Name: 患者来源的前列腺癌类器官的建立和维持：详细的实验方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解患者来源前列腺癌类器官的建立与维持方法，该标准化方案可保留亲本肿瘤关键特征，为药物筛选和精准医疗研究提供可靠的三维细胞培养模型。

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作者衷心感谢国家自然科学基金（项目编号：82172831）和江苏省卫生健康委员会重点研究项目（项目编号：X20240121）的支持。

本研究经无锡市第二人民医院医学伦理委员会审查并批准（批准文号：Y-38 (2023)）。所有参与者均签署了书面知情同意书。患者数据经过去标识化处理，以确保符合伦理标准的隐私保护。
1. 样品采集
<ol>
	<li>组织获取
	<ol>
		<li>取样前准备
		<ol>
			<li>纳入标准：确保所有参与者均经病理学或影像学检查确诊为前列腺癌。肿瘤样本来源于手术切除、活检或其他临床标本。确保所有参与者年龄在18岁及以上，且无其他恶性肿瘤，以排除其他癌症对前列腺癌研究的潜在干扰。从所有参与者处获取书面知情同意书，同意参与本研究并允许其样本用于科学研究。</li>
			<li>排除标准：排除样本中肿瘤组织量不足以进行培养或分析的患者。排除在研究过程中撤回同意或无法提供所需样本的患者。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>前列腺穿刺活检样本：使用专用穿刺针从前列腺组织中获取样本。立即将组织置于保存液（Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) 培养基 + ROCK抑制剂溶液（1:2000稀释））中，并在冰上运输，确保在24小时内送达实验室。 
		注：应精确定位前列腺癌组织，并在不同解剖区域进行多点取样。每个部位进行1-2次穿刺，每次获得≥1 cm的组织芯样本。</li>
		<li>根治性前列腺切除术样本：采集后立即将样本放入保存液（adDMEM/F-12培养基 + ROCK抑制剂溶液（1:2000稀释））中，并在冰上运输，确保在24小时内送达实验室。 
		注：通过根治性前列腺切除术可获得更多的组织碎片15。 
		采集样本应≥1g（≈5 mm直径），尽量减少正常组织的污染。术前与临床医生协调明确取样部位：1）肿瘤核心区；2）肿瘤周围组织；3）正常对照组织。优先选择质地较硬、呈灰黄色变色的组织碎片。若无法明确识别，则采用系统性随机取样法。样本采集信息请参见表1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本处理
	<ol>
		<li>标记与分类：对收集的组织样本进行清晰标记（包括患者姓名、住院号、组织名称、组织部位和组织类型）。</li>
		<li>冷冻保存：样本采集后应立即处理（≤12小时）。将样本置于预冷（4 °C）的保存液（adDMEM/F-12培养基 + ROCK抑制剂溶液（1:2000稀释））中，并在4 °C条件下保存。为获得最佳效果，应在4-6小时内进行后续实验操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运输与储存
	<ol>
		<li>冷链运输：在低温条件下将组织样本运送至实验室。</li>
		<li>样本登记：样本到达实验室后，详细核对并登记样本信息，包括患者的基本个人信息、组织类型、名称及取样部位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验室接收与检查：
	<ol>
		<li>样本检查：在生物安全柜中打开样本，检查是否存在丢失、污染或肉眼可见的异常情况。</li>
		<li>样本解剖：取出样本并置于培养皿中。使用组织剪或手术刀将样本切成小块（约1-3 mm³），用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>原代组织细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>保存：将收集的组织块放入50 mL无菌锥形离心管中，确保按组织类型分类。对每根试管进行适当标记。向每根试管中加入保存液（adDMEM/F-12培养基 + ROCK抑制剂溶液（1:2000稀释）），直至完全浸没组织。将样本在4 °C下保存，直至进一步处理。 
		注意：组织类型应包括肿瘤组织和非肿瘤组织。样本标签通常应包含病历号。</li>
		<li>组织分离：使用无菌镊子将前列腺癌组织样本转移至中等大小的培养皿中。用2 mL杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）清洗组织2–3次，以去除血液和碎片。使用尖头镊子仔细去除脂肪组织、肌肉及其他非上皮成分，仅保留上皮区域。随后用剪刀将清洗后的组织剪切成约1–3 mm³大小的小片段。 
		注意：完全去除非上皮成分对于后续实验至关重要，因为污染的间质或脂肪组织可能降低细胞分离的效率和特异性。整个操作过程中应保持无菌条件，以最大限度减少微生物污染的风险。</li>
		<li>组织消化：将准备好的组织块转移至组织处理管中。向每根管中加入肿瘤组织消化液 (表2) 。启动消化设备（单细胞悬液制备仪），选择中等硬度组织解离程序，进行酶-机械解离。 
		注意：消化程序如下：正向旋转200 rpm持续3秒，反向旋转200 rpm持续3秒，正向旋转300 rpm持续4秒，反向旋转300 rpm持续4秒，正向旋转600 rpm持续5秒，反向旋转600 rpm持续5秒，正向旋转400 rpm持续3秒，反向旋转400 rpm持续3秒。此序列构成一个循环，共重复三次。完成前两个循环后，继续以20 rpm低速旋转约25分钟。时间可根据实验条件适当调整。在37 °C下消化40分钟至1小时。</li>
		<li>终止消化：向细胞悬液中加入等体积或两倍体积的含FBS的adDMEM/F-12培养基，以终止酶活性。 
		注意：若仍有未消化残留物，收集上清液后，向残留物中加入新鲜消化酶，并在37 °C下继续消化15–20分钟。定期监测消化过程，并合并两次消化所得的细胞悬液。</li>
