Name: 利用多点硫黄素T荧光检测突变P53 V157F乳腺癌细胞中的聚集倾向行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T14:57:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: 了解多点硫黄素T荧光检测技术，用于分析突变p53 V157F在乳腺癌细胞中的聚集倾向行为。该方法可提高蛋白质聚集体检测的准确性与可靠性，为癌症治疗策略研究提供重要依据。

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作者衷心感谢义守大学医学院基础医学核心实验室提供的技术协助。本研究得到了义大医院 [EDAHJ114001，授予 C.-C.C.] 和中国台湾国家科学与技术委员会 [NSTC 112-2813-C-214-032-B，授予 B.-H. C] 的资助。

1. 细胞接种
<ol>
	<li>为评估细胞活力，取10 µL台盼蓝与10 µL用1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）重悬的细胞混合于微量离心管中，充分混匀。</li>
	<li>取10 µL上述混合液加入计数载片，使用自动细胞计数仪计数活细胞。</li>
	<li>根据细胞活力计数结果，将30,000个活细胞接种至96孔培养板的每孔中，其中一孔设为未染色对照，其余三孔用于染色。</li>
</ol>
2. 孵育
<ol>
	<li>将培养皿放入 CO2 培养箱中，在 37 °C 条件下孵育 12 小时。</li>
</ol>
3. 新鲜硫黄素T染色原液（1,000倍）的配制
<ol>
	<li>称取 0.02 g（20 mg）ThT 粉末，溶于 5.0 mL 去离子水中，充分混匀直至粉末完全溶解。 
	注意：此配制方法可得到浓度为 4 mg/mL 的 1,000 倍 ThT 储存液，相当于 12.5 mM（ThT 的分子量约为 318.85 g/mol。4 mg/mL 的溶液等于 4 g/L，将 4 g/L 除以 318.85 g/mol 可得 0.0125 mol/L，即约 12.5 mM）。</li>
</ol>
4. 使用核复染剂制备硫黄素T染色缓冲液
<ol>
	<li>配制染色液：将以下试剂加入 1 mL 的 1x DPBS 中，轻轻混匀以确保溶液均匀。
	<ol>
		<li>加入 1 µL 新鲜配制的 1,000 倍 ThT 储存液，终浓度为 12.5 µM（1x）。</li>
		<li>加入 1 µL 浓度为 1 mg/mL 的 Hoechst 33342 储存液，终浓度约为 1 µg/mL（=1.6 µM）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 染色
<ol>
	<li>移除每个孔中的培养基。向每个染色孔中加入 100 µL 配制好的 ThT/Hoechst 染色缓冲液。向未染色对照孔中加入 100 µL 1× DPBS。</li>
</ol>
6. 孵育
<ol>
	<li>将培养皿置于室温（25 °C）避光处，静置 30 分钟。</li>
</ol>
7. 清洗
<ol>
	<li>小心吸出或弃去每孔中的染色液，注意不要扰动细胞单层。</li>
	<li>向每孔中加入 100 µL 的 1× DPBS，并可选择性地轻轻浸泡 30 秒。</li>
	<li>小心吸出或弃去 DPBS 洗涤液。</li>
	<li>通过向每孔中加入 100 µL 新鲜的 1× DPBS 重复洗涤一次，同样可选择性地轻轻浸泡 30 秒，然后弃去 DPBS 洗涤液。</li>
	<li>第二次洗涤后，向每孔中加入 100 µL 新鲜的 1× DPBS。</li>
</ol>
8. 荧光检测
<ol>
	<li>在读取荧光信号之前，取下96孔板的盖子。采用以下两种方法之一测量荧光：单点读数或四点读数。</li>
	<li>将96孔板放入微孔板读数仪中，并使用以下参数测量荧光：ThT荧光：激发波长450 nm，发射波长490 nm；Hoechst 33342荧光：激发波长360 nm，发射波长460 nm；读数仪设置：读取前震荡5秒；读数方式：顶部读数；积分时间：140 ms；读数高度：1.00 mm；每孔读数点数：1（终点法）或4（孔扫描）；孔扫描设置：（密度设置：2；点间距：2.5）。</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>按如下方法计算蛋白质聚集： 
	<img alt="聚集信号公式，ThT 和 Hoechst 吸光度，用于淀粉样蛋白聚集分析的方程。" src="/files/ftp_upload/68921/68921eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>通过将 MCF7 细胞中的 ThT 荧光强度比值设为 1（基线对照）进行归一化处理。</li>
</ol>

