Name: 秀丽隐杆线虫运动的年龄依赖性动力学：李雅普诺夫指数分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 了解如何使用李雅普诺夫指数分析秀丽隐杆线虫的年龄依赖性运动动力学。本研究通过动态光学衍射方法揭示运动控制在第五天达到峰值后随年龄增长而下降的规律。

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感谢瓦萨学院和露西·梅纳德·萨蒙研究基金的经费支持。同时感谢 Kathleen Susman 博士、Juan Merlo 博士和 Susannah Zhang 博士在本研究各个阶段提供的宝贵建议与帮助。

1. 数据采集用 C. elegans 的制备
<ol>
	<li>在每块线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上加入0.5 mL OD600的E. coli，供线虫取食。等待E. coli在每块琼脂平板上干燥。</li>
	<li>从任意生物材料供应商处获取一盘对照板的C. elegans，用于制备新的C. elegans平板，以实现年龄控制。</li>
	<li>使用本生灯或等效设备的火焰对铂金接种环进行灭菌。在解剖显微镜下挑选5–10条野生型成年C. elegans，放入每块平板中。</li>
	<li>让线虫产卵4–5小时，然后将成虫从平板中移除。孵育剩余的线虫，并在所需时间点进行挑选。</li>
	<li>在数据采集当天，用室温去离子水填充一个容积为4.5 mL、尺寸为10 mm × 10 mm × 45 mm的光学级石英比色皿，加水至略低于比色皿顶部，以防止加盖塑料盖后液体溢出。挑选2–3条线虫，轻轻放入比色皿中。待线虫进入比色皿后，将其侧放，以便于将虫体与激光束对齐。C. elegans可能会沉向底部，但只要完全浸没在水中，便会持续进行游泳样波动5。</li>
</ol>
2. 数据采集
注意：为了尽量减少年龄方面的不确定性，以下记录时间序列的步骤必须每天在大致相同的时间实施。
<ol>
	<li>设置前一篇文章中描述的实验22。进行一项小的改进：使用两面镜子构建一个潜望镜，并将比色皿侧放在两面镜子之间，以便后续更容易将线虫居中于激光束中。在衍射图样位置放置一个光电二极管（PD），取代相机（图1）。
	<ol>
		<li>垂直调整镜子以构建上述潜望镜。 
		注意：这是唯一需要完成的激光准直工作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开氦氖（HeNe）激光器并预热至达到热平衡（约15分钟）。</li>
	<li>启动数字示波器以开始数据采集。在数字示波器上设置时间间隔和存储缓冲区参数。将时间间隔设为100秒，并设置至少每秒100千采样点（kS）的存储缓冲区。</li>
	<li>将数据采集速率的分辨率设为1 kHz，振幅分辨设为12位，这有助于区分小尺度上的复杂性23。</li>
	<li>使用自动交流偏置（Auto AC offset）功能将示波器设置为使强度振荡的时间序列居中于零伏。</li>
	<li>选取2-3条线虫，轻轻放入装有蒸馏水的比色皿中，以便更容易找到并将至少一条线虫居中于激光束中。切勿摇晃比色皿。</li>
	<li>将装有2-3条线虫的比色皿放入潜望镜中，并将其中一条线虫居中于激光束中。
	<ol>
		<li>当C. elegans被居中于激光束中时，约在潜望镜50 cm远处会形成远场衍射图样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当一条C. elegans穿过激光束时，将光电二极管置于远场衍射图样中。确保光电二极管在衍射图样中偏离中心位置，以捕获衍射光而非中央极大值（透射激光束）。</li>
	<li>至少采集10秒的数据以可靠计算李雅普诺夫指数（LLE）；即至少需要10,000个数据点才能计算出稳定的LLE。 
	注意：数据点较少会导致LLE出现人为波动。</li>
	<li>每天重复上述数据采集9至15次。在每天同一时间采集3至12天龄的数据。</li>
</ol>
3. 数据分析
注意：对于数据分析，使用滞后图16将时间序列嵌入相空间，然后通过计算轨迹的发散程度来估计最大李雅普诺夫指数（LLE）。
<ol>
	<li>通过仔细检查时间序列，选择线虫在激光束内自由游动的时间段。图2A展示了一个有效的时间序列，其连续信号至少持续20秒。</li>
	<li>筛查时间序列的信噪比是否较低（图2B）。通过在比色皿中无虫体时记录时间序列来确定噪声水平。时间序列中的特征（不仅仅是幅值）必须超过噪声水平的两倍以上。</li>
	<li>从相关时间序列中排除任何饱和的数据（图2C）。如果过多数据发生饱和以致无法提取有用信息，请返回上述“数据采集”部分，重复步骤2.7.1至2.9，并通过将光电二极管移离中心极大值来调整光强水平。</li>