		<li>过滤：用1 mL adDMEM/F-12培养基预润湿100 µm细胞筛网，然后过滤细胞悬液。用5 mL含ROCK抑制剂溶液（1:2000稀释）的adDMEM/F-12培养基冲洗组织处理管和细胞筛网两次。将滤液收集至50 mL无菌锥形离心管中。再将悬液通过70 µm筛网过滤，将全部细胞悬液收集至新的50 mL离心管中。 
		注意：可根据样本特性调整过滤步骤次数及筛网孔径。</li>
		<li>红细胞裂解：将收集的细胞悬液在25 °C下以200 ×g离心5分钟。小心弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于2 mL红细胞裂解缓冲液中。将悬液置于冰上孵育2–3分钟。 
		注意：红细胞裂解的孵育时间可根据裂解效率进行调整。孵育时间过长可能导致细胞死亡增加。建议在显微镜下观察样本，确保红细胞完全裂解的同时避免其他细胞类型受到过度损伤。</li>
		<li>终止裂解：向细胞悬液中加入6 mL含ROCK抑制剂溶液（1:2000稀释）的adDMEM/F-12培养基。将混合液转移至15 mL无菌锥形离心管中，在25 °C下以200 ×g离心5分钟。弃去上清液。用相同补充培养基洗涤细胞沉淀1–2次，并将最终细胞悬液转移至1.5 mL Eppendorf管中。</li>
		<li>活力评估：取10 µL细胞悬液与等体积台盼蓝溶液混合，在显微镜下观察细胞活力。 
		注意：若观察到大量死细胞或碎片，可在25 °C下以50 ×g低速离心5分钟去除，再进行细胞计数。</li>
		<li>细胞计数：将细胞沉淀重悬于1 mL adDMEM/F-12培养基中，根据需要稀释（通常为1:20稀释），取6 µL稀释后的悬液滴加至血细胞计数板，在显微镜下进行细胞计数。</li>
		<li>细胞沉淀收集：在25 °C下以200 ×g离心5分钟。将最终的细胞沉淀收集至1.5 mL Eppendorf管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从原代细胞悬液建立类器官
<ol>
	<li>接种：根据细胞数量确定所需基质胶的体积。使用预冷的移液枪头（存放于 -20 °C），将适量的基质胶小心加入细胞沉淀中。在冰上轻柔混匀细胞与基质胶的混合物，避免产生气泡，以确保细胞均匀分散并维持基质胶的最佳完整性。 
	注意：使用前需在 4 °C 条件下过夜解冻基质胶。确保所有操作工具（包括移液枪头和离心管）均已预冷，以防止基质胶提前凝固。</li>
	<li>铺板：将细胞-基质胶混合物滴加至低吸附性的 24 孔培养板中，每滴约 30 µL。确保每滴含有超过 10,000 个细胞，以支持有效的三维（3D）结构形成。 
	注意：避免过度稀释基质胶。为维持其结构完整性并支持三维培养的形成，基质胶应占混合物体积的 70% 以上。来源于人类活检组织和前列腺切除标本的类器官在本质上是相似的，主要差异在于可存活细胞的得率，本方案中采用相同的接种密度。</li>
	<li>孵育：将培养板置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育 5 分钟，使基质胶初步固化。将培养板翻转后静置 20 分钟，以保持基质胶的三维形态。随后向每孔加入 800–1000 µL 培养基（表 3）。每 2–3 天更换一次培养基。 
	注意：在翻转步骤中应确保不扰动基质胶，以维持其三维结构。</li>
</ol>
4. 类器官传代
<ol>
	<li>类器官的收集与制备：使用预冷的移液枪头，通过机械方式破坏基质胶，使类器官簇断裂成碎片。用 adDMEM/F-12 培养基加 ROCK 抑制剂溶液（1:2000 稀释）冲洗每个孔 1–2 次。将破碎后的类器官簇连同培养基转移至 15 mL 无菌锥形离心管中。在 25 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。 
	注意：当类器官直径达到 100 µm 时（通常在培养第 14 天）。如果培养基体积过多影响机械破碎，可在打散类器官簇前先吸除部分培养基。对于黏附在培养板表面的残留基质胶，可用移液枪头轻轻刮取，并用 adDMEM/F-12 培养基加 ROCK 抑制剂溶液（1:2000 稀释）冲洗 2–3 次。所有冲洗液应与初始收集液合并，以获得最大回收率。</li>
	<li>类器官解离：将所得沉淀重悬于 2 mL 预热的重组类胰蛋白酶溶液中。上下吹打以启动解离过程，随后在 37 °C 下孵育 15–30 分钟。每 5 分钟在显微镜下观察一次解离情况，直至视野中主要为小细胞簇（每个簇约含 5–6 个细胞），然后进入下一步。 
	注意：及时终止消化至关重要，以避免过度解离并保持细胞活力。频繁的显微镜观察可确保在细胞簇形成的最佳时机停止消化。</li>
	<li>终止消化：加入等体积或两倍体积的含胎牛血清（FBS）的 adDMEM/F-12 培养基以终止消化，中和酶活性。在 25 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>去除基质胶：将沉淀重悬于 2 mL 细胞回收溶液中，在 4 °C 下孵育 20–40 分钟，以溶解残留的基质胶。在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并用 adDMEM/F-12 培养基重复洗涤两次，以彻底清除残留的基质成分。将最终沉淀转移至 1.5 mL 无菌 Eppendorf 管中，用于后续操作。 
	注意：低温孵育对于有效解聚基质胶同时保持细胞完整性至关重要。应尽量减少样品在低温环境外的暴露时间，以防基质胶提前重新凝胶化。</li>
	<li>接种与培养：按照步骤 3.1–3.3 所述方法，对接解离后的类器官簇进行重新接种。确保合适的细胞密度与基质胶比例，以促进三维结构的有效重建。 
	注意：类器官的冷冻保存、复苏、重新包埋及组织学处理的详细方案可根据要求提供。</li>
</ol>
5. 类器官冷冻保存
<ol>
	<li>类器官收集：从培养箱中取出培养板，使用预冷的移液枪头将类器官水凝胶聚集体进行机械性解离。将解离后的聚集体连同培养基转移至15 mL锥形离心管中。用adDMEM/F-12培养基冲洗孔板2-3次，并将洗涤液合并至初始悬液中。在25 °C下以200 × g离心5分钟，弃去上清液。 
	注意：为确保最大回收率，应轻柔地破坏类器官聚集体，避免造成过度损伤。所有洗涤液均需与初始收集液合并，以减少类器官在收集过程中的损失。</li>
	<li>酶解消化：向锥形管中的类器官沉淀加入2-4 mL预热的重组类胰蛋白酶溶液，并轻轻混匀悬液。将悬液在37 °C孵育15-20分钟。每5分钟在显微镜下观察一次消化进程。 