<ol><li>Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awakening+the+%26%2334%3Bguardian+of+genome%26%2334%3B%3A+Reactivation+of+mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Awakening the &#34;guardian of genome&#34;: Reactivation of mutant p53.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).</li>
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<li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+mutant+p53+promotes+cell+growth+and+cancer+cell+metabolism+via+inhibition+of+ampk+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation.</a> Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).</li>
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<li>Cai, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyllides+repress+gain-of-function+p53+mutated+hnscc+cell+proliferation+via+activation+of+p73+and+repression+of+p53+aggregation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).</li>
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<li>Ano Bom, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p53+aggregates+into+prion-like+amyloid+oligomers+and+fibrils%3A+Implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer.</a> J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).</li>
<li>Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+is+essential+for+restoring+cellular+functions+of+temperature-sensitive+p53+mutant+protein+but+not+for+stabilization+and+activation+of+wild-type+p53%3A+Implications+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy.</a> J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).</li>
<li>Arsic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%94133p53%CE%B2+isoform+pro-invasive+activity+is+regulated+through+an+aggregation-dependent+mechanism+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

将细胞接种到96孔板时，通常难以实现细胞在孔底表面的均匀分布，因为通过轻柔振荡或轻敲培养板以分散细胞的方法并不总是可行。这种分布不均会导致同一孔内不同区域的信号强度出现显著差异。多点荧光读数结果显示，同一孔内的不同区域之间存在明显的信号变异，凸显了这种偏差的存在，以及仅测量单一点位可能带来的误导性结果。因此，依赖单一中心读数点可能会低估信号的异质性，掩盖不同细胞系或处理条件之间ThT荧光的细微差异。此类偏差可能导致标准差（SD）估计值偏低，从而产生精确度较高的假象。为了获得更可靠且客观的数据，我们强烈建议在ThT荧光检测中采用多点读数方法。该方法通过对孔内多个位点的信号进行平均，更真实地反映数据的内在变异性，并提高检测蛋白质聚集程度微小变化的敏感性，包括药物处理所诱导的变化。在评估弱聚集倾向或评价抑制聚集化合物的效力时，多点分析尤其有用。
关于荧光归一化，我们目前采用的多点ThT荧光方法是基于点水平的测量值进行信号归一化，而非基于整个孔的总荧光强度。选择基于点的归一化方法是因为它能够减少由细胞贴壁不均、边缘效应以及局部聚集热点所引入的偏差，而这些因素在仅依赖孔平均值时可能被掩盖。然...

