验，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Dunnett多重比较检验。</li>
</ol>

<ol><li>Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+across+the+cell+membrane%3A+regulation+by+fatty+acid+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Leukot+Essent+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters.</a> Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).</li>
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<li>Maiullari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+breast+cancer+dynamics+through+modulable+small+vessel+environment+bioreactor+%28sVEB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modeling breast cancer dynamics through modulable small vessel environment bioreactor (sVEB).</a> Biomaterials. 323, 123441(2025).</li>
<li>Murphy, A. R., Franco, R. A., Allenby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabricating+microfluidic+co-cultures+of+immortalized+cell+lines+uncovers+robust+design+principles+for+the+simultaneous+formation+of+patterned%2C+vascularized%2C+and+stem+cell-derived+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue.</a> Small. , e2501834(2025).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

该检测方法利用基于96孔板的实验体系和荧光标记的长链脂肪酸类似物，为内皮细胞（ECs）中脂肪酸（FA）摄取的测定提供了一种快速、定量且经济高效的技术。通过引入阳性和阴性对照，并在原代（HUVECs）和永生化（EA.hy926）内皮细胞中进行验证，本实验方案展现出良好的稳健性、可重复性及广泛的适用性。
基于荧光的分析方法在揭示内皮脂质转运的旁分泌调节因子方面发挥了重要作用，如前所述。4,5,7这些实例凸显了在受控条件下，标准化系统如何持续可靠地阐明代谢物驱动的脂质转运调控机制 体外 设置。本文所述方案确立了可靠测量FA摄取的关键参数，包括使用BODIPY-C12 和 BODIPY-C16 在多种浓度（0.5–2 µM）和孵育时间（1 min、5 min 和 10 min）下均表现出良好效果。该方法还能有效检测到3-HIB和乳酸刺激后摄取量的增加，以及经硝氯酚胺处理后的摄取减少，证实了其灵敏度和动态范围。尽管本实验体系在此针对内皮细胞（ECs）进行了优化，但通过调整BODIPY:BSA比例和处理条件，可轻松适用于其他细胞类型，如脂肪细胞、肌管细胞或肝细胞。此外，该方法还可修改用于活细胞成像（使用适配的培养板），或改为脉冲-追踪（pulse-chase）模式，以评估细胞内脂肪酸的滞留、代谢或外排情况。
与其他方法相比，该方法具有显著优势：可扩展性强、可定量，且适用于多种脂肪酸链长度。此外，该方法成本较低，步骤简便，仅需使用普通微孔板读数仪等常规仪器，使包括学生在内的新手能够快速掌握本实验方案。最后，与基于显微镜的定性方法或油红O等终点染色法（反映的是脂质累积含量）不同，本方案无需固定或裂解细胞，即可实时检测脂肪酸的摄取过程。
然而，仍需指出若干局限性。二维静态培养系统无法完全再现血管环境的生理复杂性。该简化模型中缺乏剪切应力或脂蛋白脂肪酶介导的脂解作用等关键因素，也不存在内皮细胞与实质细胞之间的相互作用。相比之下，微流控系统或基于类器官的三维共培养等先进体系能更真实地模拟 体内 结构与信号传导，尽管它们确实需要更高的技术专长和基础设施16,17例如，微流控生物反应器提供了一种环境，使内皮细胞能够模拟微血管的形成，并与其他组织类型相互作用，从而让研究人员能够在更接近生理条件的环境中模拟旁分泌动态过程18此外，最近的研究表明，可以开发出专门的系统，用于在三维水凝胶培养物中进行活体荧光成像¹⁹。这些进展增强了人们对此类技术应用的信心&#160;该检测方法未来或许可被改进并应用于更具生理代表性的细胞培养体系，但需进行相应的优化。
总之，该检测方法提供了一个灵活、便捷且可重复的平台，可用于在不同条件下研究细胞脂肪酸的摄取。尽管该方法最适用于机制性的体外研究，但由此系统获得的见解可为未来采用更具生理相关性的内皮脂质转运模型的研究提供参考。