	注意：如有必要，可轻柔吹打以帮助将较大的细胞团块分散为较小的聚集体（每个聚集体约含5-6个细胞）。若用于冷冻保存，消化时间应较短，以防止过度解离及细胞活力下降。频繁观察可确保在适当阶段终止消化，以维持类器官的完整性。</li>
	<li>终止消化：加入等量或过量的含FBS的adDMEM/F-12培养基以终止酶活性。在4 °C下以200 × g离心5分钟，弃去上清液。 
	注意：若沉淀中无残留基质凝胶，则进入步骤5.5进行冷冻保存。若仍存在基质凝胶污染，则继续进行步骤5.4。</li>
	<li>基质凝胶去除（可选）：按照步骤4.4所述方法去除基质凝胶。将沉淀重悬于2 mL细胞回收溶液中，在4 °C孵育20-40分钟。在4 °C下以200 × g离心5分钟，弃去上清液，并重复洗涤1-2次，以确保完全去除基质凝胶。 
	注意：彻底去除残留基质凝胶对于确保仅保存解离细胞至关重要。若凝胶去除不完全，可能影响类器官解冻后的细胞活力和结构完整性。</li>
	<li>冷冻保存：用移液枪轻柔吹打，将细胞沉淀重悬于1.5 mL类器官冻存液中，确保细胞均匀悬浮。将悬液转移至冻存管中，先置于-80 °C进行短期保存。24小时后，将冻存管转移至液氮中进行长期储存。 
	注意：应确保冻存液与细胞充分混匀，防止冻结不均导致细胞损伤。短期保存后应尽快将冻存管转移至液氮中，以确保长期保存效果并防止细胞退化。</li>
</ol>
6. 类器官回收
<ol>
	<li>解冻冻存的类器官：从液氮或 -80 °C 保存环境中取出含有类器官的冻存管。立即将冻存管浸入 37 °C 水浴中，并轻轻振荡直至内容物完全解冻。一旦解冻完成，立即使用预冷（-20 °C）的移液枪头将类器官悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。 
	注意：快速且均匀的解冻对于最大限度减少冷冻引起的细胞损伤至关重要。使用预冷的移液枪头可防止在转移过程中发生过早升温及基质胶重新凝固。</li>
	<li>去除冷冻保护剂：沿离心管管壁缓慢加入 1–2 mL adDMEM/F-12 培养基，以逐步稀释冷冻保护剂。通过轻柔翻转混匀。在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，并弃去上清液。 
	注意：此步骤应避免剧烈吹打或涡旋震荡，因为突然的渗透压变化和机械应力可能影响类器官的存活率。采用缓慢稀释方式可最大程度减少细胞受到的冲击。</li>
	<li>洗涤与重悬：向沉淀物中加入 1 mL 新鲜 adDMEM/F-12 培养基。使用预冷（-20 °C）的移液枪头轻柔重悬细胞，以防止基质胶过早黏附。将悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。 
	注意：洗涤过程中保持低温至关重要，可防止基质胶组分因温度升高而重新组装，从而避免影响后续类器官的再形成。</li>
	<li>收集：在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，并弃去上清液。重复洗涤步骤 2–3 次，以确保彻底清除残留的冷冻保护剂和污染物。</li>
	<li>接种与培养：将最终的细胞沉淀重悬于根据实验需求配制的类器官培养基中。按照步骤 3.1–3.3 所述方案进行接种，确保基质胶比例和细胞密度适当，以支持三维结构的重新建立。 
	注意：解冻后细胞的存活率和恢复情况高度依赖于轻柔的操作、冷冻保护剂的正确稀释，以及及时重建支持性的三维基质胶环境。</li>
</ol>
7. 类器官表征的分析前处理
<ol>
	<li>类器官收获：当类器官直径达到70–100 µm时，将其进行机械性解离，并转移至含有培养基的15 mL锥形管中用于后续培养。用adDMEM/F-12培养基冲洗孔板2–3次，并将洗涤液与类器官悬液合并。在200 × g 在25 °C下孵育5分钟，弃去上清液。 
	注意：对于小规模收集（例如1-2孔），请使用1.5 mL微量离心管，以确保操作高效并减少样品损失。在解离过程中需小心，避免破坏类器官结构。</li>
	<li>重悬：将沉淀物重悬于1 mL adDMEM/F-12培养基中，转移至1.5 mL微量离心管中。以200 × g 25°C 下孵育 5 分钟，弃去上清液。 
	注意：离心前务必充分重悬沉淀，以防止结块，并促进后续步骤的均匀处理。</li>
	<li>洗涤与固定：向沉淀中加入1 mL D-PBS，通过移液或倒置轻轻混匀。在200 × g 在25 °C下孵育5分钟，弃去上清液，重复洗涤步骤1-2次。用1-2 mL 4%多聚甲醛（PFA）重悬沉淀，4 °C下孵育过夜。 
	注意：仔细执行洗涤步骤，以确保彻底去除残留培养基及其他污染物。使用多聚甲醛进行固定对于保持类器官形态以供后续分析至关重要。</li>
	<li>固定后洗涤：将样品在 200 × g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。用D-PBS洗涤固定后的样品2至3次，通过轻弹管壁或轻轻倒置混匀，以确保洗涤缓冲液充分分布并防止类器官丢失。 
	注意：适当的固定后清洗对于去除过量的多聚甲醛以及降低后续实验（如免疫组织化学）中的背景染色至关重要。</li>
	<li>乙醇重固定：将沉淀物重悬于1 mL 70%乙醇中，轻轻弹击管壁混匀，室温孵育20 min。在200 × g 4 °C下离心5分钟，弃上清液。 
	注意：此阶段使用乙醇固定有助于保持类器官完整性，并为后续包埋或进一步处理做好准备。确保类器官在乙醇中均匀悬浮，以避免固定不均。</li>
	<li>基质凝胶清除 （可选）：如果沉淀中仍有残留的基质凝胶，请按照步骤4.4所述方案去除。该步骤包括将沉淀重悬于细胞回收溶液中，在4 °C孵育20–40分钟，随后进行离心和多次洗涤，以确保完全去除凝胶。 
	注意：去除基质凝胶对于后续的组织学分析或成像尤为重要，因为残留的凝胶可能干扰组织切片及分析。</li>
	<li>琼脂糖包埋：在类器官进行乙醇固定期间，准备约6 mL的2%琼脂糖溶液，于96 °C加热熔化。将100 µL熔化的琼脂糖与类器官沉淀混合，确保尽量减少气泡产生。将混合物转移至模具中，在4 °C下凝固，随后进行石蜡包埋处理。 
	注意：预先加热移液器吸头（末端已修剪）以防止堵塞。琼脂糖包埋有助于保持类器官结构的完整性，同时便于操作和切片。混合过程中避免产生气泡，以确保包埋均匀并获得理想的组织切片。</li>
</ol>