TP53 基因编码肿瘤抑制蛋白 p53，在约 50% 的人类癌症中该基因发生突变1,2。此类突变不仅会消除 p53 的肿瘤抑制功能，而且在某些热点突变体中，还会促进形成类朊病毒样聚集体3,4。这些突变型 p53 的聚集形式常获得功能增益特性，包括对抗癌治疗的耐药性增强5,6。因此，确定哪些 p53 热点突变易于发生聚集，对于指导 p53 突变型癌症的有效治疗策略开发至关重要7,8。
在我们之前的研究中，我们观察到头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和乳腺癌细胞系中特定的 p53 突变表现出强烈的硫黄素T（ThT）染色信号，表明存在聚集的蛋白质。ThT 是一种苯并噻唑染料，可特异性结合富含β-折叠的淀粉样结构，结合后荧光显著增强9。例如，携带 p53 R175H 突变的 HNSCC 细胞系 Detroit 562 表现出强烈的 ThT 荧光信号10。类似地，另外两个 HNSCC 细胞系 TW01 和 HONE-1，均携带 p53 R280T 突变，也显示出明显的 ThT 染色11。在这些情况下，ThT 信号与 p53 共定位，支持存在聚集态 p53 的结论10,11。
在乳腺癌细胞中，MDA-MB-231（p53 R280K 突变）和 T47D（p53 L194F 突变）同样表现出强烈的硫黄素T（ThT）染色，并且p53与ThT存在明显的共定位12。相比之下，表达野生型p53的MCF7细胞以及MDA-MB-468细胞（p53 R273H突变）均仅显示出微弱的ThT信号12。类似地，携带p53 V173L突变的OECM-1头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞也表现出较低水平的ThT染色10。
与其他蛋白质聚集检测方法（如滤膜滞留实验、透射电子显微镜（TEM）或使用聚集物特异性抗体的免疫染色）相比，ThT荧光分析具有多项优势。该方法无损、快速，适用于活细胞和固定细胞，且无需复杂的前处理步骤。尽管滤膜滞留实验能够有效捕获不溶性聚集物，但其需要强烈的变性条件，因而不适用于活细胞检测。13透射电镜可直接观察纤维的形态，但操作繁琐且通量较低14. 特异性聚集物免疫染色可实现 原位 使用构象依赖性抗体进行检测，尽管抗体的可获得性和特异性可能受限15相比之下，硫磺素T（ThT）荧光检测——尤其是结合多点平板读数时——为检测富含β-折叠或类淀粉样结构提供了一种简单、定量且空间重复性良好的方法。
实际操作中的考虑因素对于可重复性也至关重要。ThT 荧光信号在较宽的浓度范围（0.2–500 µM）内与淀粉样蛋白浓度呈线性相关，通常在 20–50 µM 时达到峰值信号，具体数值取决于蛋白质种类；然而，当 ThT 浓度 ≥5 µM 时可能出现自身荧光，更高浓度还可能影响聚集动力学16。因此，通常建议采用约 10–20 µM 的工作浓度，以在保证检测灵敏度的同时尽量减少对聚集过程的潜在干扰16。在本实验方案中，1,000 倍浓缩的 ThT 储存液（12. mM）按 1:1,000 比例稀释，得到约 12. µM 的工作浓度，处于推荐范围内。
ThT 优先结合富含β-折叠的淀粉样结构，这种结构是淀粉样纤维的特征。这种特异性源于染料与淀粉样纤维的交叉β-折叠结构之间的相互作用，其中由β-链段形成的表面为 ThT 提供了结合位点。因此，ThT 可能无法有效检测其他不具有这种富含β-折叠结构的错误折叠蛋白聚集体或非淀粉样聚集体17。因此，尽管 ThT 是鉴定淀粉样纤维的一种有价值工具，但仍建议采用互补的验证方法——例如与 p53 免疫荧光共定位或生物物理方法——以确认所检测到的聚集体的身份和特异性10,18。
结构预测研究表明，p53 V157F突变体相较于野生型蛋白更倾向于形成易于聚集的构象19。在本研究中，我们比较了携带易聚集型p53 V157F突变的Hs578T乳腺癌细胞与表达野生型p53的MCF7乳腺癌细胞之间的硫黄素T（ThT）荧光信号。通过基于多点酶标仪的ThT染色检测方法，我们旨在评估p53 V157F相对于野生型p53的聚集倾向性。

<table><tbody><tr><td>96孔培养板</td><td>Simply</td><td>PC396-0100</td><td></td></tr><tr><td>计数载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Simply</td><td>CC704-0500</td><td></td></tr><tr><td>Ep管</td><td>Simply</td><td>PC101-5000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AAT Bioquest</td><td>17530</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Molecular Devices</td><td>735-0391&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>硫黄素T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

利用多点硫黄素t荧光检测突变型p53 v157f乳腺癌细胞中的聚集倾向行为

Detection of Aggregation-Prone Behavior in Mutant P53 V157F Breast Cancer Cells Using Multipoint Thioflavin T Fluorescence

由TP53基因编码的肿瘤抑制因子p53在维持基因组稳定性中发挥核心作用。TP53基因突变，特别是热点变异，在约50%的人类癌症中被发现，可能导致肿瘤抑制功能的丧失，或获得功能增益特性，包括聚集形成类朊病毒结构。
本研究评估了Hs578T乳腺癌细胞中p53 V157F突变相较于表达野生型p53的MCF7细胞的蛋白聚集倾向。采用硫磺素T（ThT）染色结合96孔板荧光定量法检测蛋白聚集情况。细胞经ThT/ Hoechst溶液染色后洗涤，并在特定激发/发射参数下使用酶标仪进行分析。通过单点和四点荧光读数的定量分析显示，Hs578T细胞的ThT荧光强度较MCF7细胞升高3.20至4.26倍，表明其富含β-折叠或类淀粉样蛋白聚集体水平显著增加。多点测量结果证实了蛋白聚集体在孔板表面广泛且一致地存在。这些结果支持采用多点读板法在基于细胞的实验中准确检测蛋白聚集现象。

为研究乳腺癌细胞中富含β折叠的蛋白质聚集体的存在情况，对MCF7和Hs578T细胞系进行了硫黄素T（ThT）染色，随后进行荧光定量分析。如图1所示，将细胞接种于96孔板的四个孔中，其中一个孔设为未染色对照。其余三个孔按照标准方案用ThT染色。荧光信号通过两种方法测定：（1）从每个孔的中心位置进行单点读数；（2）通过获取每个孔内四个不同位置的信号并取平均值进行四点读数，以校正空间差异性。定量分析显示，两种细胞系之间的ThT荧光存在显著差异（图2）。采用单点读数法时，Hs578T细胞的ThT荧光强度较MCF7细胞升高了3.20 ± 0.05倍（补充表S1）。在后续的四点读数中，从信号值中减去了未染色孔的平均背景荧光（补充表S2）。进一步分析Hs578T细胞中ThT荧光的空间分布，结果显示在全部四个测量点均呈现一致升高（图3）。具体而言，在第1、2、3和4点，Hs578T细胞的ThT荧光强度分别比M...