为了使血液中的营养物质（如脂质）进入骨骼肌等代谢组织，它们必须首先穿过构成毛细血管壁的内皮细胞（EC）屏障。尽管长期以来人们认为脂肪酸（FAs）仅通过简单扩散方式穿过这一屏障以到达下方组织，但越来越多的证据表明，内皮细胞通过特化的转运机制主动调控这一过程，这些机制进化而来，用于将疏水性分子跨过水性的细胞外和细胞内环境进行转运1。
在血液中，脂肪酸（FAs）以与白蛋白结合的游离脂肪酸（FFAs）形式存在，或被包裹在富含甘油三酯的脂蛋白（TRLs）中，例如乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDLs）2。在内皮细胞（ECs）的管腔表面，脂蛋白脂肪酶（LPL）水解TRLs，释放出可供细胞摄取的FFAs。多种蛋白质参与脂肪酸的转运过程，包括负责将脂肪酸实际摄入细胞内的CD36；介导定向转运的脂肪酸转运蛋白（FATPs）和酰基辅酶A合成酶（ACSLs）；作为亲脂性分子伴侣的脂肪酸结合蛋白（FABPs）；以及其他众多尚未完全发现和分类的蛋白2,3。底层组织也采用类似的机制摄取转运而来的脂肪，尽管不同细胞类型中表达的具体同工型通常有所不同。
近期研究表明，内皮细胞（ECs）通过旁分泌信号与邻近细胞协调，调控脂肪酸（FA）向靶组织的转运。例如，骨骼肌细胞会分泌一系列旁分泌因子，如3-羟基异丁酸（3-HIB）、血管内皮生长因子B（VEGFB）和apelin，以促进邻近内皮细胞对脂肪酸的转运4,5,6。有趣的是，内分泌系统也可能参与其中，例如胰岛素刺激脂肪细胞释放乳酸，而乳酸同样可促进内皮细胞摄取脂肪酸7。
内皮细胞（ECs）因此充当脂肪的调节性守门人，表明其在心血管疾病或2型糖尿病等脂质代谢紊乱中发挥关键作用。最近的研究证据表明，内皮细胞自身在脂肪超载的情况下会积聚脂滴（LDs），可能作为缓冲系统，调节脂肪酸向深层组织的递送8,9。在高脂肪摄入的情况下（如现代饮食），这些脂滴的过度积聚可能导致血管功能障碍及相关疾病，包括高血压10。综上所述，更深入地理解内皮细胞摄取和转运脂肪酸（FAs）的机制，可能为治疗脂质相关疾病提供新的治疗靶点。
本研究中，我们描述了一种简单、快速且成本效益高的检测方法，利用荧光长链脂肪酸类似物BODIPY-C12和BODIPY-C16来测定内皮细胞对脂肪酸（FA）的摄取。这些试剂价格相对低廉且安全性较高，与传统用于测定细胞脂肪摄取的放射性或重同位素标记脂肪酸相比尤为如此11,12。需要特别注意的是，这些试剂不同于未结合的“游离”BODIPY染料，后者会被动地积聚在细胞的疏水区域，主要存在于脂滴（LDs）中13。相比之下，将BODIPY与脂肪族脂肪酸链（如C12或C16）结合后形成的分子在结构上模拟了天然长链脂肪酸。这种修饰使得能够特异性地检测脂肪酸动态进入细胞的过程，而非反映细胞内脂质储存或脂滴形成情况。
该方法的一个关键优势在于其灵活性。研究人员可以使用其他细胞类型、不同的孵育时间以及多种BODIPY标记的脂肪酸类似物来研究链长依赖性的脂肪酸摄取，甚至可以使用天然荧光脂质（如顺式-parinaric脂肪酸）14。总体而言，本实验方案将为研究人员提供一种简便的方法，用于在多种条件下检测细胞对脂肪酸的摄取，并为进一步回答脂质代谢、内皮生物学及代谢性疾病领域的基本科学问题奠定基础（图1）。

