利用三种不同方法的比较分析评估SASP因子对癌细胞增殖的影响

衰老的癌细胞会分泌多种影响邻近细胞的因子。本文介绍了三种体外模型，用于研究SASP对HeLa细胞增殖的旁分泌和邻近分泌效应。通过实时阻抗监测和活细胞成像，可进行动态、动力学及形态学分析，揭示传统终点检测方法无法观察到的衰老细胞及其微环境的旁分泌作用。首先，在接种细胞前开启实时细胞分析系统。

启动 RTCA 软件版本 2.0。单击 X 注释按钮并输入实验细节。单击计划按钮，并添加两个步骤，分别用于记录背景值，以及每 15 分钟监测细胞增殖一次，持续 72 小时。

选择第一步并点击播放。手动向电子培养板视图的每个孔中加入50微升完全培养基。接下来，用5毫升无菌预热的PBS洗涤衰老和非衰老的HeLa细胞。

吸除后，加入一毫升预热的0.05%胰蛋白酶，并进行孵育。用五毫升含抗生素的完全DMEM中和胰蛋白酶。然后，在室温下以500 ×g离心10分钟。

弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 5 毫升含抗生素的完全 DMEM 培养基中。现在，将非衰老的 HeLa 细胞以每孔 100 微升含抗生素的完全 DMEM 培养基接种至一个 e-plate view 的每个孔中。将 e-plate view 置于实时细胞分析系统的支架中，放入培养箱，使细胞贴附于培养板表面。

选择第二步，然后点击“播放”以开始阻抗测量。在三种不同的实验条件下，将细胞接种到含有60微升添加抗生素的完全DMEM培养基的e-plate插入式孔板孔中。将e-plate插入式孔板置于含5%二氧化碳的培养箱中，于37摄氏度下孵育6小时，以促进细胞贴壁。

细胞接种六小时后点击暂停，然后轻轻吸去E-plate视窗中每个孔的培养基，以去除血清和未贴壁的细胞。用预热至37摄氏度的PBS洗涤孔内两次。向E-plate视窗的每个孔中加入140微升无血清DMEM。

移除培养基。用 PBS 清洗 e-板插件中的孔，然后加入 60 微升无血清 DMEM。现在，将 e-板插件放入 e-板观察槽中。

轻轻按压，直至插入物完全嵌入孔板中。将组合好的板插入实时细胞分析系统。使用软件点击“播放”以恢复对细胞指数值的实时监测，监测间隔为15分钟。

在将e-plate视图和e-plate插入物组合并插入实时细胞分析系统时，对细胞指数值进行归一化处理。接下来，点击数据分析按钮，利用实时细胞分析系统获得的最大细胞指数和斜率数据计算细胞增殖速率和数量。然后，使用适当的统计学程序对数据进行分析。

吸弃含有衰老和非衰老 HeLa 细胞的两块六孔板中的培养基。用预热至 37 摄氏度的 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的血清和细胞碎片。每孔加入 2 毫升含抗生素但不含血清的 DMEM 培养基，然后将细胞置于含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中，37 摄氏度孵育 48 小时。

在超净安全柜中，将每个孔中的条件培养基收集到无菌管中。在4°C下，以1000 ×g离心收集的条件培养基10分钟，以去除细胞碎片，随后在4°C下以10,000 ×g离心10分钟，获得澄清的上清液。然后，使用2毫升超滤离心过滤装置，在4°C下以3000 ×g离心60分钟，将条件培养基浓缩至400 µL。

在超净安全柜中，用新鲜的无血清培养基稀释所获得的浓缩液，制备1倍、2倍和3倍浓度的条件培养基，并分装至无菌管中。待细胞贴壁后，轻柔吸除e-plate view各孔中的培养基，以去除血清和未贴壁细胞，随后用PBS洗涤。接着，将预先在37摄氏度温育的收集条件培养基200微升加入各组孔中。

将e-板视图插入实时细胞分析系统，点击“播放”以恢复对细胞指数值的实时监测，每15分钟记录一次，持续48小时。在三种实验条件下，将细胞接种到微孔载玻片上，并在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。贴壁8小时后，用预热至37摄氏度的PBS洗涤细胞两次。

每孔加入 200 微升无血清的杜氏改良伊格尔培养基。打开 Temp-controller 2002-2 并将其设置为 37 摄氏度。打开 CO2-Controller 2000 并将其设置为 5% 二氧化碳。

打开荧光光源。将载玻片放置在载物台培养箱上。启动计算机上的软件。

选择20倍物镜。添加相差通道和荧光FITC通道。使用载物台控制器，标记每个位置的坐标。

将时间间隔设置为30分钟，采集持续时间为48小时，然后开始采集。在两个时间点计数绿色荧光蛋白阳性细胞，并计算百分比增加量用于分析。阿霉素处理显著诱导了HeLa细胞的细胞衰老。

SA-β-gal 阳性细胞的定量结果显示，与对照组相比，多柔比星处理组中阳性细胞百分比显著升高。在第一种实验方法中，与衰老的 HeLa 细胞共培养的非衰老 HeLa 细胞，其增殖速率和能力均显著高于与非衰老 HeLa 细胞共培养的细胞。与来自非衰老细胞的条件培养基相比，来源于衰老 HeLa 细胞的条件培养基在 2 倍和 3 倍浓度下均显著提高了非衰老 HeLa 细胞的增殖速率和能力。

在第三种方法中，经过48小时共培养后，与衰老的HeLa细胞共培养的GFP阳性HeLa细胞的增殖增加程度显著高于与非衰老细胞共培养组或仅含GFP的对照组。