	<li>确定平均频率，其表达式为 
	<img alt="静态平衡方程，μ = ∫[0 到 ∞]f·P(f)df / ∫[0 到 ∞]P(f)df，数学公式。" src="/files/ftp_upload/68955/68955eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程2">   (2) 
	其中f为频率，P为功率谱（图3）。可通过快速傅里叶变换（FFT）进行计算，然后对频率取平均值。许多计算程序均内置有计算数据集平均频率的功能。</li>
	<li>采用时间延迟法重建相空间的拓扑结构。选取一个时间序列X，并将其延迟一个时间延迟量τ，以解析轨迹（图4）。最优时间延迟通过识别互信息（MI）中的第一个局部最小值来确定24： 
	<img alt="互信息公式：MI=ΣN i,i+τ p(Xi,Xi+τ)log(p(Xi,Xi+τ)/p(Xi)p(Xi+τ))；统计分析。" src="/files/ftp_upload/68955/68955eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程3">    (3) 
	其中N为数据点数量，Xi是时间序列X中的一个点，而Xi+τ是同一时间序列中延迟后的点。p(Xi)表示点Xi出现的概率，p(Xi+τ)表示点Xi+τ出现的概率。p(Xi, Xi+τ)表示时间序列Xi与滞后时间序列Xi+τ同时出现的联合概率25。</li>
	<li>在互信息图中识别0.140至0.240秒之间（即140至240个数据点）的第一个最小值，如图5所示。滞后时间没有精确的数值要求，主要目的是使相轨迹足够展开，以便判断其发散性。</li>
	<li>使用时间序列Xi及其由上一步通过最小化互信息所确定的滞后版本τ。</li>
	<li>确定嵌入维数。最合适的嵌入维数是虚假最近邻点（FNN）数量稳定在最小值时的最低维数（图6）26。采用Abarbanel等人提出的分析方法27,28。</li>
	<li>使用Rosenstein算法29在相空间中重构动力系统，并追踪邻近轨迹随时间的发散情况。具体可使用Merve Kizilkaya在MATLAB论坛上发布的MATLAB程序30来计算最大李雅普诺夫指数（LLE）。该程序需要以下输入参数：时间序列、吸引子的平均频率、时间延迟τ、时间序列的数据采集速率以及用于拟合发散趋势的时间区间。</li>
	<li>对9至15组数据集重复上述过程，以降低LLE估计的不确定性。对每天的LLE值取平均后，拟合Moore曲线（图7）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们通过评估不同年龄阶段秀丽隐杆线虫（C. elegans）的LLE，并结合游泳频率、互信息（MI）和虚假最近邻（FNN）等参数，对其运动模式进行分类；这些参数均可进一步揭示系统动力学特性。该系统的确定性和非线性特性通过替代数据法和递归图进行研究36。
利用差分光学衍射（DOD）来量化衰老对运动能力的影响，是对传统显微镜技术的一种补充。它并不能替代对微观生物体的直接显微观察，而是提供了一种比传统方法更一致且高效的运动行为量化手段。由于DOD无需进行视频分析，部分计算负荷由光学技术本身固有地承担，因为衍射过程可直接将强度分布映射到傅里叶空间。在衍射过程中，光场的叠加能够追踪整个微观生物体的运动。理想情况下，系统的分辨率由所用光的波长λ决定，本实验中为632 nm。即使发生小于波长的微小位移，也会引起强度的变化。因此，实际分辨率还取决于光电探测器的动态范围与分辨率以及激光器的输出功率。例如，若探测器接收到的时序信号在两个电压Vmin与Vmax之间波动，且其分辨率为n位（见实验方案第2.4步），则最大分辨能力为λ/n，即本例中为632 nm/12。理论上，该方法可应用于任何发生形变的物体；然而，DOD特别适用于微观生物体研究，因为具备合适波长的低成本激光器易于获取且经济高效。
为获得清晰且稳定的衍射图样，必须精确追踪线虫的运动，并在其游动过程中始终保持其位于激光束的中心。若线虫偏离对准位置，信号可能会退化甚至完全丢失。为减轻光电二极管饱和问题并降低随机噪声，使用中性密度滤光片来减弱激光强度。该滤光措施有助于维持光电二极管的动态范围，并防止记录的时间序列数据出现过饱和。尽管如此，任何表现出严重饱和或信噪比过低的数据段均会在最终分析中被剔除，以确保数据质量。
游泳频率的漂移会产生连续的频率谱，这是混沌现象公认的一种早期标志13平均频率与调制指数之间的负相关关系表明，大约 &#8539; 一个周期的分辨率足以精确解析轨迹，从而估计李雅普诺夫指数（LLE），类似于分析正弦波形所需的分辨率。
图6中嵌入维度3和4附近FNNs的较低百分比表明，秀丽隐杆线虫（C. elegans）的运动以及光学系统中的噪声水平均较低。然而，在12日龄的线虫中，FNNs的百分比略有增加，但仍远低于5%，这并不一定是因为真实嵌入维度的增加，而可能是由于运动信号中的噪声增强所致，这种噪声增强归因于衰老生物体中的神经退化34,37。