<table><tbody><tr><td>3-羟基异丁酸（3-HIB）</td><td>Cayman Chemicals</td><td>26105</td><td>阳性对照，终浓度为 5 或 20 mM</td></tr><tr><td>96 孔黑色、透明底聚苯乙烯微孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3603-48EA</td><td>用于接种待检测细胞</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12（Bodipy-FA）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>绿色荧光长链脂肪酸</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16（Bodipy-FA）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>绿色荧光极长链脂肪酸</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9205-50ML</td><td>用于制备 Bodipy:BSA 复合物</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>药物储备液的溶剂</td></tr><tr><td>一次性移液槽</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td>盛装需加至细胞的各种溶液</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Corning Life Sciences</td><td>10-013-CV</td><td>EA.hy926 细胞的培养基</td></tr><tr><td>EA.hy926 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922&amp;nbsp;</td><td>永生化内皮细胞杂交系</td></tr><tr><td>EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>HUVEC 细胞的培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>EGM-2 和 DMEM 中添加 10%</td></tr><tr><td>荧光微孔板读板仪</td><td>多种品牌</td><td>N/A</td><td>任何可进行荧光检测的微孔板读板仪</td></tr><tr><td>明胶溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100ml</td><td>用于包被培养板，工作浓度为 0.1%</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液</td><td>Life Science</td><td>62249</td><td>细胞核染色，用于细胞归一化（4 &amp;mu;M）</td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVECs）</td><td>Lonza</td><td>C2519A</td><td>原代人内皮细胞</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>VWR</td><td>76627-768</td><td>用于向 96 孔板中加样</td></tr><tr><td>Niclosamide&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>N3510-50G</td><td>阴性对照，终浓度为 1 &amp;mu;M&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>含钙镁的 PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21031CV</td><td>用于配制处理液及洗涤缓冲液（含 BSA）</td></tr><tr><td>不含钙镁的 PBS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-508</td><td>用于明胶稀释、Hoechst 染色及常规洗涤</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>EGM-2 和 DMEM 中添加 1%</td></tr><tr><td>钠-L-乳酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-5G</td><td>阳性对照，终浓度为 5 或 20 mM</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>使用浓度为 0.08%，用于淬灭胞外荧光</td></tr><tr><td>真空过滤系统，500 ml PES 膜，0.45&amp;micro;m</td><td>GenClone</td><td>25-227</td><td>用于明胶溶液的除菌过滤</td></tr></tbody></table>

使用荧光脂肪酸类似物定量内皮细胞脂肪酸摄取

Quantification of Endothelial Fatty Acid Uptake using Fluorescent Fatty Acid Analogs

内皮细胞（ECs）在调控脂肪酸（FA）从血液进入代谢组织的过程中起着核心作用，但目前仍缺乏可靠且可扩展的工具来定量检测ECs对脂肪酸的摄取。本文介绍一种快速、定量且成本效益高的检测方法，利用荧光标记的脂肪酸类似物（BODIPY-C12 和 BODIPY-C16），可在96孔板体系中测量ECs的脂肪酸摄取，并研究不同碳链长度脂肪酸的摄取动力学特征。该方案包含阳性对照（3-羟基异丁酸、乳酸）和阴性对照（硝氯酚酰胺），并在原代（HUVECs）和永生化（EA.hy926）内皮细胞系中均得到验证。该检测方法可检测时间依赖性和剂量依赖性的脂肪酸摄取，通过Hoechst细胞核染色对细胞数量进行归一化，并利用适当的对照进行背景校正。该方法可适用于多种细胞类型、成像模式和实验条件，包括活细胞成像和脉冲-追踪实验设计。与传统的脂质染色或放射性标记示踪剂方法相比，本方法在安全性、速度和灵活性方面具有优势，同时能够捕捉活细胞中动态的脂肪酸摄取过程。该检测体系为研究内皮细胞脂质转运的调控机制及其在代谢性疾病中的作用提供了可靠的实验平台。

