Name: 高密度脂蛋白特异性磷脂外排测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学习高密度脂蛋白特异性磷脂外排测定方法，用于评估心血管疾病风险。该实验通过测量人血浆中HDL介导的荧光磷脂清除功能，为临床诊断和基础研究提供快速可靠的检测手段。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）院内研究计划的部分支持。NIH作者的贡献被视为美国政府作品。本文所述的研究结果和结论均为作者的观点，不一定反映NIH或美国卫生与公共服务部的看法。

血液采集应遵循1975年《赫尔辛基宣言》（https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/）的规定，该宣言于2013年修订，并应符合机构关于知情同意的指导方针。
1. 荧光磷脂标记的供体脂质颗粒的制备
<ol>
	<li>脂质膜的形成 
	警告：在通风橱中配制和分装储备液。穿戴实验服、手套和护目镜。含氯仿溶液应弃置于有机化学废弃物容器中，不含血浆的Triton X-100溶液弃置于化学废弃物容器中，含血浆的溶液弃置于生物危害/医疗废弃物容器中。
	<ol>
		<li>从供应商处购买氯仿中的脂质储备液，或在实验室中自行配制： 
		25 mg/mL：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DMPC）： 
		10 mg/mL：胆固醇 
		1 mg/mL：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基) [LRh-PE] 
		注意：使用螺旋盖气密玻璃管。用聚四氟乙烯胶带密封管盖。 
		-20℃保存 oC.</li>
		<li>确定所需LC-CSH的量，并准备相应数量的玻璃管。 
		在化学通风橱中，向每根10 mm × 150 mm的硼硅酸盐玻璃试管中加入以下成分：472 µL DMPC储备液（17.7 µmol，11.8 mg）、339 µL胆固醇储备液（8.8 µmol，3.39 mg）和305 µL LRh-PE（200 nmol，0.305 mg）。短暂涡旋混匀。</li>
		<li>在通风橱中，将玻璃管内的脂质混合物用温和的氮气流吹干2 孵育1小时，使管底形成干燥的脂质膜。 
		注意：N 的流动2 应仅在液面引起轻微的涟漪。</li>
		<li>对于需要在数天或数周内使用多个96孔板的检测，可制备大量LC-CSH，分装至离心管中，或用于制备即用型LC-CSH板，储存于-20 °C或-80 °C。详见下文步骤2.2.1–2.2.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以荧光脂质膜包覆水合硅酸钙 
	注意：操作水合硅酸钙时，需穿戴实验服、手套、口罩和护目镜。
	<ol>
		<li>将称量纸折成的锥形漏斗插入装有干燥脂质的玻璃管中。通过该称量纸锥形漏斗将80 mg水合硅酸钙（CSH）粉末（脂质去除试剂）加入玻璃管中，确保粉末落入管底。立即向含有干燥脂质和CSH的玻璃管中加入2 mL生理盐水。用封口膜封住管口。</li>
		<li>用手涡旋，使大部分脂质从玻璃管底部脱落。将玻璃管插入固定在涡旋仪顶部的泡沫塑料平台上的孔中。使用加强胶带将玻璃管固定在涡旋仪平台上。 
		注意：预先调节涡旋速度，使混合物沿玻璃管上升至约一半高度。</li>
		<li>涡旋10分钟。涡旋后，确认管壁上无残留脂质。如有必要，手动涡旋直至无脂质残留。使用1 mL移液器将玻璃管中的全部液体转移至15 mL锥形塑料管中。用3 mL额外的生理盐水冲洗玻璃管管壁，并将冲洗液转移至同一15 mL锥形塑料管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤 LC-CSH
	<ol>
		<li>将含有脂质包被的碳酸钙微球（LC-CSH）的15 mL塑料管在935 × g条件下离心2分钟 g 在 4 °C 下离心以沉淀供体颗粒。使用长而极细的移液器吸头，通过真空抽吸小心去除上清液。</li>
		<li>从上清液顶部开始，将移液枪枪头沿离心管内壁缓慢滑动，同时随着上清液的移除逐渐倾斜离心管。保留少量生理盐水（约 200 µL），以防止意外吸出沉淀中的 LC-CSH。加入足够的生理盐水，使总体积达到 5 mL。</li>
		<li>重复步骤 1.3.1–1.3.2 四次。最后一次洗涤后，加入足够的生理盐水，使最终体积为 2.5 mL。 
