Name: 使用两层微流控装置揭示组织稳态的机电控制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 了解双层微流控装置如何揭示上皮组织稳态的机电调控机制。该研究通过施加生理电流，利用活细胞成像和机械应力测量，发现电流方向可调控细胞黏附、增殖与挤出行为。

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XJ、PX、FF 和 TBS 感谢与高绪梅博士、&#160;俞欣如以及西湖大学组织生物物理学实验室其他成员的有益讨论。我们感谢西湖大学定制技术服务设施（CTSF）在示意图绘制方面提供的协助。本工作得到西湖教育基金会、西湖大学生命科学与生物医学实验室以及西湖大学未来产业研究中心（RCIF）的支持。

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确保所有作者均已披露任何及所有利益冲突。

本方案提供了用于构建一种新型微流控装置的详细步骤和设计原理，以开展跨上皮电势扰动实验，并通过活细胞成像和力学生物学方法研究生物电效应。与其它相关方法相比，该方法的优势显而易见。例如，一种相关方法使用具有单通道设计的简单微流控芯片，施加平面内静态电流以研究电趋化性（即细胞迁移随电流密度变化的现象）15,16。这两种芯片设计在所施加电流的对称性以及电流所调控的细胞行为方面存在显著差异。诱导电趋化性的电流作用于细胞的前-后极性及细胞迁移过程，而扰动跨上皮电势（TEPD）的电流则作用于细胞的顶-基底极性及组织稳态。另一种与本方案中所述方法可比的技术是利用流体泵和类似微流控芯片结构，施加垂直于上皮平面的流体流动25。在此情况下，两种芯片在物理刺激的对称性方面相同，且不同物理刺激所诱导的细胞行为之间存在相似之处。然而，这两种方法在细胞对物理刺激响应的具体机制（一种源于电学刺激，另一种源于流体动力学刺激）、制造技术、细胞基底以及力学测量能力等方面仍存在差异。此外，本方案中的芯片不含任何机...