在整个发育过程中，最大李雅普诺夫指数（LLE）的变化表明运动中的混沌程度随年龄而变化，与摩尔方程（Moore’s equation）的预测结果高度一致。生命早期LLE出现峰值，这与r选择物种（如秀丽隐杆线虫 C. elegans）的特征相符，这类生物在缺乏亲代抚育的情况下必须迅速建立神经肌肉功能。值得注意的是，当线虫体长仅达到成体大小的20%时，已有70%的长距离神经连接形成37,38。相比之下，K选择物种（如人类）的神经系统发育较慢，依赖亲代投入，从而产生较晚出现但更为复杂的运动模式。这些差异反映在不同物种LLE峰值出现的时间上。
C. elegans 的生命周期较短，约为14天，其中在前两天内快速经历四个幼虫阶段2，这使其特别适用于研究运动行为复杂性的峰值。尽管以往的研究主要关注神经元结构的退化，以解释与年龄相关的运动变化34,39，但我们的工作将这些物理变化与系统内在的混沌动力学联系起来。将DOD与非线性动力学相结合，能够在多个空间尺度上实现精确的定量表征，为驱动行为的神经机制提供新的见解。在各个发育阶段始终为正的李雅普诺夫指数（LLE）有力地支持了运动系统中存在混沌行为的观点。
本研究为研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）中与年龄相关的行为变化提供了一种新颖的方法学框架，从而拓展了当前对运动功能衰退的生物学和动力学相关机制的理解。研究进一步验证了局部李雅普诺夫指数（LLE）作为与年龄相关的神经系统变化的敏感生物标志物的适用性，并证明LLE是反映衰老所导致运动动力学变化的一种可靠定量指标。
DOD 是一种强大的非侵入性方法，可用于量化微观生物的运动行为与混沌状态，应被视为对视频分析的补充而非替代。在当前的实验实现中，需要使用至少三天龄的线虫，因为更年轻的个体体型过小，无法产生可靠的衍射信号。从衍射图样中单一点位提取的一维时间序列必然压缩了空间信息，可能掩盖生物体局部区域的动态变化。多通道方法有助于通过验证衍射场内参数的一致性来缓解这一局限，但细微的空间异质性仍可能被忽略。对李雅普诺夫指数（LLE）的准确估计还依赖于获取足够长且无噪声的时间序列；实际操作中，如线虫移出光束或环境波动等因素可能影响数据质量，从而降低 LLE 数值的可信度。与所有实验方法一样，在 LLE 拟合过程中测量噪声及主观判断会引入额外的不确定性，单次测量的误差通常保持在约 15% 以内。
未来的工作将聚焦于在不同实验条件下测量局部李雅普诺夫指数（LLE），从而实现模型预测值与实测LLE之间的比较。这将有助于构建可预测的神经动力学模型，进一步加深我们对复杂运动控制如何随时间产生并退化的理解。我们还将通过探索其他计算方法，继续验证研究结果的一致性，例如计算熵-复杂度平面，以再次确认该生物系统的确定性特征40。

秀丽隐杆线虫（C. elegans）是一种微小的蠕虫，其运动行为已被广泛研究，以进一步理解运动神经元的连接方式，因为这种线虫神经系统结构简单，仅含有302个神经元1。C. elegans 是一种模式生物，易于培养，寿命仅为14天2。在 C. elegans 的302个神经元中，大约仅有72个参与运动功能，并分布于成虫体内的各个部位1。C. elegans 的运动维度较低（即左右摆动、前进和后退）3，使其成为追踪局部李雅普诺夫指数（LLE）变化范围的便捷实验样本。线虫的神经系统在很大程度上已被深入解析4。
视频分析通过测量曲率半径、波动频率和波长等参数，帮助量化了C. elegans的运动行为5。这些测量建立了可用于比较不同环境和各种条件下线虫运动特性的对照变量6,7。这些信息正在逐步构建出驱动C. elegans运动的神经回路模型8，甚至能够实现对线虫的虚拟和物理动态模拟9。
动态光学衍射（DOD）10 也被用于量化 C. elegans 的运动行为。在 DOD 过程中，低强度激光在活体线虫周围发生弯曲，形成一种远场衍射图样，称为夫琅禾费衍射图样。随着线虫的运动，该衍射图样的强度分布随之变化。衍射图样中的一个点是线虫体表所有点的叠加，因此衍射图样中随时间变化的强度形成一个一维时间序列，其中包含了关于运动动力学的信息11。我们重点关注从实验获得的一维时间序列中计算出的、与年龄相关的运动最大李雅普诺夫指数（LLE）。在不同发育阶段的 LLE 与其他年龄相关研究结果具有可比性，表明神经回路的功能会体现在运动模式中，这些模式可通过多种工具进行测量，例如视频分析或 DOD5。
DOD 能够在多个尺度上对时间序列进行灵敏检测，因为干涉图样可以将运动分辨到所用波长的一小部分，同时还能反映物种可塑性（形态）的大尺度变化。当系统对初始条件敏感时（例如混沌系统中，微小变化会导致轨迹呈指数级变化，即所谓的蝴蝶效应12），这一特性尤为有用。因此，必须以足够高的速率采集时间序列，以便记录微小变化，因为随着系统的演化，这些微小变化可能导致显著的差异。光电二极管（PD）采集时间序列的速度可超过许多昂贵的高速相机。衍射图样中的空间灵敏性与高数据采集速率相结合，能够捕捉混沌系统的核心特征13,14。