		注意：将LC-CSH制剂在4 °C下保存2周，或在-20 °C或-80 °C下保存长达6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>即用型液相色谱-碳载荷硅胶板的大批量制备 
	注意：该方法能够使用同一批次的LC-CSH制备具有均一试剂组成的测量板，从而最大限度地减少板间测量的变异性。
	<ol>
		<li>按照上述步骤1.1.1–1.3.2制备12个LC-CSH管（每管2.5 mL，共12管）。将全部12管内容物转移至一个50 mL塑料锥形管中（总体积30 mL）。轻轻涡旋振荡，使LC-CSH颗粒均匀分布，然后分装6 mL至一个15 mL塑料锥形管中。重复此操作四次，共得到5个15 mL塑料锥形管，每管含6 mL LC-CSH。</li>
		<li>每管可提供足够的LC-CSH，用于制备5块即用型LC-CSH板（每块板包含96个孔，每孔50 µL）。详见下文步骤2.2.1-2.2.2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 血浆/血清样本与荧光标记磷脂的供体脂质颗粒（LC-CSH）孵育
<ol>
	<li>即用型单个培养皿
	<ol>
		<li>向一个0.3 mL 96孔板的每个孔中加入75 µL生理盐水，根据待检测样本集所需使用相应数量的孔。向三份阴性对照（NC）孔中各加入100 µL生理盐水，向两份阳性对照（PC）孔中各加入75 µL生理盐水。图2）。使用多通道移液器进行分液。</li>
		<li>在分配LC-CSH之前，将15 mL塑料储备管涡旋振荡3次，每次10秒。使用单通道移液器，沿含盐水孔的右侧加入50 µL LC-CSH。迅速向仅3个孔中各加入50 µL。在向接下来的3个孔中分配LC-CSH之前，重复上述涡旋步骤。 
		注意：此步骤至关重要，可确保自发沉淀的重链LC-CSH均匀悬浮，从而使其能够等量分配至各孔中。</li>
		<li>将96孔板旋转180°，使孔的左侧变为右侧。沿孔的右侧加入25 µL血浆/血清样本（图2对于PC孔，加入25 µL参考标准人正常血脂血浆/血清。每次检测每孔总体积为150 µL。 
		注意：由于血浆/血清与LC-CSH分别加样于孔板的相对两侧，该步骤可防止二者之间的交叉污染。</li>
		<li>用封口膜将酶标板密封。将密封好的96孔板置于恒温混匀仪中，在37 °C、1200 rpm条件下避光孵育1小时。孵育结束后，从恒温混匀仪中取出酶标板并置于冰上。在4 °C条件下离心2分钟（以终止转移反应），离心速度为935 ×g。 g 离心收集供体颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>即用型 LC-CSH 板
	<ol>
		<li>使用时，将冻存的即用型培养板（培养板制备参见步骤1.4.1–1.4.2）在低温（4 °C 至 10 °C）下解冻2小时（如需要可过夜）。在4 °C下以935 × g离心2分钟 g 将所有材料（125 µL）收集到一起。小心移除粘性封口膜，避免溅出孔内液体。</li>
		<li>将25 µL的血浆/血清样本、生理盐水和参考人血浆分别加入相应孔中，每份样本设三个复孔。图1的 即用型 将培养板置于冰上，并用封口膜密封。将密封后的96孔板在37 °C、1200 rpm条件下于恒温混匀仪中避光孵育1小时。从恒温混匀仪中取出培养板，置于冰上。在4 °C条件下离心2分钟（以终止转移反应），离心力为935 × g （用于沉淀供体颗粒）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="血液分离示意图；血浆-生理盐水界面；LC-CSH加样装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68947/68947fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 2"> 
图2：在无交叉污染的情况下将试剂分配至孔中。 将血浆/血清和LC-CSH分别加样于孔的相对侧壁。首次加入LC-CSH后，若将板旋转180°，可最大程度减少交叉污染。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68947/68947fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 血浆/血清高密度脂蛋白荧光磷脂外流的测定
<ol>
	<li>转移至黑色板并进行荧光检测
	<ol>
		<li>小心移除粘性封膜，避免扰动LC-CSH沉淀。 
		注意：若发生沉淀物破坏，请再次离心。</li>