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<li>Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+development+and+applications+in+gynecological+cancers%3A+the+new+stage+of+tumor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment.</a> J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).</li>
<li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+the+application+of+organoid-based+drug+sensitivity+testing+in+cancer+precision+medicine+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development.</a> Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).</li>
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<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+bladder+cancer+organoids+as+a+valuable+tool+for+understanding+tumor+biology+and+developing+personalized+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment.</a> Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

建立前列腺癌（PCa）类器官是临床前模型研究中的一项关键进展，相较于传统的二维细胞培养和PDX模型具有显著优势16。本研究提出的方法能够生成在组织学、遗传学和表型特征上高度模拟原始肿瘤的类器官。通过保留肿瘤异质性，包括雄激素受体（AR）信号通路和细胞结构，这些类器官为研究前列腺癌的进展、治疗耐药性以及个体化治疗反应提供了更具生物学相关性的平台17。该方法可从局限性和晚期前列腺癌样本中均成功培养类器官，确保其适用于不同疾病阶段，填补了当前前列腺癌研究中的一项未满足需求18。
该方案的一个关键优势在于其可重复性和可扩展性，有助于开展基因组分析、高通量药物筛选和功能研究等下游应用。与PDX模型相比，前列腺癌类器官更具成本效益，所需资源更少，且可在更短的时间内完成培养。此外，本方案包含了优化的冷冻保存和复苏步骤，能够在维持基因组和表型完整性的同时，确保类器官的长期存活能力。这一特性支持类器官生物样本库的建立，可为协作研究、回顾性分析以及群体水平的研...

