Name: 基于CRISPR-Cas9的诱突昆虫病原线虫 Steinernema hermaphroditum 的诱变及突变系的维护 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学习利用CRISPR-Cas9技术对昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum进行基因编辑和突变体构建的方法。该技术有助于研究线虫共生与寄生关系的遗传机制，为害虫生物防治提供新策略。

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我们感谢 Margaret McFall-Ngai 和 Edward Ruby 提供共聚焦显微镜的使用机会。感谢 Alexis (Cody) Hargadon 和 Grischa Chen 在共聚焦显微镜操作方面的培训，以及 Carly R. Myers 在图像获取和抽搐视频分析方面的帮助。我们还感谢 Stephanie Hampton 为购买显微注射系统的经费分配。本研究工作得到了卡内基科学研究所的支持。

所用试剂和设备列于材料表中。
1. 显微注射前的线虫准备
<ol>
	<li>制备接种细菌的线虫生长培养基（NGM）平板 Xenorhabdus griffiniae 和 Comamonas aquaticus. 
	注意：培养 S. hermaphroditum 线虫与其天然共生细菌 Xenorhabdus griffiniae 显微注射前培养线虫以促进其生长，并在细菌上回收注射后的线虫 Comamonas aquaticus 提高注射后的存活率14.
	<ol>
		<li>划线接种细菌 X. griffiniae 在LB-丙酮酸琼脂平板（2.5 g酵母提取物，5 g胰蛋白胨，2.5 g氯化钠，0.5 g丙酮酸钠，7.5 g琼脂溶于500 mL水中）上培养，并于30 °C过夜孵育。</li>
		<li>划线接种细菌 C. aquaticus 在LB琼脂平板上培养，并于37 °C过夜孵育。</li>
		<li>挑取单个细菌菌落&#160;接种于避光的LB液体培养基（每升水中含5 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨、5 g氯化钠）中，于有氧条件下培养细菌过夜（最长时间16小时）。 (X. griffiniae 在 30 °C 下 C. aquaticus 在 37 °C 下。</li>
		<li>制备NGM琼脂：将3 g NaCl、2.5 g蛋白胨和20 g琼脂加入975 mL水中，再加入1 mL胆固醇、1 mL 1 M CaCl₂、1 mL 1 M MgSO₄，定容至1 L。2，1 mL 1 M MgSO₄4，25 mL 1 M KPO4 高压灭菌后加入）每个60 mm × 15 mm培养皿加入10 mL。</li>
		<li>种子细菌：在每块NGM琼脂平板上加入几滴过夜培养的细菌菌液，轻轻晃动平板，使菌液均匀分散成菌斑。</li>
		<li>将接种细菌的NGM平板在室温下孵育，使琼脂干燥并促进细菌生长。 
		注意： X. griffiniae-接种后的培养板应尽快使用； C. aquaticus 平板可在室温下保存1至2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线虫发育阶段鉴定 
	&#8203;注意：在注射前一晚挑选雌雄同体的 J3 期幼虫，于注射当天选择年轻成虫。
	<ol>
		<li>挑选或分段 S. hermaphroditum 线虫转移到已接种的制备好的NGM平板上 X. griffiniae在25-28 °C温度下孵育，以获得最佳生长效果。</li>
		<li>显微注射前一晚，挑选处于J3期的雌雄同体线虫，转移到接种了大肠杆菌的NGM琼脂平板上 X. griffiniae 如图所示 图1A，通过线虫的大小以及生殖腺和阴门的形态来估计其J3阶段。</li>
		<li>显微注射当天，挑选年轻成虫期的雌雄同体线虫（图1B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 显微注射用CRISPR-Cas9的制备
<ol>