		<li>使用多通道移液器，将96孔反应板中50 µL上清液转移至96孔黑色聚苯乙烯平底板的孔中，用于荧光检测。 
		注意：切勿吸取LC-CSH沉淀。若不慎吸入，请将其重新注入孔中并再次离心。</li>
		<li>在储液槽中加入生理盐水。使用多通道移液器向每孔加入50 µL生理盐水。</li>
		<li>在125 mL塑料锥形瓶中，将90 mL蒸馏水加入10 mL 10% Triton X-100储备液中，配制1% TX-100溶液。将1% Triton X-100加入储液槽中。</li>
		<li>向每孔加入100 µL室温的1% Triton X-100溶液，使用多通道移液器轻轻吹打2–3次以混匀。避免产生气泡。如有气泡，可用3 mL移液管吹出空气将其戳破。</li>
		<li>使用荧光计测量Lissamine rhodamine荧光（激发波长540 nm，发射波长600 nm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>%PE外排率的计算
	<ol>
		<li>PE外排率计算
		<ol>
			<li>%PE外排率 = ([总上清液血浆或血清FLU - 上清液阴性对照FLU] / 总FLU) × 100 
			FLU = 荧光单位；NC = 阴性对照。由于每孔仅使用150 µL上清液反应混合物中的50 µL进行荧光检测，需按以下方式校正：</li>
			<li>每孔总上清液FLU = 50 µL（黑色板）测得的FLU × 3</li>
			<li>每孔150 µL反应混合物的总FLU = 50 µL LC-CSH释放的总荧光量。 
			注意：LC-CSH荧光值的计算方法如下所述（步骤4.2.5）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>标准化%PE外排率的计算
		<ol>
			<li>使用标准化%PE外排率以校正在不同条件下进行的实验之间的差异（例如不同日期进行的实验、批次差异）。</li>
			<li>使用以下公式计算标准化%PE外排率： 
			标准化%PE外排率 = 样品上清液%PE外排率值（FLU）/ 阳性参照对照上清液%PE外排率FLU值。</li>
			<li>使用来自脂质谱正常的健康供体的相同混合人血浆作为参照对照。由于样品与参照对照的每孔总上清液FLU值相同，无需单独计算该值。</li>
			<li>对于三复孔样品，将步骤3.1.6中获得的原始数据粘贴至电子表格（补充表1）。对于双复孔样品，将步骤3.1.6中获得的原始数据粘贴至电子表格（补充表2）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. LC-CSH 标准曲线
注意：LC-CSH 标准曲线用于计算每孔中 LC-CSH 等分试样所含的 PE 荧光信号量。通常每孔使用 50 µL 的 LC-CSH。该值可用于计算相对于反应混合物中总荧光强度（见步骤 3.2.1）归一化的样品中 PE 向 HDL 外排的百分比。
PE 外排率 = （（上清液样本荧光单位 [FLU] - 上清液生理盐水 FLU）/ 总 LC-CSH FLU）× 100。
<ol>
	<li>LC-CSH 的连续稀释
	<ol>
		<li>制备储备液 LC-CSH（按步骤 1.1.1–1.3.3 所制备）的 10 倍和 100 倍稀释液： 
		10 倍稀释：100 µL LC-CSH + 900 µL 1% Triton X-100 
		100 倍稀释：100 µL 10 倍稀释的 LC-CSH + 900 µL 1% Triton X-100</li>
		<li>将 10 倍和 100 倍稀释的 LC-CSH 样品各取三份，分装至 96 孔孵育板中用于标准曲线测定（见 图 3）。</li>
		<li>向含有 LC-CSH 的各孔中加入足量的 1% Triton X-100，使最终体积达到 200 µL（见 表 1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于荧光测定的 LC-CSH 溶解处理
	<ol>
		<li>用粘性封板膜密封板孔，在 24 °C、1200 rpm 振荡条件下孵育 1 小时。随后在 4 °C、935 × g 条件下离心 2 分钟。小心移除封板膜。</li>
		<li>使用多通道移液器，通过上下吹打 2–3 次混匀样品。将每孔 100 µL 的 LC-CSH 转移至 96 孔黑色聚苯乙烯平底板中，用于荧光测定。</li>
		<li>使用多通道移液器，向每孔加入 100 µL 室温的 1% Triton-X，通过上下吹打 2–3 次混匀。</li>
