利用多点硫黄素T荧光检测突变型P53 V157F乳腺癌细胞中的聚集倾向行为

本研究探讨突变型p53 V157F在乳腺癌细胞中的聚集倾向，并评估多点平板读数法用于检测的可行性。目前的实验挑战包括准确检测p53聚集、定量类淀粉样结构，以及确保基于细胞的检测表面测量结果的一致性。首先，在微量离心管中加入10 µL台盼蓝。

向同一管中加入10 µL用DPBS重悬的细胞，并充分混匀以确保均匀。取10 µL制备好的混合液加入计数载玻片，使用自动细胞计数仪对活细胞进行计数。根据细胞活力计数结果，每孔接种30,000个活细胞至96孔培养板中。

将一个孔指定为未染色对照孔，其余三个孔用于染色。使用天平称取0.02克硫黄素T（Thioflavin T）或THT粉末。将粉末加入5毫升去离子水中，并充分混匀，直至粉末完全溶解。

然后将染色组分加入1毫升DPBS中。将THT和Hoechst的储备液加入离心管中，轻轻混匀以确保溶液均匀。现在从96孔细胞培养板的每个孔中移除培养基。

向每个染色孔中加入100 µL配制好的THT和Hoechst染色缓冲液，向未染色对照孔中加入100 µL DPBS。将培养板置于室温避光处孵育30分钟。小心吸出或弃去各孔中的染色液，注意不要破坏细胞单层。

然后向每个孔中加入 100 µL DPBS，静置 30 秒。随后弃去 DPBS。重复洗涤步骤后，向每个孔中加入 100 µL 新鲜 DPBS。

在读取荧光信号前，取下96孔培养板的盖子。将96孔培养板放入酶标仪中。使用450纳米激发波长和490纳米发射波长检测THT荧光，使用360纳米激发波长和460纳米发射波长检测Hoechst 33342荧光。

选择所需的读取区域，然后设置读取参数，包括在读取顶部折射前振荡五秒，以及140毫秒的积分时间。获取荧光数据后，进行计算以得到蛋白质聚集值。最后通过将MCF7细胞中的THT荧光强度比值设为1作为基线对照进行归一化处理。实验在MCF7和Hs578T细胞的染色与未染色孔中，分别采用单点法和四点法进行测量。

Hs578T 乳腺癌细胞与 MCF7 细胞相比，使用单点读数法时硫黄素 T 荧光强度增加了 3.2 倍。当使用四点平均读数法时，Hs578T 细胞的硫黄素 T 荧光强度比 MCF7 细胞增加了 3.86 倍。在四个测量位点，Hs578T 细胞的硫黄素 T 荧光信号均持续高于 MCF7 细胞。

本方案通过硫黄素T染色结合可靠的多点荧光板读数方法，可在细胞环境中实现准确的蛋白质聚集检测。