前列腺癌（PCa）仍是全球男性中最常见的恶性肿瘤之一，其癌症相关死亡率仅次于肺癌。根据近期的流行病学研究，全球前列腺癌的发病率持续上升，预计每年新增病例数将从2020年的140万例增至2040年的290万例1。尽管在早期检测以及新型疗法（包括雄激素剥夺治疗（ADT）和靶向药物）的开发方面取得了进展，但由于前列腺癌具有高度异质性，且在疾病进展过程中不可避免地产生治疗耐药性，尤其是在晚期阶段，该病仍构成重大的临床挑战2。在ADT治疗失败后出现的去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是该疾病的一种致死性形式，其特征是生存预后差且治疗选择有限3。因此，阐明驱动疾病进展和耐药的分子机制，对于发现新的治疗靶点并改善患者预后至关重要。
开发能够准确模拟人类前列腺癌复杂性的临床前模型，对于推动该领域的研究至关重要。尽管传统的二维细胞培养技术被广泛使用，但其无法重现体内所观察到的细胞异质性、肿瘤结构以及微环境in vivo4。因此，这些模型的转化应用价值有限，尤其是在研究肿瘤进展、药物耐药性以及癌细胞与肿瘤微环境之间动态相互作用方面5。相比之下，患者来源的异种移植模型（PDX）和类器官培养技术已成为更为先进的工具，能够在传统细胞系与临床肿瘤之间架起桥梁4,5,6。
类器官培养系统彻底改变了癌症建模研究。这些三维（3D）结构来源于患者组织，能够保留原始肿瘤的组织学、基因组和表型特征7,8,9,10&#160;。重要的是，前列腺癌类器官保留了疾病异质性的关键特征，包括雄激素受体（AR）信号通路、治疗耐药性以及基因组不稳定性，使其成为转化研究的理想工具11。与PDX模型相比，类器官更具成本效益，易于扩增，并且更适用于遗传操作，有利于开展高通量药物筛选、生物标志物发现和功能研究。类器官平台在其他恶性肿瘤（包括结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌）中已显示出良好的应用前景，凸显了其在个体化肿瘤学中的巨大潜力4,12。
然而，前列腺癌类器官（PCOs）的建立与维持面临独特的技术挑战。前列腺上皮本质上依赖于雄激素信号传导和细胞外基质（ECM）支持，因此需要特殊的培养条件。此外，前列腺癌在临床上表现出广泛的行为差异，从局限性的激素敏感性肿瘤到高度侵袭性、治疗抵抗性的去势抵抗性前列腺癌（CRPC），这进一步增加了可重复类器官系统开发的复杂性11,12。成功的PCO培养方案必须通过优化关键步骤来应对这些生物学复杂性，包括组织处理、酶消化、ECM包埋，以及添加关键生长因子、激素和小分子。此类方案对于确保类器官与其来源肿瘤的一致性，并推动其在后续分析中的应用至关重要。
本研究中，我们提供了一套详细且可重复的类器官建立与长期维持方案。我们的工作流程涵盖了从活检和手术标本的组织获取与处理，到类器官传代、冷冻保存及复苏的全过程（图1）。该方案经过优化，可有效保持前列腺癌组织的表型和基因组完整性，从而建立适用于多种应用的稳定三维培养系统，包括基因组分析、药物反应测试和功能实验。值得注意的是，本方法解决了类器官培养中常见的技术难题，如培养成功率低、生长状态不佳以及后续传代困难等问题，并提供了标准化操作指南，有助于在不同实验室之间实现结果的可重复性。
建立可靠的前列腺癌类器官模型对于基础研究和转化研究均具有重要意义13。这些系统为解析疾病机制、发现新的治疗靶点以及推进针对个体患者的精准医学策略提供了强大的平台。通过弥补现有技术空白并提供一套全面的实验方案，我们的工作旨在加速类器官技术在前列腺癌研究中的应用，并支持全球范围内抗击这一难治性疾病的努力14。