生物电信号是调控细胞行为的重要生物物理因素。最著名的例子是神经元和心肌细胞的动作电位，其可在长距离（长达一米）和高频率（高达数百赫兹）下传递电信号1。通过电极施加的电脉冲可用于刺激动作电位的产生，在科研和医学应用中具有重要意义2。在发育、伤口愈合和稳态等缓慢生理过程中，内源性生物电信号也已被测量，其持续时间可达数小时至数天3,4,5,6,7,8，并被证实存在9,10。一个重要的例子是汇合的上皮层，其主动维持数毫伏至数十毫伏范围内的跨上皮电位差（TEPD）4,11。这些汇合层中的切口或伤口会产生由组织电活动驱动的短路电流12,13。已有不同技术报道检测到高达数十 µA/cm2 的伤口电流和高达数百 mV/mm 的电场。研究表明，这些电信号为细胞提供了朝向伤口或感染部位迁移的方向性提示，在愈合过程中发挥重要作用3,6,14。总体而言，静态（或缓慢变化）和快速变化的电信号均具有重要意义，并可触发不同的细胞或组织反应。
在缓慢变化的信号领域中，一个重要的现象是电驱动的迁移过程，称为 &#34;电趋性&#34;在具有简单通道的微流控装置中，可施加可控的平面内伽伐尼电流以模拟伤口电流，同时研究细胞迁移随电流密度的变化情况15,160.1–1000 V/m 的电场（对应的电流密度为 0.1–1000 A/m²）2) 在多种细胞类型中被发现可驱动细胞迁移 体外 设置17，而参与趋化性（由化学梯度引导的细胞迁移）的经典信号通路（如PI3K）也已被证实参与电趋性7,18. &#34;极简的&#34; 用于研究电趋性（galvanotaxis）的微流控装置可通过标准的软光刻和微加工技术制备19这些装置通常由单通道的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底与载玻片键合而成（通道横截面尺寸：数百微米，长度：厘米级）。用于提供直流电流的电极安装在细胞区域之外，通过或不通过盐桥进行连接。盐桥连接可通过在PDMS基底上打孔、微流控连接器以及充满琼脂的管路实现。通道下方的简单玻璃载片（通常厚170 µm）还支持在电趋性实验期间进行高分辨率的活细胞成像，这是研究该过程的一个关键特性。
内源性电信号在维持组织稳态中的作用，相较于其在伤口愈合中的作用，研究仍十分有限。其中一个重要原因是缺乏适用于完整组织中研究这些效应的适当工具。由于几何结构的限制，现有的用于电趋性的微流控装置仅支持平面内电流，因而不适用于此类研究。在上皮稳态的研究背景下，亟需一种新型装置，以调控和干扰跨过融合上皮层的跨上皮电位差（TEPD）或垂直于平面的电流。为实现对单层细胞施加相对均匀的离子电流密度这一目标，我们设计并制备了一种在装置几何结构、材料选用及 原位 生物力学测量能力4后一种功能非常重要，因为电效应可能通过与生物力学和力学生物学通路的耦合作用影响细胞行为，而该功能可用于研究此类效应。
该新装置具有多项创新特性。其设计采用双层结构，而非传统电趋性装置中的单通道结构（几何设计上的创新），同时保持了与电极室的连接方式与后者相似。第一层微流控层设有通道，用于引导离子电流流向（或远离）组织区域；而第二层则设有一个开口，可将电流垂直引导穿过位于该第二层微流控层上方的上皮组织（图1A，B）。采用微加工技术制备足够薄的层，使得即使微流控层堆叠增加了样品厚度，仍可实现高分辨率共聚焦成像。另一项重要创新是，在装置中部引入了一种聚丙烯酰胺（PA）合成水凝胶，该水凝胶起着关键作用（图1A，B）。该凝胶的理化特性，如可修饰以包被细胞外基质蛋白的化学基团、对离子的通透性以及已知的弹性模量，分别对细胞黏附与生长、施加面外电流以及在电刺激过程中测量机械应力20至关重要。在组织区域的第一层中集成了屏障结构，用于限制PA凝胶前体溶液的扩散，这一设计此前已在微流控装置中应用21（图1A，B）。最后但同样重要的是，由于PA凝胶在对氧气具有通透性的PDMS表面会发生氧抑制聚合，因此装置 fabrication 采用了另一种材料22，以允许PA凝胶顺利聚合并实现牢固结合。所有这些创新特性对该新装置的正常运行均至关重要。
总体而言，这种新设备使得对完整组织稳态过程中静态或缓慢变化的生物电信号进行深入研究成为可能，其操作流程将在下文详细说明。本文所述的实验方案及结果主要针对Madin Darby犬肾上皮细胞II系（MDCK II），包括由电流诱导的细胞事件（增殖、死亡、脱落和迁移）以及组织结构的变化。这些研究对于希望应用该技术研究上皮细胞运输的电调控机制，以及细胞层乃至更复杂系统（如原代细胞和二维类器官）中细胞事件和细胞命运变化的科研人员也具有指导意义。