李雅普诺夫指数（LLE）描述了相空间轨迹的指数发散。相空间包含系统的所有可能状态，这些状态由其状态变量（或坐标）及其相应的导数（或动量）来描述15。不同的轨迹表示系统在不同初始条件下的演化过程。在混沌系统中，两条邻近的轨迹会随时间呈指数发散，这种发散程度由正的李雅普诺夫指数来量化。在物理系统中，这种发散表现为系统初始条件中不确定性的传播，同时也导致在一定时间后无法可靠地预测系统的状态，该时间由李雅普诺夫指数决定14。
在实验系统中，状态变量通常是未知的；然而，根据Takens嵌入定理16，仅通过构建某一测量变量的时间延迟版本（等效于时间导数），即可重构相空间的拓扑结构。每个时间延迟版本在某一坐标轴上表示；这些时间延迟共同构成一个滞后图，若时间序列无限长，则该滞后图在拓扑上与相图完全相同。实验获得的时间序列长度有限，因此只能估算出最大李雅普诺夫指数（LLEs），且其估计值受限于实验不确定性。
C. elegans 的运动具有正的李雅普诺夫指数（LLE10），这是混沌的指标。年轻生物体会随着年龄增长而发生运动方式的变化17。较大的 LLE 表示相比小的 LLE 具有更低的可预测性。LLE 为量化生物体的运动模式提供了一种可靠的方法10,13,14。线虫的运动特征与其体内的神经元有关18。根据 Cohen 等人19 的研究，线虫的运动依赖于运动神经元，这表明对线虫运动复杂性的研究也与其神经回路相关。
我们根据年龄校准寿命期望值（LLE），以尽量减少未来研究中的不确定性。以往的研究通常对三至六日龄的线虫进行LLE平均值分析13。本研究严密监测了线虫的年龄，以便对与衰老相关的衰退进行严谨分析。此外，已有研究通过观察运动能力的变化来识别秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的其他生物学改变18。摩尔方程（Moore's equation）用于追踪与运动能力相关的年龄参数20。本文采用摩尔方程的一个改进版本，该版本允许在评估运动机制时具有时间上的灵活性，并引入时间标记T：
<img alt="动力学分析研究中使用的生长模型方程，P(t)=a(1-e^(-b(t-T)))+c(1-e^(d(t-T)))。" src="/files/ftp_upload/68955/68955eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 1">，（1）
其中 P(t) 表示性能，t 为时间，a 和 c 表示缩放参数，而 b 和 d 分别表示指数增长和指数衰减的特征时间。摩尔方程已被证明可预测生物体衰老过程中看似无关的多种量值的变化轨迹，例如运动速度和自主活动水平。不同物种可通过摩尔方程所确定的曲线形状进行表征；例如，某些物种的性能峰值可能比其他物种出现得更早21。

<table><tbody><tr><td>2 块前表面铝镜</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>632 nm 氦氖激光器</td><td>Newport</td><td>LGX1</td><td>任何红色光源激光器</td></tr><tr><td>空培养皿</td><td>Carolina</td><td>971632</td><td>用于倒入线虫生长琼脂的塑料培养皿</td></tr><tr><td>大肠杆菌 K12，活体，噬菌体宿主</td><td>Carolina</td><td>124500</td><td>作为秀丽隐杆线虫的食物来源；OD600</td></tr><tr><td>Leica S9i 显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>LED2500</td><td>解剖显微镜</td></tr><tr><td>打火机</td><td>Bic Lighters</td><td></td><td>用于在挑取每条线虫前后对挑针进行灭菌的任意类型灭菌工具</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>由 Merve Kizilkaya 在 MATLAB 论坛上发布的 Rosenstein 算法程序</td></tr><tr><td>线虫生长琼脂</td><td>Carolina</td><td>173520</td><td>预配制培养基瓶，135 mL</td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>Thorlabs</td><td>DET36A</td><td>350–1100 nm 硅偏置探测器</td></tr><tr><td>Picoscope5204</td><td>Pico Technology</td><td>PP376</td><td>PC 示波器 www.picotech.com</td></tr><tr><td>铂金挑针</td><td></td><td></td><td>用于挑取秀丽隐杆线虫；是一种小型手工制作的挑针，带有玻璃手柄和铂金刮勺&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td>装入蒸馏水后用于放置秀丽隐杆线虫</td></tr></tbody></table>

