高密度脂蛋白特异性磷脂外流检测法

我们开发了一种替代性检测方法，用于测量高密度脂蛋白（HDL）介导的冠状动脉斑块脂质清除作用，以评估冠状动脉疾病风险。目前的挑战是建立一种简单、快速且稳健的HDL脂质流入检测方法，以适用于科研和临床应用。首先，在化学通风橱内将所有所需成分加入玻璃容器中，并短暂涡旋混合脂质混合物，以充分混匀溶液。

将混合物置于玻璃试管中，在温和的氮气流下干燥一小时，使试管底部形成干燥的脂质膜。如需包被水合硅酸钙，将称量纸卷成圆锥形插入含有干燥脂质的玻璃试管中，通过纸锥将80毫克水合硅酸钙粉末导入试管底部。随后立即向试管中加入2毫升生理盐水，并用Parafilm封住管口。

用手轻轻涡旋玻璃管，使大部分脂质从管底脱落。将玻璃管插入固定在涡旋仪上的泡沫塑料平台的孔中，并使用加强胶带将玻璃管固定在涡旋平台上。涡旋玻璃管10分钟，并确认管壁上无残留脂质。

使用1毫升移液器将玻璃管中的内容物转移至一个15毫升锥形塑料管中。用3毫升生理盐水洗涤玻璃管，并将洗涤液转移至同一个15毫升塑料管中。接着，将含有脂质包被水合硅酸钙的15毫升塑料管放入离心机，在4摄氏度下以935×g离心2分钟。

使用长而细的移液枪头吸取上清液。从上清液顶部开始，在吸取过程中将枪头沿离心管内壁缓慢滑动。吸取时轻微倾斜离心管，并在沉淀上方保留约 200 µL 的生理盐水，以避免扰动沉淀。

然后，加入生理盐水使总体积达到 5 毫升。重复离心和上清液去除步骤四次。最后一次洗涤后，加入生理盐水使总体积达到 2.5 毫升。根据样本组所需的孔数，用移液器将 75 微升生理盐水加入到每个 0.3 毫升的 96 孔板的孔中。

将装有LC-CSH的15毫升塑料原液管涡旋振荡三次，每次10秒。使用单通道移液器，沿含盐水孔板的右侧加入50微升LC-CSH。每处理三个孔后，在向接下来的三个孔加样前重复一次涡旋振荡步骤。

将96孔板旋转180度，使孔的左侧现在位于右侧。沿每个孔的右侧加入25 µL血浆或血清样本。对于阳性对照孔，加入25 µL参考标准人正常脂血浆或血清。

接下来，用压敏封板膜将96孔板紧密密封，在37摄氏度、1,200转/分钟的恒温混匀仪中避光孵育1小时。孵育结束后，从恒温混匀仪中取出反应板并置于冰上。在4摄氏度条件下以935 ×g离心2分钟，使供体颗粒沉淀，终止转移反应。

现在，小心地从96孔板上移除粘性封膜，注意不要扰动LC-CSH沉淀。使用多通道移液器将反应板中的50微升上清液转移至黑色96孔平底聚苯乙烯板的各孔中。用生理盐水填充储液槽，并向每孔加入50微升生理盐水。

使用多通道移液器。在125毫升塑料锥形瓶中配制1% Triton X-100溶液。将配制好的1% Triton X-100溶液加入储液槽中，然后在每个孔中加入100 µL该溶液（室温）。

使用多通道移液器轻柔吹打 2 到 3 次以混匀，并用 3 毫升移液管吹出的空气去除气泡。最后，使用荧光计在激发波长 540 纳米、发射波长 600 纳米的条件下测定丽丝胺罗丹明的荧光强度。通过系列稀释的 LRHPE 标记的 LC-CSH 绘制标准曲线，结果显示荧光信号具有高度线性响应。

在血浆浓度曲线研究中，将不同体积的混合人血浆与生理盐水对照组一同分别加入三个复孔中。血浆剂量反应曲线显示，在15–35微升范围内，PE、外流率与血浆体积之间具有良好的线性关系和强相关性。我们这一简单快速的实验方案可用于预测心血管疾病的发生风险，适用于科研及临床诊断研究。

我们的研究结果表明，该检测方法能够阐明细胞内和细胞外斑块脂质在心血管疾病中的作用。