<table><tbody><tr><td>A 83-01</td><td>TOCRIS</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>adMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>济南新北西生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞回收溶液</td><td>康宁</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>深圳瑞沃德生命科技有限公司</td><td>M1416R</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>南京易瑞生物技术有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cultrex PathClear BM</td><td>R&amp;研发</td><td>3533-010-02</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 减少生长因子基底膜提取物，2 型</td><td>R&amp;研发</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>培养容器（24孔低吸附板）</td><td>thermo</td><td>Nunc-174930-ZX</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>ISOREAG</td><td>521-18-6</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>南京维立志博生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺Plus-200mM</td><td>R&amp;研发</td><td>B90210</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>R&amp;研发</td><td>1254/10</td><td></td></tr><tr><td>湿润的细胞培养箱（37&amp;deg;C，5% CO2）</td><td>上海和田科学仪器有限公司</td><td>HY-160SY</td><td></td></tr><tr><td>冰盒</td><td>南京诺唯赞生物科技股份有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中等大小的培养皿</td><td>苦艾素</td><td>abs7005</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX 培养基添加剂（50X）</td><td>R&amp;研发</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>R&amp;研发</td><td>3533-010-02</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid 移液器辅助装置</td><td>南京霍普特科学仪器有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>南京霍普特科学仪器有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>rhEGF</td><td>R&amp;研发</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF</td><td>R&amp;研发</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF-10</td><td>R&amp;研发</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>rhNoggin</td><td>R&amp;研发</td><td>6057-NG-100</td><td></td></tr><tr><td>rhR-Spondin 1</td><td>R&amp;研发</td><td>4656-RS-100</td><td></td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>TOCRIS</td><td>1264</td><td></td></tr><tr><td>单细胞悬液制备装置</td><td>真实世界数据</td><td>DSC-400</td><td></td></tr><tr><td>组织剪/手术刀</td><td>南京易瑞生物技术有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TryplE Express</td><td>Gibco</td><td>126A04013</td><td></td></tr><tr><td>人类肿瘤解离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>南京宜研生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>常州中捷实验仪器制造有限公司</td><td>HH-600</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>R&amp;研发</td><td>1254/10</td><td></td></tr></tbody></table>