年龄依赖性运动行为动态变化 秀丽隐杆线虫李雅普诺夫指数分析

Age-dependent Dynamics of Locomotion in Caenorhabditis elegans: A Lyapunov Exponent Analysis

本研究通过动态光衍射（DOD）技术估算最大李雅普诺夫指数（LLE），探究年龄对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）运动能力的影响。LLE是动力系统中的一个关键指标，用于量化相空间中轨迹的发散或收敛速率，反映系统动力学的可预测性与混沌程度，此处特指线虫的运动行为。波长为632 nm的激光穿过水柱中游动的线虫，产生衍射图样；光电二极管在衍射图样中的单一位置检测光信号，记录线虫波动过程中的一维时间序列。该时间序列综合表征了整条线虫的运动，由于衍射图样中任一点均为线虫各部位信号的叠加，因此能够完整反映其运动动力学特征。随后将该时间序列嵌入高维相空间以计算LLE。C. elegans的典型寿命约为14天，其运动控制能力随年龄增长呈现先增强后衰退的规律。为分离特定年龄阶段的影响，实验中每两天将线虫转移至含有E. coli的新鲜琼脂平板上，确保其处于适当的年龄范围（3至12天）。对13条C. elegans组成的群体进行分析发现，LLE在孵化后第5天达到峰值，为1.34 ± 0.03 1/s。该峰值标志着发育过程中的一个关键阶段，此时线虫的运动表现出最高的复杂性和混沌特征。所观测到的LLE值符合Moore方程——一个描述自愿活动随年龄变化的成熟模型，表明C. elegans的运动控制能力和活动水平随年龄增长而下降。

在测量LLE与年龄关系的同时，我们还测量了其他常与复杂动力系统相关的量，例如吸引子频率、互信息（MI）和最近邻点分数（FNN）。我们收集了从第3天到第12天的年龄研究数据。线虫在3天龄之前体型过小且未成熟，无法进行人工操作。到第12天时，线虫已进入衰老阶段，活动能力极弱，因其神经回路退化且神经系统功能衰退31。
Rosenstein 算法为嵌入轨迹上的每个点选择一个相邻点，其间隔至少为一个平均周期。该算法从两条邻近轨迹上两点之间的分离向量开始（图8），追踪发散程度的演化过程。由于系统的混沌特性，轨迹的分离最初呈指数增长32，随后因轨迹受限而趋于平稳。绘制平均发散度的对数随时间的变化曲线可反映轨迹的分离情况（图8 和 图9）。对曲线在变平前的初始阶段进行线性最小二乘拟合，其斜率可提供系统李雅普诺夫指数（LLE）的可靠估计值33。需要注意的是，最小二乘拟合的范围选择及拟合过程本身均存在不确定性。由于对初始条件的敏感性，当在吸引子上追踪发散程度时，线性拟合区域会表现出振荡行为。如先前一项研究所示10，不同蠕虫之间的生物学差异（各年龄组数据已取平均）远大于单次试验中线性 LLE 拟合的变异性。
时间序列（图2A）显示，峰值和谷值与蠕虫运动行为的特征相对应，例如游泳频率、形态和方向的变化。该时间序列是非周期性的；其振荡从未重复，但振幅始终保持在一定范围内。频率总体稳定，仅略有波动，表明频率具有复杂性且受边界限制。图10 显示，随着蠕虫衰老，游泳频率呈下降趋势，该趋势在第12天时瓦解。大多数蠕虫在第12天后平均频率出现跳跃。这可能是神经回路崩溃的迹象。相比之下，由互信息（MI）的第一个极小值确定的平均滞后时间τ，随着群体老化而增加，因为运动周期逐渐延长（图11）。
在本例中，互信息（MI）表示两个滞后时间序列之间的统计重叠程度。如果互信息值最小，则表明轨迹之间的重叠程度极低。理论上，混沌轨迹从不重叠；然而在实际中，由于有效数字有限以及存在一定的实验噪声，部分数据点会在一定容差范围内发生重叠24。我们通过最小化互信息来尽可能降低重叠的可能性。最小化的互信息与显著更大的互信息之间的差异如图4所示。
嵌入维数由虚假最近邻（FNNs）确定。当嵌入维数为3或4时，虚假最近邻的数量趋于平缓，且占比在5%或以下。图6显示，线虫的年龄对嵌入维数没有影响，仅在第12天例外，此时线虫已接近其寿命末期。
LLE 的变化轨迹遵循摩尔曲线（图7），在第5天达到峰值，表明秀丽隐杆线虫（C. elegans）处于新成熟阶段时，其运动行为最不可预测（可能也最复杂）。在图7中，从第3天到第12天的LLE图显示，LLE呈线性上升趋势，在第5天达到峰值，随后从第5天开始下降。图10中的误差条表示均值的标准偏差4,34，反映了包括生物物种内部多样性以及LLE估计在内的多种因素。线虫个体之间的差异往往超过LLE拟合过程中的不确定性。不同天数之间的变异（如第5天与第7天）没有重叠，因此数据具有明显可区分性。LLE随年龄变化的趋势与先前研究中提出的摩尔方程18高度吻合，该方程描述了年龄对其他生物体记忆和运动能力的影响。