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯，TPM</td><td>Sigma</td><td>2530850</td><td>开启后需在氮气环境中储存。</td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>在 50 mL Falcon 管盖上打 4 个孔，以便电极和管路穿过管盖并浸入培养基中。每套微流控装置至少需要 2 个管盖。</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sinopharm</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺溶液，40%</td><td>Sigma</td><td>79061</td><td>有毒</td></tr><tr><td>空气泵</td><td>OKO lab</td><td>OKO-AP</td><td>显微镜台式培养箱的组件</td></tr><tr><td>过硫酸铵，APS</td><td>Aladdin</td><td>A112447</td><td></td></tr><tr><td>卡盒</td><td>-</td><td>-</td><td>卡盒为定制产品，设计参考补充材料。原材料为医用级 PC Makrolon 2858，更多详情请见：https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US</td></tr><tr><td>夹子</td><td>-</td><td>-</td><td>Robert 夹，用于外径 4.5 mm 的管路&amp;nbsp;。&lt;a href=&quot;https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&amp;amp;pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&amp;amp;spm=a21xtw.29978518.0.0&amp;amp;skuId=3344063585144"> 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lab</td><td>H201</td><td>显微镜台式培养箱的组件</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sinopharm</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F8318</td><td></td></tr><tr><td>荧光微球，0.1 &amp;mu;L，红色（580/605）</td><td>Thermo</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>气体室</td><td>OKO lab</td><td>H201-PRIOR-SP200/400/600</td><td>显微镜台式培养箱的组件</td></tr><tr><td>气体手动混合器</td><td>OKO lab</td><td>2GF-MIXER</td><td>显微镜台式培养箱的组件</td></tr><tr><td>遗传霉素</td><td>Gibco</td><td>10131027</td><td>GFP&amp;ndash;肌动蛋白和 H1&amp;ndash;GFP MDCK 细胞系使用添加了 0.5&amp;thinsp;mg/mL 遗传霉素（Gibco）的培养基维持培养，以保持其基因表达</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>736459</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sinopharm</td><td>80109218</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>LH-70155</td><td>实验室擦拭纸</td></tr><tr><td>较长螺丝</td><td>-</td><td>-</td><td>镍镀层圆头十字精密机械螺丝，M3 × 10 mm。&lt;a href=&quot;https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&amp;amp;pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&amp;amp;spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n"> https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&amp;amp;pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&amp;amp;spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>微流控连接器</td><td>-</td><td>-</td><td>聚丙烯直通接头，1/16&quot;-10-32UNF。&lt;a href=&quot;https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&amp;amp;detail_redpacket_pop=true&amp;amp;id=555839592609&amp;amp;ltk2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&amp;amp;ns=1&amp;amp;priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&amp;amp;query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&amp;amp;skuId=3600497427939&amp;amp;spm=a21n57.1.hoverItem.1&amp;amp;utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&amp;amp;xxc=taobaoSearch"> 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等离子体处理仪</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>用于 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 等离子体处理</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td>用于空气等离子体处理</td></tr><tr><td>塑料培养皿（直径 60 mm，高度 15 mm）</td><td>Nest</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>铂电极</td><td>天津艾达恒晟</td><td>Pt005</td><td>直径 0.5 mm，长度 37 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rain-X Original 玻璃防水剂</td><td>ITW Chemical Products</td><td>800002242</td><td></td></tr><tr><td>矩形盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>0107222</td><td>&amp;nbsp;1.5H，24 &amp;acute; 50 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，厚度 170 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>0111500</td><td>&amp;nbsp;1.5H，圆形，直径 10 mm</td></tr><tr><td>较短螺丝</td><td>-</td><td>-</td><td>镍镀层圆头十字精密机械螺丝，M3 × 4 mm。&lt;a href=&quot;https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&amp;amp;pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&amp;amp;spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n"> https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&amp;amp;pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&amp;amp;spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH，无需称量</td><td>Thermo</td><td>A35395</td><td>SS 储存液：20 mg/mL 溶于无水 DMSO，每次使用 2 &amp;mu;L；SS 工作液：0.5 mg/mL Sulfo-SANPAH 溶于 HEPES（0.1 M，pH 7.4）。</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>H052KCM147</td><td>最终产物为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。该试剂盒包含 PDMS 基体树脂和交联剂。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>温控单元</td><td>OKO lab</td><td>H201-T-UNIT-BL</td><td>显微镜台式培养箱的组件</td></tr><tr><td>四甲基乙二胺，TEMED</td><td>Sigma</td><td>110189</td><td>有毒</td></tr><tr><td>触摸屏显示器</td><td>OKO lab</td><td>OKO-TOUCH</td><td>显微镜台式培养箱的组件</td></tr><tr><td>十三氟-1,1,2,2-四氢辛基-1-三氯硅烷</td><td>Sigma</td><td>78560459</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管路</td><td>Tygon</td><td>AJK00002</td><td>外径（OD）= 3.2 mm，内径（ID）= 1.6 mm</td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Supmile</td><td>KD-300DE</td><td></td></tr><tr><td>紫外 LED 固化仪</td><td>GHUV</td><td>GHS-MFLG</td><td>紫外 LED 光源，发射波长范围：363&amp;ndash;370 nm，最大功率密度：230 mW/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>无振动加湿模块</td><td>OKO lab</td><td>HM-VF</td><td>显微镜台式培养箱的组件</td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>-</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>晶圆-层1</td><td>新加坡国立大学，机械生物学研究所微加工设施</td><td>-</td><td>晶圆为定制产品，设计参考补充材料。</td></tr><tr><td>晶圆-层2</td><td>新加坡国立大学，机械生物学研究所微加工设施</td><td>-</td><td>晶圆为定制产品，设计参考补充材料。</td></tr></tbody></table>

利用双层微流控装置揭示电机械调控在组织稳态中的作用

Revealing Electromechanical Control of Tissue Homeostasis Using a Two-Layer Microfluidic Device