建立和维持患者来源的前列腺癌类器官：一份详细的实验方案

Establishment and Maintenance of Patient-derived Prostate Cancer Organoids: A Detailed Experimental Protocol

前列腺癌（PCa）是一种高度异质性的恶性肿瘤，也是男性癌症相关死亡的主要原因之一，在治疗耐药性和疾病进展方面存在显著的临床挑战。现有的临床前模型，如二维（2D）细胞系和患者来源的异种移植瘤（PDXs），在真实再现前列腺癌复杂性方面存在局限性，包括肿瘤异质性、雄激素受体（AR）依赖性信号通路以及微环境相互作用。为弥补这一不足，本研究提出了一种稳健且可重复的患者来源类器官（PDOs）建立方案，能够保留亲本肿瘤的遗传、表型和组织学特征。该方法可用于培养来自局限性和晚期前列腺癌的类器官，为研究疾病机制、药物反应及生物标志物发现提供了具有生物学相关性的模型。结果表明，该方案能够从多种临床样本中成功生成类器官，并可应用于高通量药物筛选和精准医学。通过提供一种标准化的操作流程以解决关键技术难题，本研究强调了PDOs作为推动前列腺癌研究和开发更有效治疗策略的多功能工具的重要性。

患者来源的前列腺癌类器官的形态学与动态生长特征 
患者来源的前列腺癌类器官已成功从临床操作中获取的新鲜肿瘤组织建立。通常在培养后5–7天内即可观察到类器官的初始形成（图2）。在明场显微镜下，类器官表现出明显的形态学特征，形成致密、边界清晰的球状结构或类似腺体的结构。来自腺癌样本的类器官呈现出更规则、类似上皮样的组织结构，而来自更具侵袭性或低分化的肿瘤样本的类器官则常形成不规则、松散聚集的细胞团。
值得注意的是，类器官保留了原始肿瘤的结构特征， closely mimicking 组织学切片中观察到的腺体结构。类器官在培养期间表现出稳定的扩增能力，其体积和细胞密度均显著增加，表明其在体外成功适应并持续增殖。in vitro。真正的类器官需要验证其结构完整性、功能能力和遗传稳定性，通常通过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）分析进行评估。相比之下，细胞聚集体缺乏空间有序结构和稳定的遗传传递。
为进一步...

前列腺癌的异质性和治疗耐药性仍是当前面临的挑战。本文介绍一种用于建立患者来源类器官（PDOs）的实验方案，该类器官可保留亲本肿瘤的关键特征。这一标准化模型有助于药物筛选及精准医学的发展。