表1中的LLE值具有一致性，显示出随年龄缓慢上升后下降的趋势。这些数值与先前使用DOD10和视频分析方法所得的结果一致34,35。
<img alt="HeNe laser optics diagram with steering mirrors; C. elegans cuvette; light diffraction and detection." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 1"> 
图1实验远场衍射装置示意图（未按比例绘制）。 转向镜构成一个潜望镜系统。含有比色皿的 秀丽隐杆线虫 位于导向镜之间。激光束被蠕虫衍射后射向光电探测器 通过 第二块转向镜 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示三种情况下以AU为单位的强度随时间变化的时变信号分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图2"> 
图2：强度时间序列。 DOD时间序列显示了线虫在激光束中移动时的强度波动情况，其中（A）为可用于数据分析的有效时间序列。（B）该时间序列表明，11至30秒之间的区间无有效信号，仅显示系统的噪声水平，因为较短的稳定振幅主要来源于散射光。（C）该时间序列存在少量数据饱和现象。每个数据点代表图中显著的尖峰，其峰顶和谷底被截断并拉平。在此示例中，45至50秒期间强度在-100至100 AU之间变化，尖峰出现拉平现象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示在 1 Hz 处有峰值的频谱功率图；光谱研究中的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 3"> 
图 3：功率谱。功率谱在约 0.95 Hz 处出现最大值。由于吸引子上轨迹的频率会发生偏移且从不精确重复，因此频率呈分散分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于光谱数据分析的强度变化三维图，展示各向同性和各向异性流动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 4"> 
图 4：将实验数据嵌入三维滞后图中，使用同一条9日龄线虫时间序列的两个不同滞后时间。 该时间序列表明，运动行为是一种符合混沌理论的有界吸引子。(A) 使用第一个局部最小值（MI ≈ 2.11）确定滞后时间，约为 0.183 s（183 个数据点）。轨迹交叉现象是由于将三维轨迹投影到二维空间所致。(B) 当滞后时间为不合适的 0.002 s（2 个数据点，(MI &gt; 7)）时，点之间过于密集而无法区分，未显示出发散性，因此该滞后图未能有效解析轨迹。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="互信息图；延迟 vs. 时间；数据分析结果；嵌套的详细视图插图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig5.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 5"> 
图 5：互信息的指数衰减。 互信息（MI）中的第一个极小值确定了该数据集的延迟时间为 0.161 s（161 个数据点），用于重构相空间中的相轨迹。该延迟时间用于偏移时间序列值，以在相空间中重建吸引子。延迟时间只需接近第一个极小值即可，足以分辨轨迹即可。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="FNN 与嵌入维度关系图（放大视图），多日数据对比（第3天、第5天、第9天、第12天）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig6.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 6"> 
图6：第3天、第5天、第9天和第12天的平均嵌入维度。通过放大嵌入维度视图，可清晰显示各天嵌入维度之间的具体差异。仅第12天显示出显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="LLE 与年龄关系图，显示酶活性速率随天数下降；动力学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig7.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 7"> 
