Name: 使用三种不同方法的比较分析评估 SASP 因子对癌细胞增殖的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 了解三种体外模型评估衰老相关分泌表型因子对HeLa细胞增殖的影响。实时阻抗监测和活细胞成像技术揭示细胞间动态相互作用，为肿瘤微环境研究提供新方法。

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本研究由加齐大学科学项目部（资助编号：TOA-2021-7321）和土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK，资助编号：122S564 和 223S969）提供支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

癌细胞与其微环境之间的动态相互作用对肿瘤进展至关重要，这会影响转移的诱导以及继发性肿瘤的形成。已有报道表明，衰老的癌细胞和间质细胞通过衰老细胞分泌的因子来调控肿瘤微环境4。这些因子可促进细胞增殖、迁移、侵袭和分化，并增强多药耐药性4,13。因此，理解衰老相关分泌表型（SASP）对周围癌细胞的影响，对于认识肿瘤微环境具有重要意义。
在本研究中，采用三种不同方法评估了SASP因子在非衰老癌细胞中的潜在促增殖活性。第一种方法可通过监测细胞指数值来实时追踪细胞增殖情况。e-板视图允许在相位对比显微镜下，通过在任意选定的孵育时间点暂停记录，对靶细胞（非衰老细胞）进行详细的形态学评估。即使在获取图像后，仍可使用ImageJ等程序对这些靶细胞的形态特征（如细胞大小）进行分析，并比较各组之间可能存在的差异。然而，该方法的一个潜在局限性在于，由于下室中存在培养基，可能会稀释上室细胞所分泌的因子，从而导致预期效应无法被充分观察到。...