		<li>使用荧光计测定荧光值（激发波长 540 nm，发射波长 600 nm）。</li>
		<li>将荧光计测得的荧光值填入 补充文件 3 中指定的 补充表 1 的 线性回归分析 模板中。标准曲线测定板中 LC-CSH 的最终浓度见 表 2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于蛋白质定量实验的荧光检测板示意图，显示每孔的 µL 浓度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68947/68947fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 3"> 
图 3：LC-CSH 标准曲线用板。如图所示，将系列稀释的 LRh-PE 标记的 LC-CSH 加入 96 孔板中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68947/68947fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>终浓度</td>
			<td>10 倍稀释</td>
			<td>100 倍稀释</td>
			<td>1% Triton X-100</td>
			<td>总体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>去垢剂</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(μL/孔)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
			<td>175</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25</td>
			<td>0</td>
			<td>25</td>
			<td>175</td>
			<td>200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：LC-CSH标准曲线孵育板各孔中添加试剂的体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶解的</td>
			<td>生理盐水</td>
			<td>总体积</td>
			<td>添加的</td>
			<td>测定的</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>体积</td>
			<td>体积</td>
			<td>LC-CSH</td>
			<td>LC-CSH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL)</td>
			<td>(μL/孔)</td>
			<td>(μL/孔)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：LC-CSH标准曲线测定板各孔中加入试剂的体积。

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</ol>

专利：US20220178953A1；WO2020185598A1（E.B.N.，M.S.，A.T.R.）
Masaki Sato 就职于 Eiken Chemical Co., Ltd.。

HDL-C 是临床评估心血管疾病（CVD）风险以及是否需要进行降脂治疗或其他潜在预防性治疗的关键决定因素1高密度脂蛋白在细胞胆固醇外流中的功能 体外 已被证明比高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）更能预测新发心血管疾病7不幸的是，由于该细胞实验耗时较长且需要细胞培养，因此难以转化为适用于常规临床诊断检测的高通量临床实验室检测方法。然而，基于细胞的CEC实验在科研实验室开展的研究中仍然具有实用价值。使用J774细胞时，该实验的可靠性更高（%CV &#60; 4）使用荧光胆固醇替代放射性胆固醇时，操作更为简便且用户友好9然而，除了维持细胞培养和在96孔板中接种所需的时间外， &#34;活跃的&#34; 进行胆固醇流出能力（CEC）检测所需时间至少为8小时（包括cAMP激活/使用荧光或放射性胆固醇标记、血浆中apoB的去除、细胞与去apoB血浆的孵育、细胞及培养基中放射活性的提取与测定），整个检测过程需持续3天。18HDL-SPE 检测比 ...

