基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

我们正在研究线虫细菌共生的遗传学，这在农业领域具有应用价值。异栖菌的遗传工具非常成熟，但EPN遗传学仍然有限，主要依赖RNAi和EMS筛选。首先，获取带有Xenorhabdus griffiniae和Comamonas aquaticus的线虫琼脂平板。

将Steinernema hermaphroditum线虫采摘到含有Xenorhabdus griffiniae的制备NGM板上。在25至28摄氏度下孵化以获得最佳生长。显微注射前一晚，将J3期雌雄同体采摘到新播种的Genorhabdus griffiniae的NGM琼脂平板上。

在微注射当天，选择年轻雌雄同体进行注射。使用BlastP从Steinernema hermaphroditum参考基因组中提取目标基因序列。选择一个早期编码外显子，最好是第一个外显子，并以默认设置将序列输入CRISPRscan，生成候选CRISPR RNA。

将顶尖候选CRISPR RNA与Steinernema hermaphroditum基因组对比，以确保没有非靶向匹配。将选定的CRISPR RNA和通用转激活CRISPR RNA分别储存在100微摩尔的双重缓冲液中，温度为零下80摄氏度。用微波炉把2%琼脂糖溶化在水中。

将50微升融化琼脂糖转移到盖玻璃上。立刻用第二个盖子盖住。晾干20分钟后，取下顶盖玻璃，然后在琼脂棉的正面贴上标签。

琼脂棉片应在室温下长期保存数月至数年。准备注射针头时，用激光丝拉拔器拉出石英毛细管，并将针头存放在移液器储存箱中。通过将选定的crRNA和通用转激活CRISPR RNA以一比一比例混合，制备新鲜的导引RNA双锁体。

将管子在94摄氏度下孵育两分钟，然后冷却至室温进行退火双芯。通过结合Cas9、氯化钾和gRNA双股组组装注射混合物并培养。将PCR管拨动三次搅拌后，在小型离心机中短暂旋转10到15秒。

最终混合后，旋转最多一分钟以收集内容物。接着，使用微装料头将1到2微升的注射混合物装入针头。把针套在支架上，用盐碳油下拖过双面胶带，把针尖打开。

然后用微注射器的清洁功能测试开口大小。在2%琼脂糖垫上滴一小滴卤碳油。用解剖显微镜和一根软铂丝，取出一只年轻的雌雄同体。

用M9缓冲液清洗以去除细菌。将线虫转移到琼脂垫上，放入一滴盐碳油中。用柔软的铂丝轻轻刷拭线虫直到固定。

把焊盘安装在微注射台上。找到一只性腺臂，用针刺入。使用注射器的清洁功能，以99磅每平方英寸的压力输送注射混合物，直到性腺流动可见，确认试剂能进入合胞体。

如果可及，重新定位舞台并以类似方式注射第二生殖腺臂。注射后立即将注射动物置于琼脂糖垫上，浸泡在一至两微升的M9缓冲液中。用细铂丝将注入的蚯蚓从垫子上取下，然后用M9缓冲液冲洗油脂，再将其回收到播种了水上昆虫的NGM板上。

将恢复板在25摄氏度下孵育一夜。次日，将每株注入的P0线虫分离到种有Xenorhabdus griffiniae的NGM板上。设计了两个CRISPR RNA，分别针对unc-22的Steinernema雌雄同体同源物，位于先前发表的PAM位点。

对暴露于尼古丁的线虫进行抖动分析显示，unc-22突变体与野生型线虫之间存在明显的运动差异。通过PCR对抽搐后代进行基因分型，显示Pam 3和Pam 5的目标位点均存在多条淡带。测序确认目标unc-22位点发生插入和缺失事件。

我的实验室扩展了我在EPN遗传学的博士后研究。CRISPR现已在三种Steinernema属植物中获得。在该方案中，我们建立了一种高效的技术，利用CRISPR-Cas9基因编辑创建稳定且可遗传的突变体。

通过稳定的CRISPR-Cas9基因编辑，我们可以剖析Steinernema-Xenorhabdus共生背后的分子机制。