	<li>选择 CRISPR crRNA 及试剂储存
	<ol>
		<li>利用 BlastP（PRJNA982879）从参考基因组 Steinernema hermaphroditum 中提取目标基因序列。</li>
		<li>尽可能选择早期编码外显子序列，优先选择第一个外显子，并将序列输入 CRISPRScan，使用默认设置26生成可能的 CRISPR RNA（crRNA）列表。</li>
		<li>将排名靠前的 crRNA 与 S. hermaphroditum 基因组进行 Blast 比对，确保仅选择唯一性 crRNA。 
		注：可选步骤：在设计 crRNA 前，可通过 PCR 扩增和 Sanger 测序确认基因组目标区域的序列，以确保 crRNA 的高效结合。</li>
		<li>将 CRISPR RNA（crRNA）和通用反式激活 CRISPR RNA（tracrRNA）分别以 100 µM 浓度溶于双链缓冲液中，于 -80 °C 保存。</li>
		<li>Cas9 蛋白以 10 mg/mL 浓度在 -20 °C 或 -80 °C 保存。1 M KCl 于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于显微注射的 2% 琼脂糖垫（改编自 Berkowitz 等人27）
	<ol>
		<li>使用微波炉加热使 2% 琼脂糖在水中融化。</li>
		<li>将 50 µL 融化的琼脂糖转移至盖玻片（48 x 60 mm，1 号）上，立即用另一张盖玻片覆盖琼脂糖液滴。</li>
		<li>室温下静置干燥 20 分钟，随后移除上层盖玻片，并标记琼脂糖垫正面。 
		注：可选步骤：可将琼脂糖垫在 37 °C 下烘烤过夜，以进一步干燥。</li>
		<li>2% 琼脂糖垫可在室温下保存数月甚至数年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玻璃微针制备
	<ol>
		<li>使用激光毛细管拉制仪，按照以下参数制备石英玻璃微针。本研究所用拉针仪的推荐程序如下：加热温度：700，毛细管：4，速度：60，延迟：145，拉力：175。</li>
		<li>在注射前或提前拉制石英微针（外径：1.0 mm，内径：0.7 mm），并将其存放于移液器储存盒中。 
		注：也可使用硼硅酸盐玻璃微针（外径：1.2 mm，内径：0.68 mm）进行注射，效果良好。请注意，不同规格的微针需匹配相应尺寸的微针夹持器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 线虫的 CRISPR-Cas9 显微注射及注射后的恢复
<ol>
	<li>制备CRISPR-Cas9显微注射混合物（改编自Wang等）28)
	<ol>
		<li>通过将选定的crRNA与通用tracrRNA按1:1比例混合，制备新鲜的引导RNA双链体，即在PCR管中按总crRNA与tracrRNA的等量比例混合： 
		crRNA #1 (100 µM) - 1.5 µL 
		crRNA #2 (100 µM) - 1.5 µL 
		tracrRNA&#160; (100 µM) - 3.0 μL 
		注意：如果使用共CRISPR（co-CRISPR），crRNA #1 靶向的是 unc-22 标记基因，而crRNA #2可替换为靶向另一个目的基因的序列。</li>
		<li>将PCR管置于热循环仪中，94 °C孵育2分钟，然后冷却至室温。</li>
		<li>将以下成分混合以配制注射混合液，室温孵育5分钟： 
		Cas9（10 mg/mL）- 2 µL 
		1M KCl - 0.58 µL 
		gRNA 双链（来自步骤 3.1.1）— 2.7 µL</li>
		<li>轻弹PCR管三次混匀，随后在小型离心机中短暂离心（10–15秒）以收集管内液体。最后一次混匀后，延长离心时间，最长可达1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>装载并折断针头
	<ol>
		<li>使用微量加样头吸取1-2 µL注射混合液，加载至针头中。</li>