在多细胞生物中，细胞通过旁分泌和邻分泌信号传导与微环境交换信息，从而影响彼此的行为。这种通讯可以直接通过隧道纳米管和间隙连接进行，也可以间接通过向细胞外基质分泌可溶性化学分子（如细胞因子、生长因子和趋化因子）来实现。这些信号传导机制在调控多种生理过程（包括组织发育和免疫细胞反应）中发挥关键作用，同时也参与多种疾病（如癌症、艾滋病、高血压和阿尔茨海默病）的发病机制1。
20世纪60年代，Leonard Hayflick发现正常人类成纤维细胞在体外具有有限的复制能力in vitro2。由于端粒随细胞分裂逐渐缩短而导致的这种有限增殖状态被称为复制性衰老。后续研究表明，多种类型的细胞应激也可触发细胞衰老。研究已证实，常见的癌症治疗方法（如化疗和放疗）同样可在癌细胞和基质细胞中诱导细胞衰老，这一现象被称为治疗诱导性衰老3,4。细胞衰老与机体衰老是具有层级关系但彼此不同的生物学过程。衰老细胞在机体内的累积通过促进炎症反应、组织功能障碍以及年龄相关疾病的发生而推动衰老进程。然而，与细胞衰老相比，衰老涉及更广泛的系统性事件和机制5。
衰老细胞的特征是细胞质扩张，明显大于正常细胞，并呈现扁平的形态6。这些衰老细胞的溶酶体活性增强，且对衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）呈阳性反应，该酶是一种溶酶体酶，即使在pH 6.0的酸性条件下仍保持活性。SA-β-gal染色是检测衰老细胞应用最广泛的生物标志物7。细胞核增大和形态不规则在发生衰老的细胞中常见。此外，这些细胞具有独特的染色质重排结构，称为衰老相关异染色质灶（SAHF），可介导不可逆的细胞周期阻滞8,9。
尽管衰老的癌细胞最终失去了增殖能力，但它们仍保持存活并具有代谢活性。已知衰老细胞会分泌多种因子以调节其细胞外肿瘤微环境，这种现象被称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）10,11。这些SASP因子包括可溶性信号分子（如白细胞介素、趋化因子和生长因子）、分泌型蛋白酶以及分泌的不溶性蛋白/细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分。总体而言，这些因子会产生有害的旁分泌效应，包括促进癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及诱导上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）4,12。此外，化疗引起的不良反应部分归因于衰老细胞的积累13。因此，研究衰老细胞与非衰老细胞之间的相互作用已成为癌症治疗领域的重要研究方向。特别是对SASP因子的分析，尤其是其组成成分及其对肿瘤微环境的影响，被认为是发现癌症治疗新靶点分子以及针对这些分子开发新药的有前景策略。
体外共培养技术长期以来被用于研究细胞间相互作用的理解14。在本方法学文章中，旨在利用三种不同的方法评估衰老细胞分泌的因子对非衰老癌细胞可能具有的增殖活性。此外，对三种不同方法所得结果进行了比较，并对每种方法各自的优缺点进行了批判性评价。
首先，建立衰老的HeLa细胞与非衰老的HeLa细胞之间的共培养模型，利用实时细胞分析系统实时监测癌细胞增殖可能发生的改变12。该系统包含两块培养板，用于评估细胞间的相互作用。形成下层的e-plate微孔板表面用于接种靶细胞，其底部设有微电极。靶细胞黏附于该表面所产生的电阻以可测量的参数——细胞指数（Cell Index, CI）表示。CI值与细胞数量及其对表面的黏附程度成正比15。此外，e-plate微孔板可在相差显微镜下对细胞进行形态学观察。形成上层的e-plate插入式培养室是效应细胞接种的区域，其底部覆盖有孔径为0.4 µm的半透膜。效应细胞分泌的因子可穿过该膜，作用于e-plate微孔板中的靶细胞。若此相互作用促进细胞增殖，则表现为CI值的升高。因此，可对细胞间的相互作用进行定量评估。
在第二种方法中，收集衰老的HeLa细胞的条件培养基，浓缩后添加至未衰老的HeLa细胞中。使用实时细胞分析系统监测这些细胞的潜在增殖效应。
在第三种方法中，计划将衰老的HeLa细胞与非衰老的GFP-HeLa细胞直接在二维条件下共培养，并在显微镜下实时监测癌细胞可能发生的增殖变化。
本实验的目的是建立三种模型，用于研究衰老的HeLa细胞与非衰老的HeLa细胞之间的相互作用，并实时监测癌细胞增殖可能发生的改变。因此，可方便地探究衰老癌细胞所分泌的SASP因子对其他癌细胞的影响。相应地，对这三种方法的优势与局限性进行了系统性评估。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;-Slide 8 孔高</td><td>&lt;img alt=&quot;公式 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/68883/68883eq1.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;bidi</td><td>80806</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 离心滤过装置 (Ultracel-3K)</td><td>Millipore</td><td>UFC200324</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱 (37&amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Controller 2000&amp;nbsp;</td><td>Pecon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>阿霉素</td><td>Tocris</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>E-plate INSERT 16&amp;nbsp;</td><td>ACEA Biosciences/Agilent</td><td>6 465 382 001</td><td></td></tr><tr><td>E-plate VIEW 16&amp;nbsp;</td><td>ACEA Biosciences/Agilent</td><td>300 601 140</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>&lt;img alt=&quot;公式 2&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/68883/68883eq2.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;AP Institute, Ankara, Turkey</td><td>H&amp;Uuml;K&amp;Uuml;K No: 90061901&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 倒置荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>衰老相关 &amp;beta;-半乳糖苷酶 (SA-&amp;beta;-gal) 染色试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling</td><td>9860S</td><td></td></tr><tr><td>载台式培养系统</td><td>Pecon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temp-controller 2002-2&amp;nbsp;</td><td>Pecon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染料</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP 系统&amp;nbsp;</td><td>ACEA Biosciences/Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用三种不同方法的比较分析评估sasp因子对癌细胞增殖的影响

Evaluating the Effect of SASP Factors on the Proliferation of Cancer Cells Using a Comparative Analysis of Three Distinct Methodologies

化疗诱导的衰老癌细胞还会分泌多种因子，称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP），以调控其细胞外微环境。既往研究报道，这些SASP因子对周围细胞具有有害的旁分泌效应，包括促进细胞增殖、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、血管生成及细胞迁移。若干 体外 共培养技术被广泛用于研究通过将相同或不同类型的细胞共同培养而产生的细胞过程。在此，利用三种互补方法研究了衰老的HeLa细胞分泌的SASP因子对非衰老HeLa细胞的潜在促增殖作用 体外 方法。第一种方法通过共培养衰老细胞与非衰老细胞，研究由衰老相关分泌表型（SASP）介导的旁分泌信号。第二种方法收集衰老癌细胞的条件培养基，经浓缩后用于检测条件培养基对细胞增殖的影响，并通过实时监测评估其效应。第三种方法将衰老细胞与非衰老细胞并排培养，以评估SASP通过直接细胞间接触介导的邻分泌效应。这三种实验模型均一致表明，SASP因子显著促进非衰老癌细胞的增殖。值得注意的是，与对照组相比，衰老细胞共培养使增殖速率提高64.6%，而3倍浓缩的SASP条件培养基使增殖增加超过50%。基于荧光成像的结果显示，在邻分泌条件下，GFP阳性细胞数量增加了49.3%。这些方法共同实现了对SASP诱导的增殖变化进行定性与定量评估。对这三种方法的比较分析揭示了各自的优势与局限性，为深入理解衰老细胞的旁分泌效应提供了重要见解。