如图1所示，该检测采用96孔板格式，将内皮细胞（ECs）直接接种于孔中。将BODIPY标记的脂肪酸（FAs）与牛血清白蛋白（BSA）偶联后，加入实验组和对照组孔中。在脂肪酸处理前，可通过药物处理或基因干扰（如siRNA转染或CRISPR基因编辑）对内皮细胞进行干预。关键的是，此类干预还可用于设置适当的阳性和阴性对照，以确保检测的可靠性。
在HUVECs和EA.hy926细胞中，将BODIPY-C12分别以0.5 µM、1 µM和2 µM浓度孵育1分钟、5分钟和10分钟后，观察到细胞内BODIPY-C12信号呈明显的剂量和时间依赖性增加（图2）。为校正每孔细胞数量可能存在的差异，将BODIPY-C12信号值归一化至Hoechst核染色，并通过荧光测定进行量化。背景自发荧光通过无BODIPY和无Hoechst的对照孔进行校正。
为验证检测方法的可重复性及检测范围，使用BODIPY-C在EA.hy926内皮细胞中检测了已知的脂肪酸代谢调节剂12 (图3）。用不同浓度的乳酸（0 mM、5 mM、20 mM）或3-HIB（0 mM、5 mM、20 mM）处理1小时，可增强BODIPY-C12 以剂量依赖性方式促进摄取，证实它们在脂肪酸摄取中发挥正向调控作用。相反，已有研究表明，化学物质硝氯酚胺（niclosamide）可抑制脂肪酸的摄取 通过 线粒体解偶联15事实上，本实验也获得了类似结果，经1 µM尼可刹米处理30分钟后，BODIPY-C的水平显著降低12 相对于溶剂对照组的信号，验证了其作为阴性对照的有效性。尽管这些数据已通过Hoechst染色进行归一化以校正细胞数量的差异，但这些处理均未改变细胞活力或Hoechst荧光值。
为了评估该检测方法对不同脂肪酸类似物的适用性，向 HUVECs 细胞提供了可视为极长链脂肪酸替代物的 BODIPY-C16，并在孵育 5 分钟后测定其摄取情况（图 4）。结果显示，乳酸处理（0 mM、10 mM、20 mM）以剂量依赖的方式增加了 BODIPY-C16 信号，而尼可刹米（1 µM）则降低了该信号，这一结果与 BODIPY-C12 的观察结果一致。
总之，该检测方法实现了对原代（HUVEC）和永生化（EA.hy926）内皮细胞中脂肪酸摄取的稳健且可重复的定量。此外，这些结果表明该检测方法适用于不同碳链长度的脂肪酸，同时验证了阳性和阴性对照的有效性。
<img alt="在96孔板中进行BODIPY-FA实验；荧光检测；细胞处理时间线示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68859/68859fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：使用BODIPY标记脂肪酸检测脂肪酸摄取的示意图。将内皮细胞接种至黑色、透明底的96孔板中，并与BODIPY偶联的脂肪酸（FA）类似物共同孵育，以实现细胞内摄取。孵育后，使用台盼蓝淬灭胞外荧光，再通过底部读数荧光酶标仪检测胞内信号。荧光检测完成后，加入Hoechst核染料以定量细胞数量，用于数据归一化。在BODIPY-FA孵育前，可进行药物处理或基因干预。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68859/68859fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Bodipy-FA 孵育结果，HUVEC 与 EA.hy926，荧光强度柱状图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68859/68859fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：原代与永生化内皮细胞中 BODIPY-C12 摄取的定量分析。（A）在 0.5 µM、1 µM 和 2 µM BODIPY-C12 分别与 0.25 µM、0.5 µM 和 1 µM 无脂肪酸 BSA 复合的条件下，HUVECs 经 1 分钟、5 分钟和 10 分钟孵育后，BODIPY-C12 摄取量呈时间和浓度依赖性增加。（B）EA.hy926 细胞在相同条件下也表现出类似的时间和剂量依赖性 BODIPY-C12 摄取。平均荧光强度经 Hoechst 染色的细胞核（细胞数量）和无 BODIPY 对照组归一化处理。数据以均值 ± 标准差表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）评估时间、浓度及其交互作用的影响，并进行 Tukey 事后检验以进行多重比较。结果显示时间（p &lt; 0.0001）、浓度（p &lt; 0.0001）及其交互作用（p = 0.0443）均具有显著的主效应。Tukey 检验识别出的具有统计学意义的两两比较结果在柱状图上标注如下：*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，以及 ****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68859/68859fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Lipid uptake assay results; graphs showing Bodipy-C₁₂ quantification under lactate, 3-HIB, niclosamide." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68859/68859fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 3"> 
图3使用EA.hy926细胞系中的阳性和阴性对照验证检测方法。 (A1小时乳酸处理（0 mM、5 mM、20 mM）增加了BODIPY-C12 以剂量依赖性方式摄取。 (B) 1小时3-HIB处理（0 mM、5 mM、20 mM）均显著增加脂肪酸摄取。C30分钟尼可酰胺处理（1 µM）显著抑制了BODIPY-C12 相对于溶剂对照（DMSO）的摄取量。平均荧光强度经Hoechst染色的细胞核（细胞数量）和无BODIPY对照归一化处理。数据以均值±标准差表示。2 µM BODIPY-C12 （与1 µM无脂肪酸BSA结合）在所有实验中均孵育5分钟。（统计学用于（A）和（B) 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验进行确定，而对于C则采用Student非配对双尾t检验 T检验. ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68859/68859fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="乳酸和尼可酰胺处理下Bodipy-C16/Hoechst比值的柱状图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68859/68859fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4：在HUVECs细胞中使用BODIPY-C16 进行检测验证。（A）乳酸处理（0 mM、10 mM、20 mM，处理1小时）以剂量依赖方式增强BODIPY-C16的摄取。（B）尼可酰胺处理（1 µM，处理1小时）与溶剂对照组相比，显著降低了BODIPY-C16 信号。平均荧光强度经Hoechst染色的细胞核（细胞数量）和无BODIPY对照组归一化处理。数据以均值±标准差表示。所有实验中，2 µM BODIPY-C16 （与1 µM无脂肪酸BSA结合）孵育5分钟。（A）的统计学分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验，（B）采用Student非配对双尾T检验。*p &lt; 0.05，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68859/68859fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案详细描述了一种 体外 测定BODIPY-C刺激下内皮细胞脂质摄取的实验方法12 和 BODIPY-C16 长链与超长链饱和脂肪酸的荧光类似物。该方法高效且可适用于其他细胞类型，为研究脂质代谢提供了一种有效的途径。