携带 p53 V157F 突变的 Hs578T 乳腺癌细胞表现出显著高于 MCF7 细胞的硫黄素 T 荧光，表明其蛋白质聚集程度更高。多点荧光测量可提高检测富含 β-折叠聚集体的准确性和可靠性，凸显了易聚集型 p53 突变在癌症研究及治疗策略开发中的重要性。

利用多点硫黄素T荧光检测突变型P53 V157F乳腺癌细胞中的聚集倾向行为

肿瘤抑制蛋白p53由TP53基因编码，在维持基因组稳定性中发挥核心作用。TP53基因突变，尤其是热点突变位点，……

本研究探讨突变型p53 V157F在乳腺癌细胞中的聚集倾向，并评估多点平板读数法用于检测的可行性。目前的实验挑战包括准确检测p53聚集、定量类淀粉样结构，以及确保基于细胞的检测表面测量结果的一致性。首先，在微量离心管中加入10 µL台盼蓝。向同一管中加入10 µL用DPBS重悬的细胞，并充分混匀以确保均匀。取10 µL制备好的混合液加入计数载玻片，使用自动细胞计数仪对活细胞进行计数。根据细胞活力计数结果，每孔接种30,000个活细胞至96孔培养板中。将一个孔指定为未染色对照孔，其余三个孔用于染色。使用天平称取0.02克硫黄素T（Thioflavin T）或THT粉末。将粉末加入5毫升去离子水中，并充分混匀，直至粉末完全溶解。然后将染色组分加入1毫升DPBS中。将THT和Hoechst的储备液加入离心管中，轻轻混匀以确保溶液均匀。现在从96孔细胞培养板的每个孔中移除培养基。向每个染色孔中加入100 µL配制好的THT和Hoechst染色缓冲液，向未染色对照孔中加入100 µL DPBS。将培养板置于室温避光处孵育30分钟。小心吸出或弃去各孔中的染色液，注意不要破坏细胞单层。然后向每个孔中加入 100 µL DPBS，静置 30 秒。随后弃去 DPBS。重复洗涤步骤后，向每个孔中加入 100 µL 新鲜 DPBS。在读取荧光信号前，取下96孔培养板的盖子。将96孔培养板放入酶标仪中。使用450纳米激发波长和490纳米发射波长检测THT荧光，使用360纳米激发波长和460纳米发射波长检测Hoechst 33342荧光。选择所需的读取区域，然后设置读取参数，包括在读取顶部折射前振荡五秒，以及140毫秒的积分时间。获取荧光数据后，进行计算以得到蛋白质聚集值。最后通过将MCF7细胞中的THT荧光强度比值设为1作为基线对照进行归一化处理。实验在MCF7和Hs578T细胞的染色与未染色孔中，分别采用单点法和四点法进行测量。Hs578T 乳腺癌细胞与 MCF7 细胞相比，使用单点读数法时硫黄素 T 荧光强度增加了 3.2 倍。当使用四点平均读数法时，Hs578T 细胞的硫黄素 T 荧光强度比 MCF7 细胞增加了 3.86 倍。在四个测量位点，Hs578T 细胞的硫黄素 T 荧光信号均持续高于 MCF7 细胞。本方案通过硫黄素T染色结合可靠的多点荧光板读数方法，可在细胞环境中实现准确的蛋白质聚集检测。

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在本视频中，我们展示了一种基于细胞的蛋白质聚集检测方法，该方法使用蛋白酶体抑制剂来阻断蛋白酶体活性，从而阻止与荧光标签融合的错误折叠突变蛋白发生泛素依赖性的蛋白酶体降解，导致这些蛋白在细胞质中积累。随后通过荧光显微镜对蛋白质聚集体进行可视化和定量分析。...

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间期荧光 原位 多发性骨髓瘤骨髓涂片杂交

了解多点硫黄素T荧光检测技术，用于分析突变p53 V157F在乳腺癌细胞中的聚集倾向行为。该方法可提高蛋白质聚集体检测的准确性与可靠性，为癌症治疗策略研究提供重要依据。

利用多点硫黄素T荧光检测突变型P53 V157F乳腺癌细胞中的聚集倾向行为

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