		<li>将针头安装到移液器（针头） holder 上，然后通过将针头在涂有卤代烃油的双面胶带上拖动以打开针尖。使用以下方法测试针头开口 清洁 显微注射仪的功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向年轻成年线虫的合胞体性生殖腺进行显微注射
	<ol>
		<li>将一小滴卤代烷油转移至2%琼脂糖垫上。</li>
		<li>在解剖立体显微镜下，使用一根细（柔软）的铂丝挑取一只年轻的成年雌雄同体线虫，并将其在M9缓冲液（每升含3 g KH₂PO₄、6 g Na₂HPO₄、5 g NaCl、1 mM MgSO₄）中清洗2PO4, 11.3 g Na2HPO4，5 g NaCl，加入1 ml 1 M MgSO₄4 添加至高压灭菌后）以去除细菌（参见年轻成虫线虫 图1).</li>
		<li>将洗涤后的线虫转移至琼脂糖垫上，并置于卤代烃油滴中。用柔软的铂金丝轻轻刷拭线虫，直至其被固定不动。</li>
		<li>将琼脂糖垫小心放置在显微注射台上。生殖腺合胞体的方向应朝向显微注射针，角度约为45°。先从5倍放大开始，然后切换至20倍和40倍放大进行注射。</li>
		<li>确保针头穿透合胞体，然后使用 清洁 功能的 显微注射仪 以约99 psi的压力注入混合液，直至观察到生殖腺中出现清晰的液体流动，以确保试剂能够进入生殖腺合胞体中的生殖细胞。</li>
		<li>如果第二条性腺臂可及，则移动载物台，使针头对准第二条性腺臂进行注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射后线虫回收
	<ol>
		<li>注射后立即在琼脂糖垫上用 1–2 µL M9 缓冲液重悬已注射的动物。</li>
		<li>使用一根细的铂金丝，将注射后的线虫从琼脂糖垫上挑起，并用M9缓冲液洗去油滴。</li>
		<li>在铺有细菌菌苔的 NGM 平板上回收线虫 C. aquatica 细菌（NGM 平板制备：见步骤 1.1），可提高线虫注射后的存活率1425 °C 下孵育过夜。</li>
		<li>第二天，将每只注射过的线虫（P0）分离至分别接种有大肠杆菌的NGM平板上 X. griffiniae让P0代动物过夜产生F1代子代（通过产卵或套袋法），用于表型分析和基因型鉴定（见步骤4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 筛选以确认CRISPR-Cas9介导的基因敲除
<ol>
	<li>基于尼古丁的（注意）筛选F1代个体的抽搐表型 unc-22 作为共CRISPR标记
	<ol>
		<li>将注射后的P0代动物产生的F1代子代转移至2%尼古丁溶液的液滴中。</li>
		<li>从尼古丁斑点中挑选一只单独抽搐的动物，并立即将其转移至接种有大肠杆菌的NGM琼脂平板上恢复 X. griffiniae将每只出现抽搐表型的F1代个体分离至单独的培养板中，使其繁殖产生用于基因分型的F2代后代（见步骤4.2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因分型
	<ol>
		<li>从每条F1抽搐系中选取八只F2或F3子代进行基因分型。这些个体很可能同时包含+/突变 杂合子和 mut/mut 纯合子动物。</li>
		<li>通过添加新鲜配制DNA提取缓冲液&#160;20 µL 蛋白酶K（10 mg/mL）加入180 µL 蠕虫裂解缓冲液（50 mM KCl，10 mM Tris pH 8.0，2.5 mM MgCl₂）20.45% NP-40，0.45% Tween 20，0.01% 明胶</li>
		<li>将线虫加入10 µL DNA提取缓冲液中&#160;在PCR管中，65 °C孵育10分钟，然后95 °C孵育15分钟以提取基因组DNA。</li>
		<li>使用步骤4.2.2中获得的1–2 µL裂解液，按照制造商说明书通过PCR扩增Cas9靶向区域，对线虫进行基因型鉴定。若可能，应确保Cas9切割位点与引物结合位点之间留有足够距离（至少300 bp），以防发生大片段缺失。 
		注意：在测序前可使用琼脂糖凝胶电泳来确认扩增是否成功。</li>
		<li>按照制造商的说明纯化PCR产物，以确保准确的Sanger测序迹线分析。</li>
		<li>使用Sanger测序法对步骤4.2.4中产生的PCR扩增产物进行测序，并利用ICE程序分析色谱图29.</li>