细胞行为和细胞命运受到内源性或外源性电流传导或电场的影响。静态电信号可通过定制的微流控装置施加，以模拟发育、伤口愈合和稳态等缓慢生理过程中的电环境。一类重要的细胞电学研究是利用简单的微流控通道中静态平面内的伽伐尼电流来调控细胞迁移，模拟伤口电流，其电流密度约为 0.1–1000 A/m2。然而，由于几何结构不匹配，这些装置不适合研究组织稳态中的电效应，因为在组织稳态中，细胞具有顶-基底极性并形成跨上皮电位差（TEPD）。本文详细介绍了一种独特的基于微流控的装置，该装置可将生理离子流垂直施加于融合的上皮细胞层平面，以扰动跨上皮电位差，并研究电调控对组织稳态的影响。该装置由两层紫外光固化聚合物构成，内嵌柔软的聚丙烯酰胺凝胶基底，并在表面包被可选择的细胞外基质蛋白。该微流控装置提供了合适的几何结构和可渗透基底，可在厘米尺度的细胞层上诱导相对均匀的离子流。该系统兼容共聚焦活细胞成像和牵引力显微镜技术，可用于推断跨上皮电流诱导的机械应力。引人注目的是，在融合的上皮组织中，细胞的增殖、挤压和迁移会集体受到离子流方向的影响，从而诱导出一种新的组织状态，其特征表现为不同的细胞间相互作用强度、细胞事件（死亡与增殖）以及组织结构。这些受电调控的细胞行为可被理解为电诱导的机械应力及细胞响应。这一新型微流控装置与实验方案为力学生物学与生物工程领域提供了研究组织稳态中电效应所需的工具与详细操作文档，并有助于开发新型的组织工程应用。

本文所示所有结果均改编自先前的出版物4；更多细节请参考该出版物。
本方案允许在垂直于细胞或组织平面的方向上施加外部离子电流或电场。这种电刺激可扰动内源性的跨上皮电势差（TEPD），从而研究TEPD在调控组织行为中的作用。按照本方案，将野生型及基因编辑的MDCK细胞（GFP-肌动蛋白、H1-GFP和GFP-E-钙黏蛋白MDCK细胞）接种于装置上，并培养三天至完全融合。为研究电流方向的影响，将三个装置置于支架上，并连接至同一电极室和电流源表。其中一个装置作为对照组（无电流，用Tygon管夹闭），另外两个装置则以相反方向放置，使电流方向彼此相反（BtA：电流方向为基底侧至顶侧；AtB：电流方向为顶侧至基底侧）。整个装置安装于共聚焦显微镜上，并配备活细胞培养室，实验开始前平衡1–2小时。为观察整体组织行为，选用10倍或20倍物镜，因其具有较大的视野。在每个芯片上选择多个成像位置，如步骤4.2.3所述。电流根据步骤4.3.1进行施加。
施加电流产生的机电效应被用作初步指标，以检测电刺激是否...

本文介绍一种用于构建独特双层微流控装置的实验方案，以研究上皮组织稳态的电机械调控机制。该装置可施加垂直于组织平面的静态生理性电流，影响细胞间黏附、增殖及细胞挤出过程。通过活细胞成像和机械应力测量，揭示这些生物学过程的作用机制。