图7：第3天至第12天估计的LLE平均值。 LLE在第5天达到峰值。在前5天内，线虫表现出从不成熟向成熟过渡的一致生长轨迹。5天之后，线虫的发散性开始下降。不确定性表示均值的标准偏差，主要由个体线虫之间的变异主导。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="混沌系统轨迹图，x(t) 与 x(0) 的关系，含扰动 δ(t)；数学示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig8.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 8"> 
图 8：混沌理论中发散现象的示意图。 正的李雅普诺夫指数（LLE）将导致初始相近的轨迹随时间推移而发散。t 表示时间间隔，d 表示发散程度，x(t) 表示相空间中的一个点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="对数发散图；数据分析；发散与时间关系；拟合线显示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig9.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图9"> 
图9：相轨迹在对数尺度下的发散情况。估计的李雅普诺夫指数（LLE）为上升区域线性拟合的斜率（1.08 1/s），随后由于吸引子在0.96至1.01秒之间有界而趋于平缓。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="散点图；平均频率与日龄的关系；生物生长速率的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig10.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 10"> 
图 10：每日平均均值频率。 第12天的平均值表明驱动运动的神经信号发生了显著变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="平均滞后时间与年龄的散点图，带误差线；数据趋势分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68955/68955fig11.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图11"> 
图11：每一天的平均滞后时间。 在第3至第6天期间，MI组平均滞后时间较短，而在第7至第12天期间则出现较高的平均滞后时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68955/68955fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>年龄（天）</td>
			<td>数据集数量</td>
			<td>LLE（1/s）</td>
			<td>平均值的标准偏差（1/s）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>11</td>
			<td>1.14</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>15</td>
			<td>1.20</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>13</td>
			<td>1.34</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>11</td>
			<td>1.23</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>10</td>
			<td>1.16</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>1.13</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>12</td>
			<td>1.07</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
			<td>1.00</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>9</td>
			<td>0.96</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>9</td>