内皮细胞（ECs）在调控脂肪酸（FA）从血液向代谢组织转运的过程中发挥核心作用，然而，目前尚缺乏用于量化EC……的工具

血液中的营养物质（如脂肪酸）必须通过毛细血管内皮屏障进入代谢组织，但其机制尚不明确。阐明这些过程可能为治疗2型糖尿病等代谢性疾病揭示新的治疗靶点。因此，我们发现骨骼肌和脂肪组织均通过旁分泌代谢物调节内皮细胞对脂质的摄取和转运，这一过程也部分受到内分泌系统的调控。我们还发现，尽管内皮细胞已知主要依赖糖酵解产生的ATP，但线粒体ATP出乎意料地参与了内皮细胞对脂肪的摄取。利用本方案中所述的检测方法，我们计划进一步探究内皮细胞脂肪酸摄取与转运的分子机制，包括其他组织可能如何调控这一过程。首先，通过将25毫升2%明胶储备液加入475毫升PBS中，配制0.1%明胶溶液。充分混匀明胶溶液，并使用0.2微米真空滤器过滤除菌，或进行高压灭菌。用移液器向黑色透明底96孔板的每孔中加入100微升0.1%明胶溶液。将该板置于37°C培养箱中孵育至少30分钟，或过夜。孵育后，从预包被的96孔板中移除多余的明胶溶液，用PBS洗涤一次。然后，使用能够使细胞在次日达到汇合的接种密度，每孔加入100微升细胞悬液。配制3-羟基异丁酸和乳酸的20毫摩尔溶液作为阳性对照。阴性对照使用1微摩尔的硝氯酚胺。然后将上述溶液加入到另一个96孔板中。用预热的无二价阳离子 PBS 洗涤内皮细胞一次，移液时保持较大倾斜角度，以避免扰动已贴壁的细胞。每孔加入 50 µL 相应的处理试剂，将培养板置于 37 °C 孵育 30 分钟或 60 分钟。制备 BODIPY 脂肪酸-BSA 复合物时，将 2 µM 的 BODIPY 脂肪酸溶液与 1 µM 的无脂肪酸 BSA PBS 溶液混合。使用前将混合物在室温避光孵育10分钟。接着，向每个处理过的孔中加入50 µL制备好的BODIPY脂肪酸-BSA复合物，并将培养板在37 °C孵育5分钟。用PBS配制1 µmol/L的无脂肪酸BSA溶液作为洗涤缓冲液，并预热至37 °C。从孔中移除BODIPY脂肪酸-BSA复合物，并用50微升预热的洗涤缓冲液将整块板洗涤两次，每次洗涤1.5分钟。然后，向每孔加入50微升0.08%台盼蓝以淬灭胞外荧光。使用酶标仪立即检测胞内荧光。从孔板中移除台盼蓝溶液后，用 PBS 轻轻洗涤细胞。向每孔加入用 10% 培养基稀释的 Hoechst 染料，终浓度为 4 微克/毫升。将孔板置于 37 摄氏度孵育 30 分钟。然后，用 PBS 洗涤一次，以去除多余的染料。之后，向每个孔中加入新鲜的 PBS，并使用酶标仪检测 Hoechst 荧光。在 HUVEC 和 EA.hy926 细胞中，随着 BODIPY 脂肪酸浓度的升高，孵育 1 分钟、5 分钟和 10 分钟后，细胞内 BODIPY-C12 信号均显著增强。乳酸处理一小时后，在5毫摩尔和20毫摩尔浓度下，BODIPY-C12的摄取量呈剂量依赖性增加。3-羟基异丁酸处理亦显著增强了BODIPY-C12的摄取，且在20毫摩尔浓度时摄取量最高。用1微摩尔尼可刹米处理30分钟后，与未处理的DMSO对照组相比，BODIPY-C12的摄取量显著降低。在HUVEC细胞中与BODIPY-C16共孵育5分钟后，10毫摩尔和20毫摩尔乳酸处理均显著增加了BODIPY-C16的摄取，且呈剂量依赖性。与未处理的DMSO对照组相比，1微摩尔硝氯酚酰胺处理显著降低了BODIPY-C16的摄取。

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