细胞行为和细胞命运受到内源性或外源性电流传导或电场的影响。静态电信号可以被施加……

我们施加可控的电场，以研究组织对电学信号的响应，重点关注电流或电场如何调控细胞黏附、增殖和脱落，从而影响组织稳态。我们发现，生理相关电流的方向决定了组织的状态：从顶面到底面的电场诱导了增殖表型，而从底面到顶面的电场则促进细胞脱落，从而可调控整体细胞密度。尽管定量的生物电研究长期以来一直集中于通过重力趋向性进行迁移，但组织稳态仍难以探究。我们的系统现在能够直接研究生理环境如何调控组织的结构与维持。本方案结合了微流控技术、组织电刺激、结构与力显微镜以及活体成像，以研究电机械调控在组织稳态中的作用。我们的研究揭示了核心的机电耦合规律。借助新工具，我们现在可以探索内源性生物电信号如何产生并调控组织，以及能否通过调节这些机电信号来控制复杂组织的行为。首先，将一层干净的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具正面朝上放置于洁净的塑料培养皿盖中，然后缓慢加入500微升液态紫外光固化胶至模具上。使用刮刀小心润湿所有突出结构，并去除润湿过程中形成的气泡。轻轻将盖玻片压在PDMS模具上，使用实验室擦拭纸去除多余的紫外光固化胶，确保盖玻片的上表面保持清洁和平整。在波长为363至370纳米的均匀紫外光照射下，对结构进行部分固化。使用75%乙醇擦去任何标记。然后，将结构牢固地固定在平坦表面上，缓慢地将PDMS模具从固化的第一层上剥离。接着，将一块干净的第二层PDMS模具朝下放置在厚度超过2.5毫米的平坦PDMS基板上。使用镊子从上方轻轻敲击模具的微结构。观察微结构下方界面是否变暗或出现光学对比，以确认接触良好。接着，通过毛细作用将液态紫外光固化胶填充于PDMS模具与平板之间的空隙中。将结构在紫外光下部分固化 10 秒，操作方式如前所述。使用带有软垫的镊子轻轻将复合紫外光固化胶层和 PDMS 模具从 PDMS 块上剥离。如有必要，可用锋利的剪刀修剪固化胶层多余的边缘。接下来，将连接在矩形玻璃盖玻片上的第一层放置于平坦表面上。将仍附着在PDMS模具上的第二层与第一层对齐，并用力按压两层，直至特征下方出现阴影。在紫外光下固化对齐后的结构10秒，使第一层和第二层键合形成双层微流控芯片，然后轻轻从键合好的芯片上剥离PDMS模具。立即用移液器将10微升聚丙烯酰胺凝胶前体溶液滴加到第二层中切口正上方的组织区域中央。轻轻将直径为10毫米的圆形玻璃盖玻片压在液滴上，形成一层平整的凝胶。观察凝胶溶液通过切口流入第一层，并在屏障柱列处停止。将组装好的微流控芯片立即在紫外光下照射五分钟进行固化。随后，将芯片静置约一小时，使聚丙烯酰胺凝胶充分固化。接着，将微流控芯片置于 pH 7.4 的 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液中孵育至少一小时，以水合凝胶并减少凝胶与盖玻片之间的黏附。然后，用锋利的镊子轻轻将盖玻片从凝胶表面取下。将医用级聚碳酸酯卡盒底部朝上放置于平整表面上，将干燥的芯片反向对准卡盒并贴合。用移液器将紫外光固化胶滴入芯片与卡盒之间的缝隙中，利用毛细作用使胶液充满缝隙，随后在紫外光下固化。将制备好的微流控装置置于生物安全柜内波长为200至280纳米的紫外光下进行灭菌。在冰上配制所需体积的50微克/毫升I型胶原工作液，溶剂为1X DPBS。在冰上配制Sulfo-SANPAH工作液：取2微升Sulfo-SANPAH储存液（先前溶于无水二甲基亚砜），加入80微升预冷的0.1摩尔HEPES缓冲液（pH 7.4，4°C保存）中稀释。用实验室擦拭纸轻轻擦拭聚丙烯酰胺凝胶边缘，以在装置内将其干燥。将80微升Sulfo-SANPAH工作溶液用移液器滴加至凝胶表面，确保完全浸没，然后将芯片置于紫外光下照射5分钟以活化Sulfo-SANPAH。用冰冷的0.1摩尔HEPES缓冲液（pH 7.4）冲洗凝胶三次。通过移液枪将80微升SS工作液加至凝胶上，并在紫外光下照射五分钟，重复Sulfo-SANPAH处理。此次用预冷的1×DPBS缓冲液清洗凝胶三次。最后，向聚丙烯酰胺凝胶上移取100微升I型胶原溶液，确保完全覆盖凝胶表面，并静置一小时。用 1× DPBS 将未结合的胶原蛋白冲洗三次，然后将凝胶浸没在 1× DPBS 中，直至后续使用。使用螺丝将装置固定到插件上。然后，将最多四个装置插件组件固定到专为安装在显微镜载物台上而设计的支架上。向每个装置的主孔中加入 2 毫升培养基，并通过废液清除通道冲洗并替换 1X DPBS。然后，将铂电极插入含有 45 毫升培养基的试管中，确保电极完全浸没在培养基中。使用注射器通过Tygon管路抽取培养基，并用夹子夹紧管路。将充满培养基的管路一端连接到电极室，另一端连接到设备。接着，按照胰蛋白酶消化或细胞悬浮液制备的建议制备细胞悬液，并将10万个细胞接种至主孔中。将装置安装到显微镜上，电极室置于两侧，并将源表连接至电极室。使用三个通道电阻相同的装置。将其中一个设为对照组。对第二个装置施加从顶端到基底的电流，对第三个装置施加从基底到顶端的电流。在电流钳模式下获取电信号，并施加20微安的总电流。使用倒置荧光显微镜对整个组织进行成像时，选择20倍物镜。最后，选择561通道用于红色荧光，以及明场通道。在长时间成像过程中选择一个一小时的时间段。施加垂直于细胞的电刺激，以破坏跨上皮电势，研究其在不同电流方向下对组织行为的作用。在相差成像下，从顶面到底面（ATB）的电流在施加后10分钟内导致细胞连接处变亮，而对照组及从底面到顶面（BTA）的条件则显示对比度低且顶面平坦。ATB电流在细胞顶面产生向外的凸起。凝胶变形显著依赖于电流方向。ATB电流将凝胶向上拉，而BTA电流则将凝胶向下压缩。在BTA电流下，连接处E-钙黏蛋白的强度增加，而与对照组相比，在ATB电流下显著降低。连接处肌动蛋白的强度在ATB电流下降低，但在BTA电流下相对于对照组未显著增加。ATB电流引发了跨越单层的多细胞活细胞挤出，而BTA电流则维持了单层结构，与对照组相似。在ATB电流条件下，细胞分布的空间异质性显著更高，而在BTA和对照条件下则保持较低且均匀的水平。在ATB刺激下，细胞增殖率增加，随时间推移分裂速率更高。相比之下，BTA电流诱导了更多的细胞死亡事件。

