使用两层微流控装置揭示组织稳态的机电控制

我们应用受控电场来研究组织如何对电线索做出反应，重点关注电流或电场如何调节细胞粘附、增殖和挤压，从而影响组织稳态。我们发现生理相关电流的方向决定了组织状态。顶端到基底野诱导增殖表型，而基底到顶端野促进细胞挤压，从而调节整体细胞密度。

虽然定量生物电学研究长期以来一直集中在通过重力迁移上，但组织稳态仍然无法实现。我们的系统现在可以直接研究生理纸盒如何调节组织组织和维护。我们的方案整合了微流体、组织电刺激、结构和力显微镜以及实时成像，以研究组织稳态的机电控制。

我们的工作揭示了核心机电耦合规则。借助新工具，我们现在可以探索天然生物电模式如何出现和调节组织，以及我们是否可以通过调整这些机电线索来控制复杂的组织行为。首先，将干净的一层聚二甲基硅氧烷或 PDMS 模具，面朝上放在干净的塑料盘盖上，然后在模具上缓慢添加 500 微升液体紫外线固化粘合剂。

使用抹刀小心地润湿所有突出的结构，并去除润湿过程中形成的任何气泡。将盖玻片轻轻压在 PDMS 模具上，并使用实验室擦拭器去除多余的紫外线固化粘合剂，确保盖玻片的顶部保持清洁和平坦。在波长在363至370纳米之间的均匀照明紫外线下部分固化结构。

使用 75% 乙醇擦去任何痕迹。然后，将结构牢固地固定在平坦的表面上，并慢慢地将 PDMS 模具从固化的层上剥离。然后，将干净的两层 PDMS 模具面朝下放在厚度大于 2.5 毫米的平坦 PDMS 板上。

用镊子从上方轻轻敲击模具特征。观察特征下方的界面是否变暗或光学对比度，以确认正确接触。现在，通过毛细管作用用液体紫外线固化粘合剂填充PDMS模具和板坯之间的空间。

如前所述，在紫外线下部分固化结构 10 秒。使用软垫镊子轻轻剥离 PDMS 板上的复合紫外线固化粘合剂层和 PDMS 模具。如有必要，用锋利的剪刀修剪固化粘合剂层的多余边缘。

接下来，将第一层连接到矩形玻璃盖玻片上的平面上放置。将仍附着在PDMS模具上的第二层与第一层对齐，并将两层用力压在一起，直到特征下方出现阴影。在紫外光下固化排列的结构10秒，将第一层和第二层粘合成两层微流控芯片，然后轻轻地将PDMS模具从粘合的芯片上剥离。

立即将 10 微升聚丙烯酰胺凝胶前体溶液移液到第二层狭缝正上方的组织区域中间。将直径为 10 毫米的圆形玻璃盖玻片轻轻压在液滴上，形成扁平凝胶。观察凝胶溶液通过狭缝流入第一层，并在一排阻隔柱处停止。

立即在紫外线下固化组装好的微流控芯片五分钟。然后，让芯片不受干扰约一小时，以使聚丙烯酰胺凝胶完全凝固。接下来，将微流控芯片在 pH 7.4 的 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液中孵育至少一小时，以水合凝胶并减少凝胶与盖玻片之间的粘附。

然后，轻轻地使用锋利的镊子从凝胶表面去除盖玻片。将医用级聚碳酸酯滤芯放在平坦的表面上，底部朝上，并将干燥的芯片面朝下与滤芯对齐。在芯片和滤芯之间的缝隙中移液 UV 固化粘合剂，通过毛细管效应填充它们，并在紫外线下固化。

通过将制造的微流控设备放置在生物安全柜内 200 至 280 纳米的紫外线下对其进行灭菌。在冰上的 1X DPBS 中制备所需体积的每毫升胶原蛋白 50 微克工作溶液。在冰上，通过稀释两微升 Sulfo-SANPAH 储备溶液来制备 Sulfo-SANPAH 工作溶液，该原液先前溶解在无水二甲基亚砜中，在 80 微升 pH 7.4 的冷 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液中，储存在 4 摄氏度。

用实验室湿巾轻拍聚丙烯酰胺凝胶的边缘，使其在设备内干燥。将 80 微升 Sulfo-SANPAH 工作溶液移液到凝胶表面，确保完全浸没，并将芯片置于紫外线下 5 分钟以激活 Sulfo-SANPAH。用pH 7.4的冷0.1摩尔HEPES缓冲液冲洗凝胶三次。

通过在凝胶上移液 80 微升 SS 工作溶液并在紫外线下照射 5 分钟来重复 Sulfo-SANPAH 处理。这一次，用冷的 1X DPBS 冲洗凝胶 3 次。最后，将 100 微升胶原蛋白一溶液移液到聚丙烯酰胺凝胶上，确保完全覆盖，并放置一小时。

用 1X DPBS 冲洗掉未附着的胶原蛋白 3 次，然后将凝胶浸入 1X DPBS 中直至进一步使用。使用螺钉将设备连接到插件上。然后，将最多四个设备插件组件固定到设计用于安装在显微镜载物台上的支架上。

将两毫升培养基添加到设备的每个主孔中，并通过废物清除通道冲洗并更换 1X DPBS。然后，将铂电极插入装有 45 毫升培养基的管中，确保它们完全浸没在介质中。用注射器将培养基拉过 Tygon 管并夹紧。

将充满介质的管的一端连接到电极室，另一端连接到设备。现在，按照胰蛋白酶酶或细胞悬液制备建议制备细胞悬液，并将 10 万个细胞接种到主孔中。将装置安装到显微镜上，电极室位于侧面，并将源仪连接到电极室。

使用具有相同通道电阻的三个设备。将一个分配为对照组。将心尖到基础电流施加到第二个设备，将基础到心尖电流施加到第三个设备。

在电流钳位模式下提供电信号，并提供 20 微安的总电流。选择 20 倍物镜，使用落射荧光显微镜进行全组织成像。最后，选择通道 561 用于红色荧光和明场通道。

在长时间成像期间选择一个一小时的时间间隔。垂直于细胞施加电刺激以破坏跨上皮电位，以研究其在不同电流方向下组织行为中的作用。在相差成像下，顶端到基端或ATB电流导致细胞连接在应用后10分钟内变亮，而对照和基底到顶端的BTA条件显示出低对比度和平坦的顶端表面。

ATB 电流在顶端细胞表面产生向外凸。凝胶变形在很大程度上取决于电流的方向。ATB 电流将凝胶向上拉，而 BTA 电流将凝胶向下压缩。

与对照相比，结E-钙粘蛋白强度在BTA电流下增加，但在ATB电流下显著降低。相对于对照，连接肌动蛋白强度在ATB电流下降低，但在BTA电流下没有显着增加。ATB 电流触发了单层上的多细胞活细胞挤出，而 BTA 电流保留了单层结构，类似于对照。

ATB电流下细胞分布的空间异质性显著较高，但在BTA和对照条件下保持较低且均匀。ATB 刺激下细胞增殖率增加，随着时间的推移分裂率更高。相比之下，BTA 电流诱导了更多的细胞死亡事件。