本组代表性实验旨在研究衰老癌细胞产生的衰老相关分泌表型对其他癌细胞的潜在影响。因此，首先通过SA-β-Gal染色确认了72小时多柔比星处理是否可诱导HeLa细胞发生衰老。在衰老细胞中，溶酶体酶β-半乳糖苷酶即使在低pH条件下仍保持活性，并可裂解显色底物X-gal，形成蓝色沉淀17。因此，出现蓝色染色的细胞表明细胞衰老已被诱导。与对照组相比，多柔比星处理显著诱导了HeLa细胞的衰老，差异具有统计学意义，p &lt; 0.0001。（图1A、B，n=3）。形态学分析还显示，与对照细胞相比，衰老细胞表现出更大且更扁平的形态。图1C显示，经多柔比星处理的HeLa细胞条件培养基中IL-6水平显著高于对照细胞，p &lt; 0.0001。该结果也表明，多柔比星处理可诱导出明显的衰老相关分泌表型，提示细胞已进入衰老状态（<strong class="x...

本研究利用三种方法评估了衰老相关分泌表型（SASP）因子对非衰老HeLa细胞的增殖效应，这些因子来源于衰老的HeLa细胞 体外 具有实时监测功能的模型。系统比较了每种方法的优缺点，以更深入地理解癌症中的细胞间相互作用。

利用三种不同方法的比较分析评估SASP因子对癌细胞增殖的影响

化疗诱导的衰老癌细胞还会分泌多种因子，称为衰老相关分泌表型，以调控其……

衰老的癌细胞会分泌多种影响邻近细胞的因子。本文介绍了三种体外模型，用于研究SASP对HeLa细胞增殖的旁分泌和邻近分泌效应。通过实时阻抗监测和活细胞成像，可进行动态、动力学及形态学分析，揭示传统终点检测方法无法观察到的衰老细胞及其微环境的旁分泌作用。首先，在接种细胞前开启实时细胞分析系统。启动 RTCA 软件版本 2.0。单击 X 注释按钮并输入实验细节。单击计划按钮，并添加两个步骤，分别用于记录背景值，以及每 15 分钟监测细胞增殖一次，持续 72 小时。选择第一步并点击播放。手动向电子培养板视图的每个孔中加入50微升完全培养基。接下来，用5毫升无菌预热的PBS洗涤衰老和非衰老的HeLa细胞。吸除后，加入一毫升预热的0.05%胰蛋白酶，并进行孵育。用五毫升含抗生素的完全DMEM中和胰蛋白酶。然后，在室温下以500 ×g离心10分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 5 毫升含抗生素的完全 DMEM 培养基中。现在，将非衰老的 HeLa 细胞以每孔 100 微升含抗生素的完全 DMEM 培养基接种至一个 e-plate view 的每个孔中。将 e-plate view 置于实时细胞分析系统的支架中，放入培养箱，使细胞贴附于培养板表面。选择第二步，然后点击“播放”以开始阻抗测量。在三种不同的实验条件下，将细胞接种到含有60微升添加抗生素的完全DMEM培养基的e-plate插入式孔板孔中。将e-plate插入式孔板置于含5%二氧化碳的培养箱中，于37摄氏度下孵育6小时，以促进细胞贴壁。细胞接种六小时后点击暂停，然后轻轻吸去E-plate视窗中每个孔的培养基，以去除血清和未贴壁的细胞。用预热至37摄氏度的PBS洗涤孔内两次。向E-plate视窗的每个孔中加入140微升无血清DMEM。移除培养基。用 PBS 清洗 e-板插件中的孔，然后加入 60 微升无血清 DMEM。现在，将 e-板插件放入 e-板观察槽中。轻轻按压，直至插入物完全嵌入孔板中。将组合好的板插入实时细胞分析系统。使用软件点击“播放”以恢复对细胞指数值的实时监测，监测间隔为15分钟。在将e-plate视图和e-plate插入物组合并插入实时细胞分析系统时，对细胞指数值进行归一化处理。接下来，点击数据分析按钮，利用实时细胞分析系统获得的最大细胞指数和斜率数据计算细胞增殖速率和数量。然后，使用适当的统计学程序对数据进行分析。吸弃含有衰老和非衰老 HeLa 细胞的两块六孔板中的培养基。用预热至 37 摄氏度的 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的血清和细胞碎片。每孔加入 2 毫升含抗生素但不含血清的 DMEM 培养基，然后将细胞置于含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中，37 摄氏度孵育 48 小时。在超净安全柜中，将每个孔中的条件培养基收集到无菌管中。在4°C下，以1000 ×g离心收集的条件培养基10分钟，以去除细胞碎片，随后在4°C下以10,000 ×g离心10分钟，获得澄清的上清液。然后，使用2毫升超滤离心过滤装置，在4°C下以3000 ×g离心60分钟，将条件培养基浓缩至400 µL。在超净安全柜中，用新鲜的无血清培养基稀释所获得的浓缩液，制备1倍、2倍和3倍浓度的条件培养基，并分装至无菌管中。待细胞贴壁后，轻柔吸除e-plate view各孔中的培养基，以去除血清和未贴壁细胞，随后用PBS洗涤。接着，将预先在37摄氏度温育的收集条件培养基200微升加入各组孔中。将e-板视图插入实时细胞分析系统，点击“播放”以恢复对细胞指数值的实时监测，每15分钟记录一次，持续48小时。在三种实验条件下，将细胞接种到微孔载玻片上，并在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。贴壁8小时后，用预热至37摄氏度的PBS洗涤细胞两次。每孔加入 200 微升无血清的杜氏改良伊格尔培养基。打开 Temp-controller 2002-2 并将其设置为 37 摄氏度。打开 CO2-Controller 2000 并将其设置为 5% 二氧化碳。打开荧光光源。将载玻片放置在载物台培养箱上。启动计算机上的软件。选择20倍物镜。添加相差通道和荧光FITC通道。使用载物台控制器，标记每个位置的坐标。将时间间隔设置为30分钟，采集持续时间为48小时，然后开始采集。在两个时间点计数绿色荧光蛋白阳性细胞，并计算百分比增加量用于分析。阿霉素处理显著诱导了HeLa细胞的细胞衰老。SA-β-gal 阳性细胞的定量结果显示，与对照组相比，多柔比星处理组中阳性细胞百分比显著升高。在第一种实验方法中，与衰老的 HeLa 细胞共培养的非衰老 HeLa 细胞，其增殖速率和能力均显著高于与非衰老 HeLa 细胞共培养的细胞。与来自非衰老细胞的条件培养基相比，来源于衰老 HeLa 细胞的条件培养基在 2 倍和 3 倍浓度下均显著提高了非衰老 HeLa 细胞的增殖速率和能力。在第三种方法中，经过48小时共培养后，与衰老的HeLa细胞共培养的GFP阳性HeLa细胞的增殖增加程度显著高于与非衰老细胞共培养组或仅含GFP的对照组。