		<li>如果在步骤4.2.6中确认了突变等位基因，则返回原始的F1颤动平板，挑取至少八条雌雄同体线虫至各自的平板中。让每条线虫单独产生成年子代，随后对子代进行群体基因型鉴定以确认纯合性。纯合品系可按照步骤5所述方法在实验室中进行保种。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. CRISPR 品系的维持
注意：线虫保种主要有三种方法，包括基于海藻糖-DMSO 的冷冻保存法（步骤 5.1）、通过大蜡螟幼虫进行的 体内 传代法（步骤 5.2），以及在 NGM 平板上进行的 体外 培养维持法（步骤 5.3）。
<ol>
	<li>海藻糖-DMSO 冷冻保存野生型和突变品系 
	注意：采用海藻糖-DMSO 冷冻保存方法4, S. hermaphroditum 可在 -80 °C 长期稳定保存，并能在 NGM 培养基上恢复培养。线虫保存于 2 mL 冻存管中。使用聚苯乙烯泡沫盒进行逐步降温，可实现最佳冻存效果。
	<ol>
		<li>培养 S. hermaphroditum 在接种有 X. griffiniae （参见步骤1.1），直至群体中大部分为J1阶段或正在形成囊状的两性个体。 
		注意：避免使用感染期幼虫（IJ），因为它们采用此方法冷冻效果不佳。</li>
		<li>从NGM琼脂平板上用M9缓冲液冲洗线虫，并收集至15 mL圆锥形离心管中，液面高度不超过5 mL。通过离心浓缩样品&#160;(1372 x g 1-2分30秒即可。</li>
		<li>移除上清液，加入5 mL室温海藻糖-DMSO冻存缓冲液重悬，按照步骤5.1.2提供的参数进行离心洗涤一次。</li>
		<li>将线虫重悬于 5 mL 室温海藻糖-DMSO 冻存缓冲液中。将离心管侧放，在室温下孵育 30 分钟。此步骤可提高存活率。</li>
		<li>将1 mL分装至4个冻存管中，每管1 mL。</li>
		<li>将小瓶置于聚苯乙烯泡沫盒中，放入-80 °C超低温冰箱。</li>
		<li>一周后，取其中一个小瓶进行解冻测试。</li>
		<li>将剩余的小瓶转移至 -80°C 冻存盒中长期保存。</li>
		<li>检测解冻或复苏 S. hermaphroditum 来自冻存菌种
		<ol>
			<li>从冷冻箱中取出一个冻存管，在室温下放置直至完全解冻。</li>
			<li>将液体内容物倒入新的NGM平板上。注意，无需额外添加共生细菌，因为冻存菌株通常含有足够的共生细菌。线虫应在数分钟至数小时内开始恢复活动。</li>
			<li>观察线虫的运动和繁殖情况。一到两天后，将数条线虫转移至新接种大肠杆菌的NGM平板上 X. griffiniae</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体内 维持通过 Galleria mellonella 
	注意：对于 体内 生长，扩增 S. hermaphroditum 通过突变品系 Galleria mellonella （蜡虫）5th 龄幼虫&#160;该方法对于在冷冻保存后无法存活的品系尤为有用。有关通过昆虫及其他培养基进行昆虫病原线虫自然繁殖的详细且类似方案，可参见（McMullen 等）。30）。简而言之：
	<ol>
		<li>让线虫在NGM平板上饥饿并发育为感染性幼虫（IJs）。</li>
		<li>使用&#160;用M9缓冲液将IJs从NGM平板上洗脱。</li>
		<li>转移 IJs 进行感染 大蜡螟 使用白板诱捕器捕捉昆虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 体外 在NGM平板上进行培养时，遵循以下步骤：
	<ol>
		<li>在NGM平板上接种约100 µL新鲜液体培养物 S. hermaphroditum 共生体， X. griffiniae.</li>
		<li>待细菌菌落完全干燥后，再将线虫转移至培养皿上。</li>
		<li>将培养皿置于 25 °C 培养，每隔约一个月将线虫转移至新接种的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在利益冲突。