高密度脂蛋白特异性磷脂外流（HDL-SPE）检测用于评估高密度脂蛋白的功能，适用于生物医学研究和临床诊断实验室，旨在：（i）进一步揭示高密度脂蛋白介导脂质从动脉粥样硬化病变中清除的机制；（ii）作为改进临床心血管疾病风险评估的新平台；以及（iii）开发治疗心血管疾病的新疗法。
高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）是心血管疾病（CVD）风险的重要决定因素1，但其临床应用价值受到限制，因为HDL-C水平升高（&gt;80 mg/dL）反而与更高的心血管疾病风险相关2,3,4,5。HDL-C水平升高可能反映了功能失调的高密度脂蛋白的积聚，其清除动脉粥样硬化斑块中脂质的能力下降6。
细胞胆固醇流出能力（CEC）检测是首个用于评估高密度脂蛋白（HDL）功能的体外检测方法。该检测通常使用经3H或荧光Bodipy-胆固醇标记的培养巨噬细胞（小鼠或人源），与去除载脂蛋白B（apoB）的血浆或血清共同孵育。胆固醇流出百分比根据细胞及培养基中荧光或放射活性的量进行计算7,8,9。研究表明，CEC检测对新发心血管疾病（CVD）的预测能力优于HDL-C7。然而，由于该检测需要细胞培养且耗时较长（例如数天），难以转化为常规临床诊断检测。此外，CEC检测还受限于其固有的变异性，例如所用细胞类型、标记技术的不同，以及聚乙二醇（PEG）去除β-脂蛋白的过程会改变HDL组成10。
多个研究团队已开发出无细胞的高密度脂蛋白（HDL）胆固醇外流检测方法，旨在作为研究HDL功能的新工具，并有望转化为临床诊断检测手段，以更准确地评估心血管疾病（CVD）风险11,12这些外排实验通常包含多个步骤，使用带有荧光标记胆固醇的脂质供体颗粒；与胆固醇外排能力（CEC）实验类似，它们要么需要去除β-脂蛋白，要么利用抗载脂蛋白A-I（apoA-I）抗体捕获含apoA-I的颗粒，以测定血浆高密度脂蛋白（HDL）胆固醇的外排量。尽管这些替代性实验已被验证在不同程度上与心血管疾病（CVD）风险相关，但迄今为止，仅有一种13，该指标可评估apoA-I的交换速率，已被证明能够预测新发心血管疾病风险14有趣的是，载脂蛋白A-I在血浆高密度脂蛋白上结合与解离的动力学已被证明与胆固醇流出能力独立相关15 在急性冠状动脉综合征患者中显著降低16此外，已发现多种高密度脂蛋白可交换载脂蛋白能够介导表达ABCA1的细胞中的胆固醇和磷脂。 体外17.
我们已开发出一种评估高密度脂蛋白（HDL）功能性的替代方法18。此处所述的检测方法简单、快速且可靠，仅需两种组分：全人（或动物）血浆或血清样本（新鲜或经冻融处理），以及荧光脂质包被的供体颗粒。该检测方法用于测量全血浆/血清中载脂蛋白A-I（apoA-I）及其他与HDL相关的可交换载脂蛋白从脂质包被的供体颗粒上移除非可交换、头部基团标记的荧光磷脂酰乙醇胺（PE）的能力18（图1）。
本实验中的供体颗粒由硅酸钙水合物晶体（CSH）构成，其表面包被有胆固醇、磷脂酰胆碱（PC）以及一种荧光标记的磷脂酰乙醇胺（PE）。可交换的高密度脂蛋白（HDL）相关载脂蛋白（主要为apoA-I）从HDL颗粒释放后，会结合到供体颗粒上，随后与供体颗粒的脂质（包括荧光标记的PE）一同解离。通过这种方式，只有HDL（而非血浆/血清中其他脂蛋白）能够特异性地从供体颗粒获取荧光标记的PE18,19。将全血浆/血清与荧光脂质包被的硅酸钙水合物（LC-CSH）供体颗粒及生理盐水在37 °C条件下孵育1小时，并持续振荡。由于LC-CSH的密度约为水的两倍，因此可通过低速离心轻松将供体颗粒与血浆分离。
临床研究中测得的PE外流百分比（% PE efflux）通常通过将临床样本反应混合物上清液中HDL获得的PE荧光值除以参考对照人血浆中HDL获得的PE荧光值进行标准化。对参考血浆进行标准化是为了校正试剂制备过程中的变异。对于科研应用，% PE外流可通过计算上清液PE荧光值除以总荧光值（上清液PE荧光值 + LC-CSH荧光值）来确定。上清液荧光测定值将被粘贴至电子表格文件中的模板，以计算%PE外流（补充表1用于三复孔测定，补充表2用于双复孔测定）。电子表格中执行这些计算的说明作为补充文件提供（补充文件1、补充文件2、补充文件3、补充文件4、补充文件5、补充文件6、补充文件7和补充文件8），并提供了示例计算（补充表3）。
