通过 MALDI 方法 使用 细菌蛋白质组学分析评估乳品的微生物安全性
2025年10月7日
该协议通过将培养组学与 MALDI-TOF MS 相结合，能够快速、经济高效地评估乳制品中的微生物组成。它提供的分类结果可与 16S rRNA 测序相媲美，并且周转时间比传统培养方法更短。
我们制定了一套方法，用于制备和分离来自牛奶、奶油、黄油和奶酪等日常产品中的微生物群落。一旦分离出，该微生物可以通过MALDI-TOF多发质谱进行快速且准确的鉴定。优化培养条件仍是关键挑战，同时还面临数据库空白和对革兰氏阳性和孢子形成细菌的艰巨提取。首先，获取具有代表性的乳制品样品，并彻底搅拌以确保均匀。
无菌方式，将一毫升或一克固体样品转移到装有九毫升无菌液体培养基的15毫升锥形离心管中。用力涡旋管30到60秒以均匀化样品。接着，将一毫升均质悬浮液转移到连续的管子中，每管装有九毫升无菌溶液，制备十倍稀释液。
通过漩涡或摇晃彻底混合每种稀释液。然后，取0.1毫升原始样品或其中一种预制稀释样品，转移到含有相应琼脂培养基的培养皿表面。使用无菌撒布器，均匀地将接种物均匀分布在琼脂平板表面。
在好氧培养过程中，将准备好的样品接种APT、M17、CBL、MPCA和TSA琼脂板。在37摄氏度和30摄氏度的有氧条件下孵育板24小时。厌氧培养时，将接种的MRS琼脂平板放入厌氧舱，在37摄氏度和30摄氏度下孵育24至72小时。
将培养皿从培养箱中取出，每天检查以监测微生物生长。使用一微升微生物环，将选定的菌落划线到同一琼脂培养基上进行亚培养。在之前使用的相同条件下孵育。
对于质谱分析，首先准备MALDI基质溶液。用50%丙烯腈、47.5%高效液相色谱级水和2.5%三氯乙酸制备溶剂混合物。将基质化合物溶解到溶剂混合物中，最终浓度约为每毫升10毫克。
使用直接菌落转移法进行MS细菌鉴定，使用无菌环将一微升培养的细菌菌落转移到MALDI靶板上的某一点。将细菌物质铺开，在盘子上形成一层薄而均匀的层。干燥后，在上面加入一微升HCCA基质溶液，并在室温下自然风干。
针对靶点甲酸提取方法，使用一次性微生物环或无菌牙签，从单个菌落中提取少量细菌生物量。将材料直接涂抹在MALDI靶板上的某个点上，形成一层薄且均匀的涂层。在涂抹区域加入一微升70%甲酸溶液。
斑点干燥后，覆盖一微升HCCA基质溶液，并在室温下自然风干。采用管内蛋白提取法，将一到三个完整的菌落从琼脂培养板转移到装有300微升无菌水的1.5毫升微离心管中。加入900微升绝对乙醇，达到约75%的最终乙醇浓度。短暂混合后，在室温下以15,000克离心管两分钟。
之后，小心地丢弃上清液，不扰动细胞颗粒。然后，向干燥细胞颗粒中加入20至50微升70%甲酸。通过移液或漩涡混合内容物，直到沉淀完全重新浮出。
现在，将等量的乙腈加入蚁酸悬浮液中，充分混合。将管子以15,000克离心两分钟。将所得上清液转移至MALDI靶板指定位置，使其干燥。
然后，在干燥点上覆盖一微升HCCA基质溶液。移液器取入含有大肠杆菌DH5α提取物的细菌测试标准液或含有大肠杆菌ATCC 25922蛋白提取物、核糖核酸酶和肌红蛋白的微生物校准器。为了获取光谱和微生物鉴定，准备MALDI靶板上的校准点。
将预备的样品斑点和校准斑点装入MALDI靶板，进入质谱仪。在校准模式下运行校准分析以校准系统。在一般光谱采集时，将质谱仪以线性正离子模式作。
然后，将质谱仪的质量探测范围设置为覆盖2000到20000的质量与电荷比。为每个点收集双倍光谱，以生成每个样本至少四个技术复制。现在，应用Savitzky-Golay方法作为平滑算法。
使用TopHat算法进行基线校正以去除背景噪声。然后，使用质心模式检测峰值。将未知细菌分离株的处理质谱上传到MALDI软件中的微生物鉴定平台并执行鉴定。
根据制造商的门槛标准评估识别分数。质谱谱显示了物种特异性的蛋白质谱，使得在属或物种层面进行识别。树轮图显示同种株之间观察到高度相似，物种间有明显区分。
地衣形芽孢杆菌的潜伏时间较短为12小时，鉴定分数为2.38，而较长的18至24小时则因孢子信号占主导，鉴定分数较低为1.85。在样本制备方法中，管内蛋白提取获得最高的鉴定分数2.23，其次是靶点甲酸提取，得分为1.97，直接菌落转移得分最低，为1.61。通过结合培养组学与定制样本制备，MALDI实现了更精确、更快速的微生物组分析，成本更低，结果可与参考的16S rRNA方法媲美。
该方案使乳制品中微生物的常规高通量监测成为可能，提高了检测速度和准确性，最终强化了食品质量和安全体系。扩展MALDI数据库并自动化工业实验室的工作流程，将提升微生物识别能力，提高通量，减少错误，并加快微生物群监测速度。
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概述
本研究提出了一种快速评估乳制品中微生物组成的协议，结合了培养组学和MALDI-TOF MS进行鉴定。该方法在分类学结果上与16S rRNA测序相当，但比传统培养技术提供更快的周转时间。
关键研究组成部分
研究领域
- 微生物组成评估
- 乳制品微生物学
- 生物学中的质谱应用
背景
- 食品安全中微生物鉴定的重要性
- 与从乳制品中培养和鉴定spp.相关的挑战
- MALDI-TOF MS在微生物学中的应用
使用的方法
- 从乳制品中分离和准备微生物群落
- MALDI-TOF MS用于细菌鉴定
- 实验方法包括串联稀释和孵育
主要结果
- 成功鉴定具有高特异性的细菌
- 孵育时间比较及其对鉴定评分的影响
- 展示有效的蛋白质提取协议
结论
- 该研究说明了乳制品中微生物快速鉴定的方法。