非常规的遗传模式动物系统为在这些性状自然发生的生态和生理背景下研究真核生物基因功能提供了宝贵的机会，例如在寄生宿主存在的情况下或生物体自身的原生微生物组环境中。在昆虫病原线虫（EPNs）中，基因操作主要依赖于某些基于RNA干扰（RNAi）的方法13,32。尽管RNAi可在某些物种中实现功能性的&#160;遗传学研究，但其应用受限于双链RNA（dsRNA）的瞬时性，且基因沉默可能无法稳定遗传。这些局限性凸显了对稳定、可跨代遗传的遗传工具的需求33,34。本研究描述了首个针对斯氏线虫科（Steinernematids）的精确基因组编辑方案，斯氏线虫科是小杆目（Rhabditida）中两个EPN科之一，相关方法已在Cao（2023）14中得到验证。

成功的CRISPR-Cas9诱变依赖于对线虫的...

昆虫病原线虫（EPNs）是一类能够杀死昆虫的寄生性线虫，其与细菌共生体形成物种特异性的互利共生关系1。EPNs 包含两个科：斯氏线虫科（Steinermatidae）和异小杆线虫科（Heterorhabditidae），分别与革兰氏阴性菌Photorhabdus 属和Xenorhabdus 属共生2,3。在斯氏线虫属（Steinernema）线虫的自由生活感染期幼虫阶段（IJ），Xenorhabdus 细菌被储存在线虫肠道内的一个称为“ receptacle”（ receptacle，贮菌器）的特化结构中；当线虫侵入昆虫血腔后，细菌被释放出来，随后大量增殖，并通过败血症杀死昆虫宿主3,4。在这种互利共生关系中，细菌产生抗菌和杀虫化合物，以抵御昆虫宿主的免疫反应，并为线虫提供营养支持5。作为回报，细菌则得益于线虫宿主提供的保护，避免受到环境中其他微生物的侵害，并借助线虫实现向新的昆虫猎物的传播6,7。
在过去的几十年中，Steinernema-Xenorhabdus 共生体系已被确立为研究寄生与互利互作多个方面的有力实验系统，例如昆虫宿主搜寻行为3、细菌在线虫宿主体内的定殖8，以及促进共生细菌在线虫与昆虫宿主动物之间转换的适应性行为9。EPNs 在土壤可持续性方面也具有重要意义，并被用作有机害虫防治剂以促进农业生产力10,11。
尽管共生细菌的遗传工具已迅速发展 Xenorhabdus 和 Photorhabdus12，EPN中一致的遗传工具一直较为稀缺。性腺显微注射已在两种 异小杆线虫属 和 斯氏线虫属 线虫13,14此前，性腺显微注射在 Heterorhabditis bacteriophora 已用于在子一代中持续递送双链RNA以实现基因敲低13,15最近，CRISPR-Cas9 基因组编辑在 斯氏线虫属 已开发并递送 通过 性腺显微注射，并产生了精确、稳定且可遗传的突变14.
一种斯氏线虫属（Steinernema spp.）物种——S. hermaphroditum，已被证明具有高度可操作性，是一种极具潜力的新兴遗传学模式生物4,14。该物种最初从印度尼西亚的土壤中分离获得16，后在&#160;印度被再次分离17。S. hermaphroditum 始终表现为雌雄同体，每代仅有少量雄性个体，这两个特征有利于借鉴经典模式线虫 C. elegans 的遗传学工具4。此外，S. hermaphroditum 的基因组已完成测序并组装至染色体水平，这简化了潜在 Cas9 靶位点的鉴定以及引物设计工作18。
在对EPN进行显微注射时，通过从石英毛细管拉制而成的针头，将含有适当试剂（如dsRNA、Cas9蛋白或向导RNA）的注射混合物注入同步体性线虫生殖腺。via该方法，适当的注射体积和压力可在生殖腺臂内产生可见的液体“流动”。由于这些线虫具有一对由共享同一细胞质的生殖系细胞核组成的合胞体生殖腺19，这种显微注射方法可在细胞质分裂发生前，使多个生殖细胞暴露于编辑作用之下，而细胞质分裂会将生殖系细胞核分隔形成发育中的卵母细胞20。尽管生殖腺显微注射作为一种稳定的技术已应用于多种非模式线虫物种的遗传调控14,21,22,23,24,25，但为了确保&#160;递送的成功率和高效率，必须根据每种线虫物种相应的生殖腺结构、生活阶段及生理状态调整注射技术。注射后的恢复技术以及突变品系的维持同样重要，以确保该技术具有成本效益。
本研究展示了一种CRISPR-Cas9基因组编辑方案 斯氏线虫属 Hermaphroditum 种性腺显微注射法在年轻成虫阶段进行，该阶段对高压显微注射具有较强耐受性，并易于接受基因编辑14此外，还提供了关于如何维持可遗传且稳定的突变品系的详细方法， 通过 通过昆虫进行冷冻保存与扩增.

