用阿尔新蓝染色后解剖斑马鱼颅面组织

我们正在使用固定样品以及使用光片显微镜对胚胎进行高时空分辨率的延时成像，探索斑马鱼上颚随时间生长的机制。我们的协议简单易懂。它规定了解剖和分离五天大斑马鱼幼虫的颅面软骨的详细步骤。

该协议能够在组织和细胞尺度上仔细表征上颚形状，最终使我们能够评估评论抗原对上颚形态发生的影响。首先，获得 20 至 25 只麻醉的斑马鱼幼虫，并在幼虫停止移动后取出麻醉剂。向试管中加入 1.5 毫升 4% 多歧异醛，并将样品放在室温下设置为每分钟 60 转的摇杆上两小时。

使用移液器，从管中取出尽可能多的固定剂。然后向样品中加入 1.5 毫升 50% 乙醇，并将其放在室温设置为每分钟 60 转的摇杆上 10 分钟。现在使用移液器，从管中吸出乙醇，并向样品中加入 1.5 毫升阿尔新蓝染色溶液。

将幼虫在室温下在染色液中孵育18至20小时，同时以每分钟60转的速度摇摆。接下来，使用移液器去除染色溶液，并在室温下用 1.5 毫升蒸馏水在摇杆上清洗幼虫一到两分钟。然后向样品中加入一毫升漂白剂溶液，在室温下孵育20分钟，不要盖管。

使用移液器，从样品中取出漂白剂溶液，并用组织透明溶液一和二处理样品。取出溶液二后，向样品中加入1.5至两毫升储存溶液。由于甘油含量，观察染色样品在10分钟内逐渐沉入底部。

将染色的幼虫在其侧面放入琼脂糖涂层培养皿中。用镊子轻轻刮掉幼虫身上的蛋黄。去除卵黄后，将幼虫转移到新鲜的培养皿中，以避免解剖过程中的干扰，使用一对镊子将幼虫固定在头部后部附近。

用另一副，小心地去除眼睛，不要损坏周围的颅面部结构。在握住幼虫的同时，仍然用一对镊子，在神经颅背侧的组织中心做一个切口。然后捏住并拉掉大脑和相关组织。

接下来，将幼虫的头部与身体的其他部分分开。由此产生的头部区域应包括神经颅骨，以及仍附着在前端和后端的内脏颅骨。用镊子小心地切断神经颅骨和内脏颅骨之间的两个连接点，将它们完全分开。

最后，将一两滴 100% 甘油滴在干净的载玻片上，并将解剖的神经颅骨或内脏颅骨转移到载玻片上。使用镊子，轻轻地将盖玻片放在组织顶部，确保没有气泡被困住，并在成像前用指甲油密封盖玻片。解剖的神经颅骨显示出多个清晰标记的结构，包括筛板、小梁和心包软骨，能够进行详细的结构分析。

内脏颅骨包括梅克尔软骨，以及腭方体和基底鳃软骨等其他元素。受精后五天的阿尔新蓝染色使筛板的清晰可视化。筛板的宽度和长度通过图像分析始终可以测量，并且长度显着大于宽度，并量化了 15 个样品的数据。

从图像数据中提取筛板面积，并通过清晰边界标记的定量进行确认。筛板观察到明显的细胞排列，内侧区域有长方体细胞，外侧有柱状细胞。Dappy染色允许筛板内单个细胞核的可视化。