用阿尔新蓝染色后斑马鱼颅面组织的解剖

我们正在利用固定样本以及采用光片显微镜对胚胎进行高时空分辨率的时间序列成像，探索斑马鱼腭部随时间发育的机制。我们的实验方案简单易行，详细阐述了如何解剖并分离五日龄斑马鱼幼虫的颅面软骨。

该方案已实现对腭部形态在组织和细胞尺度上的精细表征，最终使我们能够评估评论性抗原对腭部形态发生的影响。首先，获取20至25条麻醉后的斑马鱼幼体，并在幼体停止活动后移除麻醉剂。向离心管中加入1.5毫升4%多聚甲醛，将样品置于摇床上，在室温下以每分钟60转的速度固定2小时。

使用移液器尽可能吸除管中的固定液。然后向样品中加入 1.5 毫升 50% 乙醇，并将管置于摇床中，室温下以每分钟 60 转的速度振荡 10 分钟。接着使用移液器吸去管中的乙醇，并向样品中加入 1.5 毫升阿新蓝染色液。

将幼虫置于染色液中，在室温下以每分钟60转的振荡速度孵育18至20小时。随后，用移液器移除染色液，并在室温下于摇床上用1.5毫升蒸馏水洗涤幼虫1至2分钟。然后向样品中加入1毫升漂白液，在室温下孵育20分钟，期间无需覆盖管口。

使用移液器从样品中移除漂白溶液，然后依次用透明化溶液一和溶液二处理样品。移除溶液二后，向样品中加入1.5至2毫升的保存溶液。由于含有甘油，染色后的样品将在10分钟内逐渐沉降至底部。

将染色的幼虫置于涂有琼脂糖的培养皿中，使其侧卧。用镊子轻轻刮去幼虫体上的卵黄。去除卵黄后，将幼虫转移至新的培养皿中，以避免解剖过程中受到干扰，用一对镊子夹住幼虫头部后方附近固定。

用另一对镊子小心地去除眼睛，避免损伤周围颅面结构。用一对镊子夹住幼虫的同时，在神经颅背侧组织的中央做一切口。然后夹住并取出脑组织及其相关组织。

接下来，将幼虫的头部与身体其余部分分离。所获得的头部区域应包含神经颅和仍附着于前后两端的内脏颅。用镊子小心切断神经颅与内脏颅之间的两个连接点，以完全分离二者。

最后，在干净的玻璃载玻片上滴加一至两滴100%甘油，将解剖好的神经颅或内脏颅转移至载玻片上。用镊子轻轻将盖玻片覆盖在组织上，确保不残留气泡，并在成像前用指甲油密封盖玻片。解剖得到的神经颅显示出多个清晰可辨的结构，包括筛板、脊索软骨和心包软骨，便于进行详细的结构分析。

内脏颅骨包括迈克尔软骨以及腭方软骨和基鳃软骨等其他结构。受精后五天的阿辛蓝染色可清晰显示筛骨板。通过图像分析可稳定测量筛骨板的宽度和长度，其长度显著大于宽度，并对15个样本进行了定量数据分析。

从图像数据中提取了筛骨板区域，并通过具有清晰边界标记的定量分析予以确认。在筛骨板中观察到明显的细胞排列，内侧区域为立方状细胞，外侧部分为柱状细胞。Dappy染色使得筛骨板内单个细胞核得以可视化。