<table><tbody><tr><td>琼脂糖（80-100 目）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26411</td><td>也用于LB丙酮酸平板</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td>也用于基因分型</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072532</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐针头</td><td>世界精密仪器公司</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl₂）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>433</td><td>5 mg/mL，溶于乙醇</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Comamonas aquatica &lt;/em&gt;(DA1877)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖垫用盖玻片</td><td>脑科学研究实验室</td><td>#4860-1D</td><td>48 × 60 mm，1号厚度</td></tr><tr><td>CRISPRScan</td><td></td><td></td><td>https://www.crisprscan.org/</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>0.5 M</td></tr><tr><td>DNA纯化与浓缩试剂盒-5&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4x 微注射仪，配备 Grip 头部组件，4 号尺寸 0 针 holder</td><td>Eppendorf/Calibre</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>甘蓝夜蛾第五龄幼虫</td><td>GrubCo</td><td></td><td>https://www.grubco.com/index.cfm</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Azure400</td><td>AZI400-01</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B72</td><td></td></tr><tr><td>明胶（2%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>#41003</td><td></td></tr><tr><td>基因分型引物：DNA寡核苷酸，25 nmol</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto 胰蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto 胰蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>也用于暗LB、LB丙酮酸盐平板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco Bacto 酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>也用于暗LB、LB丙酮酸盐平板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4号持针钳 Grip Head 套装</td><td>校准</td><td>EPE-5196083008</td><td>（与硼硅酸盐针头 1B120F-4 配对使用）</td></tr><tr><td>卤代烃油 700</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>用于日常维护的硬质铂金丝线虫挑取工具</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9901</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR编辑推断（ICE）</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td>用于分析Sanger测序结果以鉴定插入缺失突变的软件</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>激光拉针仪 P-2000</td><td>Sutter</td><td>P-2000G</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl2）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO4）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>用于M9缓冲液，也用于NGM</td></tr><tr><td>Microloader尖端 2x96ST</td><td>校准器</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 Axio Observer 和 Axiovert 200 显微镜用显微操作仪安装适配器</td><td>Tritech Research</td><td>NZ-19-2</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Tritech</td><td>SMT1</td><td></td></tr><tr><td>尼古丁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶双链缓冲液</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq MasterMix</td><td>NEB</td><td>M0486</td><td></td></tr><tr><td>移液器储存盒</td><td>Sutter Instruments</td><td>BX10</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（K2HPO4）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>KOH用于NGM</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH2PO4）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>用于M9缓冲液，也用于NGM</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>石英针</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. hermaphroditium&lt;/em&gt; 基因组</td><td>NCBI</td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/</td></tr><tr><td>sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>VWR</td><td>SS0430</td><td>也用于M9、暗LB、LB丙酮酸盐平板</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390</td><td>M9 缓冲液</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>也用于LB丙酮酸平板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>用于显微注射的软质铂金丝挑虫针</td><td>Surepure Chemetals</td><td>6824</td><td>铂90%，铱10%合金丝，直径0.002英寸，长5英尺</td></tr><tr><td>标准持针器</td><td>Tritech Research</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;斯氏线虫属 Hermaphroditum 种&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>Inveta 3</td><td></td></tr><tr><td>海藻糖</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-88195-99</td><td>0.08 M</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>垂直显微操作器安装适配器</td><td>Tritech Research</td><td>NR2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Xenorhabdus griffiniae&lt;/em&gt; (HGB2511)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于crispr-cas9的昆虫病原线虫steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

CRISPR-Cas9-based Mutagenesis in the Entomopathogenic Nematode Steinernema hermaphroditum and the Maintenance of Mutant Lines

斯氏线虫属（Steinernema）和异小杆线虫属（Heterorhabditis）的昆虫病原线虫分别与共生细菌致病杆菌属（Xenorhabdus）和发光杆菌属（Photorhabdus）维持互惠共生关系。这些线虫-细菌组合可侵染并杀死主要来自鳞翅目（Lepidoptera）和鞘翅目（Coleoptera）的昆虫幼虫，构成一个易于研究的三界互作体系，可用于解析互惠共生与寄生关系的分子基础。充分开发利用该模型的关键一步是在昆虫病原线虫中建立稳定且可跨代遗传的遗传&#160;工具。本文中，我们展示了在新兴模式生物——雌雄同体斯氏线虫（Steinernema hermaphroditum）中建立的一种可靠的CRISPR–Cas9基因组编辑平台。该物种易于在体内（in vivo）和体外（in vitro）培养，并且对性腺显微注射具有高度可操作性。尤为重要的是，其雌雄同体的繁殖方式极大地简化了纯合突变系的建立与维持。我们提供了一套详细的实验方案，通过显微注射递送Cas9核糖核蛋白复合物，实现高效、靶向的基因敲除。作为概念验证，我们对保守的肌肉相关基因unc-22进行了修饰，获得了特征性的抽搐表型，证实了该系统中靶向诱变的有效性。该CRISPR–Cas9平台为在S. hermaphroditum中开展稳定的遗传操作（例如外源基因表达）打开了大门，并为拓展至其他具有农业与生态重要性的昆虫病原线虫物种提供了可借鉴的技术框架。