<img alt="使用96孔板进行血浆分析示意图；孵育、离心、荧光检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68947/68947fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：HDL-SPE检测。 在96孔板中检测高密度脂蛋白（HDL）特异性磷脂外流。将生理盐水、包被脂质（LC-CSH）的水合硅酸钙晶体（灰色），包括不可交换的罗丹明标记磷脂酰乙醇胺（LRh-PE；红色膜层），以及最多30份全血浆/血清样本（黄色；每样本设三个复孔）加入96孔板中。在37 °C恒温混匀仪中振荡混合1小时后，短暂离心使LC-CSH供体颗粒沉淀。将上清液等分转移至含去垢剂（用于溶解Lh-Rh-PE）和生理盐水的黑色检测板中。随后使用荧光计测定磷脂酰乙醇胺（PE）的荧光强度。在最后几孔中，分别用生理盐水（阴性对照；NC）进行背景校正，以及用汇集的健康人血浆（阳性对照；PC）进行板间标准化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68947/68947fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱</td><td>Avanti Research</td><td>850345</td><td>14:0 PC (DMPC) 氯仿溶液</td></tr><tr><td>1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)（铵盐）</td><td>Avanti Research</td><td>810150-C</td><td>氯仿溶液 LRh-PE</td></tr><tr><td>粘性封膜</td><td>Applied Biosystems&amp;nbsp;</td><td>4306311</td><td>MicroAmp 透明粘性封膜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bay Corporation 高密度聚四氟乙烯胶带 1/2 英寸 × 520</td><td>Medical Testing Solutions</td><td>86732</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃试管 20 mm &amp;acute; 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall X Pro Series</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td>适用于高效液相色谱，&amp;ge;99.8%</td></tr><tr><td>胆固醇粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td>3&amp;beta;-羟基-5-胆甾烯，5-胆甾烯-3&amp;beta;-醇</td></tr><tr><td>玻璃纸称量纸</td><td>Cole-Palmer</td><td>&amp;nbsp;UX-01338-02</td><td>用于处理 LC-CSH</td></tr><tr><td>孵育板</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1402-9700</td><td>TempPlate 96孔半裙边0.2 mL PCR板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>脂质去除剂 (LRA)</td><td>Supelco</td><td>13358-U</td><td>LC-CSH</td></tr><tr><td>检测板</td><td>Greiner bio-one&amp;nbsp;</td><td>655076</td><td>微孔板，聚苯乙烯，96孔，F型底（烟囱井），黑色；FLUOTRAC，中等结合力</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft 365 MSO&amp;nbsp;</td><td>版本 2507</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlex 移液吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-550-206</td><td>用于LC-CSH洗涤过程中吸取上清液</td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>1420-050</td><td>Victor3 Wallac1420 多功能酶标仪</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Quality