			<td>0.92</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：年龄研究中每一天的数据集数量及平均LLE值。 LLE值与通过DOD收集的先前数据一致，显示出与图7中Moore曲线相似的先上升后下降的趋势。每一天收集了9至15个数据集。随着线虫年龄增长，由于肌肉退化和神经功能衰退，导致运动能力下降，数据集数量也随之减少。

本研究探讨年龄对运动功能的影响 秀丽隐杆线虫 通过测量最大李雅普诺夫指数（LLE）。随着它们老化， 秀丽隐杆线虫 表现出运动控制能力的先上升后下降。结果显示，线虫在第五天时下肢运动能力（LLE）达到峰值，随后随着年龄增长而下降。

本研究通过采用动态光衍射（Dynamic Optical Diffraction, DOD）技术，探究年龄对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）运动能力的影响。

本研究旨在表征一种微观物种的运动行为，以期更深入地理解其运动相关的神经回路。具体而言，我们已证实秀丽隐杆线虫（C.elegans）的运动具有混沌特性，且实验噪声较低。然而，实验中的混沌现象可能难以与实验噪声相区分。动态光衍射（DOD）是一种相对较新的技术。该技术在该领域尚无类似方法，且易于实施、成本效益高，并可提供多尺度数据。这种多尺度的动态信息可为所建模的神经回路提供验证依据。一旦我们构建出具有匹配动态信息的神经回路，就说明我们已经理解了该回路。未来，我们的研究将致力于探索其他可用最大李雅普诺夫指数来表征的生物量。此外，我们还将构建运动神经元的模型。首先，用移液器将0.5毫升OD600值的Escherichia coli分别加入每个线虫生长培养基琼脂平板上，以为线虫提供食物。等待Escherichia coli在每个琼脂平板表面完全干燥。从生物材料供应商处获取一份秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的对照平板，用于建立年龄同步化的线虫群体。使用本生灯，将铂金接种针在火焰中灭菌至其发橙红色光。在解剖显微镜下，用灭菌的接种针挑取5到10条成年野生型 Caenorhabditis elegans。将挑取的线虫转移至已准备好的琼脂平板上。在产卵期（4至5小时）结束后，使用铂金接种针将成虫从培养皿中移除。将剩余的培养皿进行培养，使卵发育至所需使用日期。在数据采集当天，用室温蒸馏水填充一个4.5毫升的光学级石英比色皿，液面略低于比色皿边缘，以防止溢出。使用铂金接种针轻轻将两到三条线虫转移至比色皿中。线虫放入后，将比色皿侧放，以利于线虫与激光束对齐。观察完全浸没的线虫的游动行为，它们可能会向底部漂移，但仍保持活跃状态。通过使用两面镜子构建潜望镜的改进方式搭建实验系统。将比色皿侧置于两面镜子之间，以简化线虫在激光束中的对准。不用相机，而是在衍射图样中放置一个光电探测器来收集光信号。然后，打开氦氖激光器，预热约15分钟，直至其达到热平衡状态。启动数字示波器以开始数据采集。配置示波器时，将时间间隔设为100秒，并选择至少每秒100千采样的内存缓冲区。将数据采集分辨率设置为1千赫兹。将位分辨率调整为12位，以确保对小幅度变化具有足够的灵敏度。使用示波器的自动交流偏置功能，将强度振荡的中心调整至0伏。接下来，使用灭菌的铂金挑针轻轻挑取两到三条线虫，并将其转移至装有蒸馏水的比色皿中。将含有线虫的比色皿插入潜望镜组件中，并调节装置，使其中一条线虫精确位于激光束路径中央。当秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）被准确置于激光束中时，可在潜望镜后方约50厘米处观察到远场衍射图样。当线虫穿过激光束时，将光电二极管置于远场衍射图样中。记录至少10秒的数据，以采集不少于10,000个数据点，这是准确计算最大李雅普诺夫指数所必需的。检查时间序列，识别线虫在激光束内自由游动的片段。分析时间序列以评估信噪比。通过在比色皿中无线虫的情况下记录时间序列来确定基线噪声水平。确认实验信号的幅度和特征均超过噪声水平的两倍。舍弃时间序列中包含饱和数据的任何部分。在 0.140 至 0.240 秒的时间范围内，确定互信息图中的第一个最小值。选择一个能够有效分离相轨迹的延迟值，以便进行清晰的发散度测量。使用虚假最近邻方法确定嵌入维数。选择虚假最近邻百分比稳定在最小值时的最低维数。最大李雅普诺夫指数在第5天达到峰值，随后从第6天到第12天持续下降。相邻轨迹的分离度最初呈指数增长，随后达到一个平台期，证实了系统具有有界的混沌行为。在对数分离曲线的初始阶段观察到线性斜率，从而为最大李雅普诺夫指数提供了可靠的估计值。游泳平均频率从第3天到第12天逐渐下降，在第12天时趋势出现明显中断。

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科研

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生物工程

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