设计了两种CRISPR RNA（以Pam位点编号命名——Pam 3和Pam 5），靶向S. hermaphroditum中unc-22的同源基因，其Pam位点信息来自已发表的研究14（图2A）。每种crRNA与tracrRNA结合形成单导向RNA（sgRNA），并按步骤3.1所述整合入Cas9蛋白，形成核糖核蛋白复合物。本方案中设计了两种靶向同一基因的crRNA；然而，若采用先前为C. elegans开发的共CRISPR（co-CRISPR）方法31，可将crRNA #2替换为针对目标基因的crRNA。或者，也可将unc-22 crRNA添加至两个靶向目标基因的crRNA中，但需确保总crRNA与tracrRNA的比例保持1:1。
显微注射前一天，挑选摄食良好、具有可见性腺臂的早期J3期线虫（图1A...

本文展示了在雌雄同体斯氏线虫（Steinernema hermaphroditum）中利用CRISPR-Cas9进行基因组编辑的技术，该线虫是一种昆虫病原性（EPN：寄生昆虫的）线虫，正逐渐成为一种新兴的遗传学研究模型。该技术可用于构建突变体，有助于阐明与线虫生物学中互利共生和寄生性共生相关的基因功能。

基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

斯氏线虫属（Steinernema）和异小杆线虫属（Heterorhabditis）中的昆虫病原线虫（EPNs）与发光杆菌属（Xenorhabdus）和类发光杆菌属（Photorhabdus）保持互惠共生关系……