Biological&amp;nbsp;</td><td>114-055-101</td><td>用于多种用途&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Cole-Palmer</td><td>HS23452</td><td>涡旋振荡时覆盖玻璃管口</td></tr><tr><td>聚碳酸酯锥形瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-041-8</td><td>用于10% Triton-X溶液</td></tr><tr><td>混合人血浆（血液来源）锂肝素抗凝</td><td>Innovative Research Inc</td><td>IPLAWBLIH</td><td>参考血浆，阳性对照 (PC)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Surfact-Amps X 100&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>10% Triton X-100，用蒸馏水稀释10倍</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>Thermomixer C 配96孔温控模块</td></tr><tr><td>Thermomixer Smartblock</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td>96孔 SmartBlock</td></tr><tr><td>移液管（3 mL，Falcon）</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9CM</td><td>用于去除孔板表面气泡</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Daigger</td><td>3030A</td><td>顶部附带玻璃管固定夹</td></tr></tbody></table>

高密度脂蛋白特异性磷脂外流检测法

High-Density Lipoprotein-Specific Phospholipid Efflux Assay

高密度脂蛋白（HDL）-胆固醇（HDL-C）的血浆水平目前是临床评估心血管疾病（CVD）风险的关键指标。HDL介导的胆固醇从动脉壁细胞及细胞外脂质沉积中清除脂质，是HDL多种抗动脉粥样硬化功能之一，可能解释其与CVD风险呈负相关的关系。HDL介导的细胞胆固醇清除 体外 最近被证明比HDL-C更能预测心血管疾病风险。
高密度脂蛋白（HDL）由一群异质性颗粒组成，具有不同的功能。参与清除动脉粥样硬化斑块脂质的HDL颗粒含有可交换的载脂蛋白，主要是载脂蛋白A-I，这些蛋白会从颗粒上解离，进而清除斑块中的脂质。新生HDL是由HDL来源的可交换载脂蛋白溶解并清除ABCA1介导的细胞质膜结构域中的磷脂和胆固醇而形成的。该过程在动脉粥样硬化斑块的预防和消退中起着关键作用。
本文描述了无细胞高密度脂蛋白特异性磷脂外流（HDL-SPE）检测的实验方案，我们先前的研究已表明该检测可预测新发心血管疾病（CVD）风险。该检测专门用于测量高密度脂蛋白载脂蛋白介导的、从脂质供体颗粒中移除非交换性荧光磷脂的过程。我们的病例对照临床研究证实，HDL-SPE 检测的性能至少与“金标准”细胞基胆固醇外流能力检测相当，甚至可能更优；后者是一种操作繁琐且技术复杂的检测方法，通常需使用放射性标记的胆固醇。
本实验方案的目的是使基础与临床研究人员均能利用一种简单、标准化、无细胞、高通量的检测方法，评估高密度脂蛋白（HDL）在脂质转运中的功能。基础研究人员可利用该检测方法深入探究HDL介导脂质外流的潜在机制，并用于筛选可增强HDL功能的新治疗药物。HDL-SPE还可作为临床实验室的诊断检测手段，用于心血管疾病（CVD）风险评估。

分析方法
如上所述，HDL-SPE 样品分析可根据不同应用进行调整，如下文所示。在使用研究样品开展实验之前，需首先完成 LC-CSH 标准曲线验证、重复性检测以及血浆浓度测定，以掌握所需技术。首先，进行 LC-CSH 标准曲线分析，以评估 LC-CSH 制备物的质量；其次，进行重复性检测；最后，应进行血浆剂量检测以确认线性关系。当重复性检测中的变异系数（CV%）达到 ≤ 5 时，即可开展临床或研究工作。掌握 LC-CSH 标准曲线分析技术，也有助于开展 % 荧光PE外排检测（将样品的PE荧光值相对于LC-CSH的PE荧光值进行归一化）。对于临床检测，特别是涉及大量样本且需在不同时间多次检测的情况，将样品PE荧光值简单归一化至阳性对照（所有96孔板均使用同一批次的人混合血浆）可作为评估心血管疾病（CVD）风险的有效指标18。
用于标准曲线分析的LC-CSH中溶解性荧光PE的测定
<p class="jove...