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癌症研究

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三种不同方法在乳腺癌细胞系中细胞增殖检测的比较

确定能够从临床前测试顺利过渡到人体试验的新药物靶点是当前科学研究的重点。为此，本文介绍了一种功能基因组学方法，用于研究基因耗竭对癌细胞系球状体的影响，该模型能更真实地模拟人类癌症 体内.

利用功能基因组筛选鉴定肿瘤细胞球状培养物中潜在的新型药物靶点

本文介绍了一种制备胰腺癌细胞与成纤维细胞三维（3D）球体共培养物的方法，随后利用细胞外通量分析仪测定其代谢功能。...

胰腺癌细胞与成纤维细胞三维球体共培养物的制备及代谢分析

我们描述了一种基于球体的三维模型的演变过程 体外...

基于球体的三维细胞培养模型在头颈部鳞状细胞癌治疗测试中的应用

在多种疾病适应症中，越来越多具有更高生理相关性的模型正被开发并应用于药物发现项目。本文所述的新型模型系统展示了如何在高通量的1536孔板系统中培养和筛选三维肿瘤球体，以寻找新的肿瘤学药物。...

用于药物筛选的高通量三维肿瘤球体的生成

本文介绍了几种用于评估三维肿瘤细胞球体存活与死亡的简单方法。相比二维培养，三维细胞球体能更真实地模拟体内肿瘤的理化梯度环境。因此，该球体模型可更准确地评估抗癌药物的疗效，并提高向体内条件的转化预测能力。...

评估癌细胞三维球状培养物中的细胞活力与死亡

本方案介绍了一种新颖、稳定且可重复的培养体系，用于从Caco2结肠腺癌细胞生成并培养三维球状体。研究结果首次证明了该方法适用于癌症干细胞生物学研究，包括对化疗反应的研究。...

用于研究结肠癌干细胞的三维类球体模型

本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。...

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

了解三种体外模型评估衰老相关分泌表型因子对HeLa细胞增殖的影响。实时阻抗监测和活细胞成像技术揭示细胞间动态相互作用，为肿瘤微环境研究提供新方法。

利用三种不同方法的比较分析评估SASP因子对癌细胞增殖的影响

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