前列腺癌（PCa）是一种高度异质性的恶性肿瘤，也是男性癌症相关死亡的主要原因之一，在临床诊疗中面临诸多重大挑战……

研究重点在于建立并维持源自患者的前列腺癌类器官，用于个体化治疗研究。技术进展包括优化类器官培养体系，以增强保真度维持及用于个体化前列腺癌治疗的药物筛选。开始时，将收集的组织块放入50毫升无菌锥形离心管中，并相应标记每根试管。向每支试管中加入保存液，直至组织完全浸没。使用灭菌镊子将前列腺癌组织样本转移至中等大小的培养皿中。用两毫升 DPBS 清洗组织两到三次，以去除血液和碎片。然后，使用尖头镊子小心去除脂肪组织、肌肉及其他非上皮成分，仅保留上皮区域。用剪刀将清洗后的组织剪切成大小约为1至3立方毫米的小片段。接着，将组织片段转移至组织处理管中，并向每根管中加入肿瘤组织消化液。启动消化仪，运行适用于中等硬度组织的酶解-机械解离程序。随后，向细胞悬液中加入等体积或两倍体积的含FBS的adDMEM和F12培养基，以终止酶消化反应。用1毫升adDMEM/F12培养基预润湿100微米细胞筛，然后将细胞悬液经此筛网过滤。然后，用 5 毫升添加了 ROCK 抑制剂溶液的 adDMEM/F12 培养基将组织处理管和细胞筛网冲洗两次。将滤液收集至一个 50 毫升无菌锥形离心管中。将收集的悬液通过 70 微米筛网过滤，并将全部滤过悬液转移至一个新的 50 毫升离心管中。随后，将收集的细胞悬液在25°C条件下以200 G离心5分钟。小心弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于2毫升红细胞裂解缓冲液中。然后将悬液置于冰上孵育2至3分钟。为了终止裂解，加入六毫升添加了ROCK抑制剂的adDMEM/F12培养基。将混合物转移至15毫升无菌锥形离心管中，在25摄氏度下以200 G离心五分钟。弃去上清液后，用相同的补充培养基洗涤细胞沉淀一到两次，并将最终悬浮液转移至1.5毫升Eppendorf管中。现在，将10微升细胞悬液与10微升台盼蓝溶液混合。用1毫升adDMEM/F12培养基重悬细胞沉淀。取6微升稀释后的悬液加入血细胞计数板，于显微镜下计数细胞。现在，将细胞悬液在25摄氏度下以200 G离心5分钟。将最终的细胞沉淀转移至1.5毫升Eppendorf管中。根据细胞计数确定所需基质胶的体积。使用预冷的移液器吸头，小心地将基质凝胶加入细胞沉淀中。在冰上轻柔混匀细胞与凝胶混合物，避免产生气泡并保持基质凝胶的完整性。随后，将约30微升的细胞-基质凝胶混合物逐滴接种至低黏附性的24孔培养板中，每孔一滴。将培养板置于含5%二氧化碳、37摄氏度的湿润培养箱中孵育5分钟，以使凝胶初步固化。将培养板倒置，静置20分钟，以维持凝胶的三维结构。向每孔中加入800至1,000微升培养基。使用预冷的移液器吸头，通过机械方式破坏每个孔中的基质胶，以使类器官簇破碎成片段。用添加了ROCK抑制剂溶液的adDMEM/F12培养基冲洗每个孔一至两次。将破碎后的类器官片段和培养基转移至15毫升无菌的锥形离心管中。在25°C下以200 ×g离心5分钟。弃去上清液后，将所得沉淀重悬于2 mL预热的重组类胰蛋白酶溶液中。反复吹打混合液以开始解离。然后，将试管在37摄氏度下孵育15至30分钟。接着，加入等体积或两倍体积的含FBS的adDMEM/F12培养基以终止酶促反应。在25摄氏度下，以200 ×g离心5分钟。然后，弃去上清液。开始去除基质凝胶时，将沉淀物重悬于两毫升细胞回收溶液中。将悬液在4°C下孵育20至40分钟，以溶解残留的基质凝胶。在4°C条件下，以200 G离心样品5分钟。弃去上清液后，使用adDMEM和F12培养基将沉淀洗涤两次，以去除任何残留的基质成分。最后，将沉淀转移至1.5毫升无菌Eppendorf管中，进行后续处理。按照重接种操作步骤接种解离后的类器官簇。在培养的第5至第7天可观察到类器官的初步形成，明场图像显示结构致密、边界清晰的球状体或类似腺体的结构。苏木精-伊红染色显示，来源于高分化腺癌的类器官保留了腺体结构特征，与相应患者的组织样本相似。免疫组织化学显示，来源于激素敏感性前列腺癌组织的类器官和原发肿瘤均表现出强烈的细胞核雄激素受体表达。CK5、PSMA 和 NKX3.1 在类器官和肿瘤样本中均强烈表达，支持其上皮来源及谱系保真性。KI-67 染色显示，类器官的增殖指数与原始肿瘤组织相当。我们已开发出一套稳定的方案，用于维持患者来源的前列腺癌类器官，从而实现个性化药物测试和生物标志物的发现。我们的研究结果为研究前列腺癌生物学提供了可靠的平台，有助于推动个性化治疗和精准医学的发展。未来的研究将探索前列腺癌类器官的异质性、肿瘤微环境相互作用以及耐药机制。

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癌症研究

患者来源的前列腺癌类器官的建立和维持：详细的实验方案

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