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生物工程

使用两层微流控装置揭示组织稳态的机电控制

我们展示了制造和自动化弹性聚二甲基硅氧烷（PDMS）微阀阵列的方案，该阵列无需额外能量即可关闭，并具有光刻定义的精确体积。同时介绍了并行亚纳升级体积混合器和集成式微流控灌注系统。...

由弹性微阀阵列控制的微流控芯片

我们演示了一种简单微流控装置的制备方法，该装置可与标准的电生理实验系统集成，以精确控制的方式将脑切片的微尺度表面暴露于不同的神经递质中。...

使用微流控网络与标准灌流室刺激脑切片

来源：Kurz, D. L., 等。用于研究多孔介质中生物堵塞的微流控平台。J. Vis. Exp.

一种用于生物膜形成过程中实时成像与压力追踪的微流控装置

本文介绍了一种在微流控多器官芯片中对原代细胞、组织模型和打孔活检样本进行共培养的实验方案，培养时间可长达28天。人皮肤微血管内皮细胞、肝细胞聚集体和皮肤活检组织已成功在共同培养基循环系统中实现联合培养。...

多器官芯片——一种用于长期多组织共培养的微流控平台

集成流体组件的微加工器件为 体外 模拟细胞研究的平台 体内...

设计用于研究细胞在单一或共存化学/电/剪切应力刺激下响应的微流控装置

本文描述了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的多层微流控装置的制备过程，该装置可实现体外转录与翻译（IVTT）反应的长期进行。此外，还全面概述了实现并维持这些反应长期自动化的所需硬件与软件。...

一种用于持久无细胞基因表达的多层微流控平台

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

对活体组织进行实时分析可获得重要的功能性和机制性数据。本文介绍了利用一种新型无泵多通道流体系统维持并评估多种组织和细胞模型的实验方案及关键变量，以确保所获取数据的准确性和可重复性。...

使用一种新型无泵流体系统维持和评估眼部多种组织和细胞类型

本方案描述了一种可重构的基于膜的细胞培养平台，该平台将开放式孔板格式与流体流动功能相结合。该平台与标准操作流程兼容，能够在开放式孔板和微流控培养模式之间进行可逆转换，满足工程学与生物科学实验室的不同需求。...

将静态屏障组织模型转化为动态微生理系统

本文介绍了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的双层装置的制备方法，用于在油包水乳液（液滴）中生成组合文库。方案中详细描述了实现液滴自动化生成所需的硬件和软件，并展示了荧光液滴定量文库的制备过程。...

用于组合式液滴生成的双层微流控装置

在此，我们介绍一种用于构建和运行微流控系统的方案，该系统可使内皮细胞同时暴露于振荡性高血糖和脉动性剪切应力。该方法具有生理相关性...

一种用于模拟生理脉动剪切应力与振荡性高血糖共同作用下内皮功能障碍的微流控系统

了解双层微流控装置如何揭示上皮组织稳态的机电调控机制。该研究通过施加生理电流，利用活细胞成像和机械应力测量，发现电流方向可调控细胞黏附、增殖与挤出行为。

利用双层微流控装置揭示电机械调控在组织稳态中的作用

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