- 这种方法对食品安全和微生物学研究有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, high-throughput microbial profiling of dairy products using MALDI-TOF MS enables food safety labs to detect and identify contaminants with greater speed and accuracy. This proteomic approach supports critical quality control inflection points, reducing risk of undetected microbial hazards in manufacturing. The method's robust, reproducible outputs strengthen enterprise-wide food safety and compliance strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microbial presence and diversity in complex dairy matrices.
- Supports functional validation of microbial safety targets through species-level identification.
- Facilitates predictive confidence in contamination risk assessment and mitigation strategies.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible workflows for microbial detection across diverse dairy products.
- Generates quantitative protein fingerprint spectra for robust assay development and benchmarking.
- Enables scalable, high-throughput screening compatible with routine quality control operations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by providing rapid, species-level microbial identification.
- Ensures continuity from discovery of contaminants to preclinical validation of food safety interventions.
- Reduces mechanistic ambiguity in microbial risk assessment for food product pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This MALDI-TOF MS protocol integrates from early microbial discovery through routine screening and translational safety validation in food industry pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microbial contamination and clarifies species-specific risks.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay readiness and cross-lab standardization.
- Analytics: Delivers high-resolution protein spectra and identification scores for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical safety validation by enabling rapid, actionable microbial profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for ongoing microbial safety monitoring across product lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial safety and reduces undetected contamination risk.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports high-throughput analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for product release and strengthens compliance with safety standards.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of quality control interventions and resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and microbial culturomics for optimal execution.
- Demands access to MALDI-TOF MS instrumentation and robust spectral databases.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Must adapt extraction and incubation parameters for different microbial and dairy matrices.
- Database gaps and challenging extraction of certain bacteria may limit identification in some cases.
