使用荧光脂肪酸类似物定量内皮脂肪酸摄取

血液中营养物质，如脂肪酸，必须通过毛细血管内皮屏障进入代谢组织，机制尚不明确。澄清这些过程可能揭示治疗代谢疾病（如2型糖尿病）的新治疗靶点。因此我们发现，手术刀肌和脂肪组织都通过部分由内分泌系统控制的副分泌代谢物调节内皮脂质的摄取和运输。

我们还发现，尽管线粒体ATP已知依赖糖酵解ATP，但它们会意外地促进内皮脂肪的吸收。利用本方案中提出的检测方法，我们计划深入探讨内皮脂肪酸摄取和运输的分子机制，包括其可能被其他组织调控。首先，将25毫升2%明胶高汤加入475毫升PBS中，制备0.1%明胶溶液。

将明胶溶液充分混合，并用0.2微米真空滤器或高压灭菌器进行过滤消毒。使用移液器，将100微升0.1%明胶溶液加入黑色透明底96孔板的每个孔。将盘子放入37摄氏度的孵化箱中，至少30分钟或过夜。

孵育后，从预涂的96孔板中取出多余的明胶溶液。用PBS洗一次盘子。然后，利用播种密度将100微升细胞悬浮液移入每个孔，使细胞在次日内能够汇合。

制备20毫莫尔溶液，含3-羟基异丁酸和乳酸作为阳性对照。阴性对照使用一微摩尔尼氯酰胺。然后，将溶液移液到一个独立的96孔板中。

用预热的二价PBS洗涤内皮细胞一次，移液角度较陡，以避免破坏镀银细胞。每孔加入50微升相应处理试剂，并将平板在37摄氏度下孵育30分钟或60分钟。要制备BODIPY脂肪酸BSA复合物，将2微摩尔BODIPY脂肪酸溶液与1微摩尔无脂肪酸BSA混合PBS。

使用前，在室温下、黑暗中孵育10分钟。接着，将50微升预制的BODIPY脂肪酸BSA复合物加入每个处理过的井中，并在37摄氏度下培养板5分钟。在PBS中准备1微摩尔无脂肪酸BSA溶液作为洗涤缓冲液，预热至37摄氏度。

从孔中取出BODIPY脂肪酸BSA复合物，并用50微升预热洗涤缓冲液对整个板子进行两次清洗，每次清洗1.5分钟。然后，每孔加入50微升0.08%的锥蓝，以抑制胞外荧光。使用微板读取器，立即测量细胞内荧光。

从孔中取出锥蓝溶液后，轻柔地用PBS清洗细胞。每孔加入每毫升4微克的Hoechst染料，并以10%介质稀释。将平板在37摄氏度下孵育30分钟。

然后用PBS洗一次盘子，去除多余的染料。之后，向每个孔加入新鲜PBS，并用微板读器测量Hoechst荧光。在HUVEC和EA.hy926细胞中，随着BODIPY脂肪酸浓度升高，在1分钟、5分钟和10分钟的培养期内BODIPY-C12信号显著增加。

乳酸治疗一小时后，在5毫莫拉和20毫莫拉浓度下，以剂量依赖性方式提升了BODIPY-C12的摄取。3-羟基异丁酸治疗也显著提升了BODIPY-C12的剂量依赖性摄取，最高摄取量为20毫摩尔。使用1微摩尔尼氯酰胺30分钟治疗，使BODIPY-C12摄取显著减少，较未治疗的DMSO对照组更显著。

在HUVEC中与BODIPY-C16潜伏五分钟后，乳酸处理分别在10毫莫拉和20毫莫拉浓度下显著增加剂量依赖性摄取。与未治疗的DMSO对照组相比，1微粒摩尔尼氯酰胺治疗显著降低了BODIPY-C16的摄取。