我们正在研究线虫细菌共生的遗传学，这在农业领域具有应用价值。异栖菌的遗传工具非常成熟，但EPN遗传学仍然有限，主要依赖RNAi和EMS筛选。首先，获取带有Xenorhabdus griffiniae和Comamonas aquaticus的线虫琼脂平板。将Steinernema hermaphroditum线虫采摘到含有Xenorhabdus griffiniae的制备NGM板上。在25至28摄氏度下孵化以获得最佳生长。显微注射前一晚，将J3期雌雄同体采摘到新播种的Genorhabdus griffiniae的NGM琼脂平板上。在微注射当天，选择年轻雌雄同体进行注射。使用BlastP从Steinernema hermaphroditum参考基因组中提取目标基因序列。选择一个早期编码外显子，最好是第一个外显子，并以默认设置将序列输入CRISPRscan，生成候选CRISPR RNA。将顶尖候选CRISPR RNA与Steinernema hermaphroditum基因组对比，以确保没有非靶向匹配。将选定的CRISPR RNA和通用转激活CRISPR RNA分别储存在100微摩尔的双重缓冲液中，温度为零下80摄氏度。用微波炉把2%琼脂糖溶化在水中。将50微升融化琼脂糖转移到盖玻璃上。立刻用第二个盖子盖住。晾干20分钟后，取下顶盖玻璃，然后在琼脂棉的正面贴上标签。琼脂棉片应在室温下长期保存数月至数年。准备注射针头时，用激光丝拉拔器拉出石英毛细管，并将针头存放在移液器储存箱中。通过将选定的crRNA和通用转激活CRISPR RNA以一比一比例混合，制备新鲜的导引RNA双锁体。将管子在94摄氏度下孵育两分钟，然后冷却至室温进行退火双芯。通过结合Cas9、氯化钾和gRNA双股组组装注射混合物并培养。将PCR管拨动三次搅拌后，在小型离心机中短暂旋转10到15秒。最终混合后，旋转最多一分钟以收集内容物。接着，使用微装料头将1到2微升的注射混合物装入针头。把针套在支架上，用盐碳油下拖过双面胶带，把针尖打开。然后用微注射器的清洁功能测试开口大小。在2%琼脂糖垫上滴一小滴卤碳油。用解剖显微镜和一根软铂丝，取出一只年轻的雌雄同体。用M9缓冲液清洗以去除细菌。将线虫转移到琼脂垫上，放入一滴盐碳油中。用柔软的铂丝轻轻刷拭线虫直到固定。把焊盘安装在微注射台上。找到一只性腺臂，用针刺入。使用注射器的清洁功能，以99磅每平方英寸的压力输送注射混合物，直到性腺流动可见，确认试剂能进入合胞体。如果可及，重新定位舞台并以类似方式注射第二生殖腺臂。注射后立即将注射动物置于琼脂糖垫上，浸泡在一至两微升的M9缓冲液中。用细铂丝将注入的蚯蚓从垫子上取下，然后用M9缓冲液冲洗油脂，再将其回收到播种了水上昆虫的NGM板上。将恢复板在25摄氏度下孵育一夜。次日，将每株注入的P0线虫分离到种有Xenorhabdus griffiniae的NGM板上。设计了两个CRISPR RNA，分别针对unc-22的Steinernema雌雄同体同源物，位于先前发表的PAM位点。对暴露于尼古丁的线虫进行抖动分析显示，unc-22突变体与野生型线虫之间存在明显的运动差异。通过PCR对抽搐后代进行基因分型，显示Pam 3和Pam 5的目标位点均存在多条淡带。测序确认目标unc-22位点发生插入和缺失事件。我的实验室扩展了我在EPN遗传学的博士后研究。CRISPR现已在三种Steinernema属植物中获得。在该方案中，我们建立了一种高效的技术，利用CRISPR-Cas9基因编辑创建稳定且可遗传的突变体。通过稳定的CRISPR-Cas9基因编辑，我们可以剖析Steinernema-Xenorhabdus共生背后的分子机制。

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基于CRISPR-Cas9的诱突昆虫病原线虫 Steinernema hermaphroditum 的诱变及突变系的维护

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本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在克氏锥虫（Trypanosoma...

使用 CRISPR/Cas9 系统将基因敲除直接引入克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的无鞭毛体阶段

高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

CRISPR/Cas9 越来越多地被用于在非模式生物中鉴定基因功能。本实验方案描述了如何从制备显微注射混合物、获取并注射蚊子胚胎，到饲养、杂交和筛选注射后的蚊子及其后代以获得目标突变，从而建立致倦库蚊（Culex...

使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

本方案详细介绍了在白蛉中进行CRISPR/Cas9靶向诱变的步骤：胚胎收集、显微注射、昆虫饲养，以及目标突变的鉴定与筛选。...

用于CRISPR/Cas9诱变的沙蝇（Phlebotomus papatasi）胚胎显微注射

昆虫真社会性的许多特征依赖于巢群内部的交流与劳动分工。通过显微注射和CRISPR介导的突变技术对蚂蚁胚胎中的关键调控基因进行遗传操作，有助于揭示真社会性昆虫利他行为的本质。...

蚂蚁Harpegnathos saltator中通过胚胎注射实现CRISPR介导的诱变

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对棉铃虫（Helicoverpa armigera...

胚胎显微注射及CRISPR/Cas9基因组编辑棉铃虫（Helicoverpa armigera）（Hübner）敲除突变体的鉴定

本研究提供了一种基于CRISPR/Cas9核糖核酸酶的蝗虫纯合突变体构建的系统优化流程，以及蝗虫卵的冷冻保存与复苏的详细方法。...

利用CRISPR/Cas9技术构建飞蝗纯合突变体

昆虫病原线虫与细菌共生，二者共同作用，通过破坏昆虫的先天免疫系统成功感染宿主。为了促进对线虫感染遗传基础的研究，本文描述了昆虫病原线虫的保种及遗传操作方法。...

培养与遗传操作昆虫病原线虫

学习利用CRISPR-Cas9技术对昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum进行基因编辑和突变体构建的方法。该技术有助于研究线虫共生与寄生关系的遗传机制，为害虫生物防治提供新策略。

基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

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