本文描述了测定高密度脂蛋白（HDL）从全人血浆或血清中的脂质供体颗粒特异性移除荧光磷脂量的实验方案。我们已证实，该HDL功能指标可预测心血管疾病的发生。

血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平目前是临床评估心血管疾病（CVD）的关键指标……

我们开发了一种替代性检测方法，用于测量高密度脂蛋白（HDL）介导的冠状动脉斑块脂质清除作用，以评估冠状动脉疾病风险。目前的挑战是建立一种简单、快速且稳健的HDL脂质流入检测方法，以适用于科研和临床应用。首先，在化学通风橱内将所有所需成分加入玻璃容器中，并短暂涡旋混合脂质混合物，以充分混匀溶液。将混合物置于玻璃试管中，在温和的氮气流下干燥一小时，使试管底部形成干燥的脂质膜。如需包被水合硅酸钙，将称量纸卷成圆锥形插入含有干燥脂质的玻璃试管中，通过纸锥将80毫克水合硅酸钙粉末导入试管底部。随后立即向试管中加入2毫升生理盐水，并用Parafilm封住管口。用手轻轻涡旋玻璃管，使大部分脂质从管底脱落。将玻璃管插入固定在涡旋仪上的泡沫塑料平台的孔中，并使用加强胶带将玻璃管固定在涡旋平台上。涡旋玻璃管10分钟，并确认管壁上无残留脂质。使用1毫升移液器将玻璃管中的内容物转移至一个15毫升锥形塑料管中。用3毫升生理盐水洗涤玻璃管，并将洗涤液转移至同一个15毫升塑料管中。接着，将含有脂质包被水合硅酸钙的15毫升塑料管放入离心机，在4摄氏度下以935×g离心2分钟。使用长而细的移液枪头吸取上清液。从上清液顶部开始，在吸取过程中将枪头沿离心管内壁缓慢滑动。吸取时轻微倾斜离心管，并在沉淀上方保留约 200 µL 的生理盐水，以避免扰动沉淀。然后，加入生理盐水使总体积达到 5 毫升。重复离心和上清液去除步骤四次。最后一次洗涤后，加入生理盐水使总体积达到 2.5 毫升。根据样本组所需的孔数，用移液器将 75 微升生理盐水加入到每个 0.3 毫升的 96 孔板的孔中。将装有LC-CSH的15毫升塑料原液管涡旋振荡三次，每次10秒。使用单通道移液器，沿含盐水孔板的右侧加入50微升LC-CSH。每处理三个孔后，在向接下来的三个孔加样前重复一次涡旋振荡步骤。将96孔板旋转180度，使孔的左侧现在位于右侧。沿每个孔的右侧加入25 µL血浆或血清样本。对于阳性对照孔，加入25 µL参考标准人正常脂血浆或血清。接下来，用压敏封板膜将96孔板紧密密封，在37摄氏度、1,200转/分钟的恒温混匀仪中避光孵育1小时。孵育结束后，从恒温混匀仪中取出反应板并置于冰上。在4摄氏度条件下以935 ×g离心2分钟，使供体颗粒沉淀，终止转移反应。现在，小心地从96孔板上移除粘性封膜，注意不要扰动LC-CSH沉淀。使用多通道移液器将反应板中的50微升上清液转移至黑色96孔平底聚苯乙烯板的各孔中。用生理盐水填充储液槽，并向每孔加入50微升生理盐水。使用多通道移液器。在125毫升塑料锥形瓶中配制1% Triton X-100溶液。将配制好的1% Triton X-100溶液加入储液槽中，然后在每个孔中加入100 µL该溶液（室温）。使用多通道移液器轻柔吹打 2 到 3 次以混匀，并用 3 毫升移液管吹出的空气去除气泡。最后，使用荧光计在激发波长 540 纳米、发射波长 600 纳米的条件下测定丽丝胺罗丹明的荧光强度。通过系列稀释的 LRHPE 标记的 LC-CSH 绘制标准曲线，结果显示荧光信号具有高度线性响应。在血浆浓度曲线研究中，将不同体积的混合人血浆与生理盐水对照组一同分别加入三个复孔中。血浆剂量反应曲线显示，在15–35微升范围内，PE、外流率与血浆体积之间具有良好的线性关系和强相关性。我们这一简单快速的实验方案可用于预测心血管疾病的发生风险，适用于科研及临床诊断研究。我们的研究结果表明，该检测方法能够阐明细胞内和细胞外斑块脂质在心血管疾病中的作用。

high-density-lipoprotein-specific-phospholipid-efflux-assay

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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