Name: 废弃物衍生生物炭对土壤健康和生物活性的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T13:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 了解废弃物衍生生物炭对土壤健康的影响，评估其对微生物活性、植物生长和无脊椎动物的生态毒性效应。本研究通过田间实验分析不同原料生物炭对土壤生态系统的长期作用。

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本研究工作由项目BIOCIRKL（注册号：TN02000044）资助，该项目在2023-2028年期间由捷克复苏计划以及捷克共和国技术局通过国家竞争力中心计划提供支持。

1. 生物炭的制备
注意：有关本实验所用生物炭测试材料的详细信息，请参见材料表。热解条件、元素组成及近似分析数据均由生产商提供（表1）。
警告：务必在通风良好并配备适当排风或通风系统的实验室中进行热解操作。佩戴耐热手套、实验服和安全护目镜；必要时还需佩戴面罩。
表1：测试生物炭的基本特性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994_Table_1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
2. 生物炭的化学表征
<ol>
	<li>利用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP OES）或电感耦合等离子体质谱法（ICP MS）分析所有生物炭的元素组成（根据微波辅助消解后的浓度进行，见表2）。</li>
</ol>
3. 土壤-生物炭混合物的制备
<ol>
	<li>土壤采集与实验设置
	<ol>
		<li>从实验田采集表层土壤。</li>
		<li>手动去除地表杂物，将土壤过筛至粒径小于5 mm，以除去残渣。</li>
		<li>称取100 g过筛后的土壤，加入试验容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物炭添加与培养
	<ol>
		<li>每100 g土壤中分别添加1 g、5 g或10 g的不同类型生物炭，制成1%、5%和10%（质量比，w/w）的土壤-生物炭混合物。</li>
		<li>加入蒸馏水，使含水量达到最大持水量（WHC）的60%。</li>
		<li>使用刮刀充分混匀。</li>
		<li>称量每个容器重量，并用封口膜覆盖以减少蒸发。</li>
		<li>在27 °C条件下培养10天。 
		注意：该混合物将用于水分损失测定、pH变化、植物毒性以及细菌定量分析。 
		使用过的土壤应根据当地生物固体处理规范进行收集和处置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 土壤-生物炭混合物的pH值测定
<ol>
	<li>称取10 g土壤-生物炭混合物，分别放入50 mL锥形管中。</li>
	<li>向各管中加入25 mL蒸馏水。</li>
	<li>手动振荡30秒，或使用涡旋混合器以中等速度振荡。用Whatman No. 1滤纸将混合液过滤至洁净的100 mL烧杯中。</li>
	<li>使用校准后的pH计在室温（20–25 °C）下测定滤液的pH值。</li>
</ol>
5. Enchytraeus albidus 毒性试验
<ol>
	<li>按照经济合作与发展组织（OECD）2016年发布的测试指南第220号16进行实验。</li>
	<li>测试用土壤的制备
	<ol>
		<li>本实验使用OECD人工土壤。</li>
		<li>按照第4节所述步骤测定土壤pH值。</li>
		<li>逐步加入分析纯碳酸钙（CaCO3）并充分混匀，将土壤pH值调节至6.0 ± 0.5。</li>
		<li>通过加入蒸馏水或去离子水，将土壤含水量调节至最大持水容量（WHC）的40–60%。 
		注：用手检查土壤状态；土壤应湿润但不结块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蚯蚓的适应性培养与筛选
	<ol>
		<li>用蒸馏水轻轻冲洗蚯蚓，以去除运输过程中使用的生理盐水溶液。</li>
		<li>将蚯蚓置于已准备好的OECD土壤中，在20 °C、16小时光照/8小时黑暗循环、光照强度6,000 lux条件下适应24小时。</li>
		<li>根据环带的存在情况，在体视显微镜下挑选每组15条健康成年蚯蚓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验设置与培养
	<ol>
		<li>在洁净容器中，将100 g已准备好的OECD土壤与5 g每种类型的生物炭充分混合。</li>
		<li>使用100 g未添加生物炭的OECD土壤作为对照组。</li>
		<li>确认pH值和含水量处于规定范围内（pH值：6.0 ± 0.5；含水量：最大WHC的40–60%）。</li>
		<li>使用尖端柔软的镊子，向每个处理组和对照组容器中放入15条成年蚯蚓。</li>
		<li>在土壤表面添加25 mg精细研磨的燕麦片作为食物来源。</li>
		<li>用带孔的铝箔覆盖容器，以允许空气交换。</li>
		<li>将容器置于20 °C、16小时光照/8小时黑暗循环、光照强度6,000 lux条件下培养5天。</li>
		<li>每天称量容器重量，并通过加入适量蒸馏水或去离子水补充失重，以维持恒定的含水量。</li>
		<li>观察蚯蚓活动情况，并记录测试期间任何可见的死亡现象。</li>
		<li>测试结束后，使用以下公式计算致死效应（%）： 
		<img alt="致死效应公式，致死效应 (%) = (Wi - Wf) / Wi × 100，教学用方程。" src="/files/ftp_upload/68994/68994eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 1"> 
		其中： 
		Wi — 测试开始时的初始蚯蚓数量 
		Wf — 测试结束时的最终蚯蚓数量 
		​注：为保证测试有效性，对照组中成年蚯蚓的死亡率在测试结束时不得超过20%。</li>
		<li>测试结束后，将测试土壤在105 °C下烘干以灭活，然后按照当地生物固体处理规程进行处置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 植物毒性试验
<ol>
	<li>根据国际标准化组织（ISO）18763:2016标准进行测试17。</li>
	<li>培养皿设置
	<ol>
		<li>将20 g经培养的土壤-生物炭混合物加入到9 cm的洁净培养皿中。用洁净的刮刀轻轻压平表面。</li>
		<li>每种生物炭浓度设置三个重复，并设置两个未添加生物炭的对照组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>种子播种与培养
	<ol>
		<li>在每个培养皿的土壤表面均匀放置10粒 Sinapis alba 种子。 
		注意：不要将种子压入土壤中；让种子在湿润条件下自然贴附。</li>
		<li>用培养皿盖盖好，置于25 °C ± 2 °C的培养箱中避光培养5天。</li>
		<li>培养结束后，使用塑料直尺测量从种子边缘到根尖的根长，以cm或mm表示。若种子仅开裂而未生根，记为0.1 cm或1 mm。</li>
		<li>使用以下公式计算抑制率（%）： 
		<img alt="抑制率计算公式示意图，RLc与RLt的比较，化学分析中的百分比计算。" src="/files/ftp_upload/68994/68994eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式2"> 
		其中： 
		RLc — 对照组培养皿中种子的平均根长 
		RLt — 测试组培养皿中种子的平均根长 
		注意：为确保测试有效，需确认对照组种子的发芽率至少达到80%（10粒种子中至少有8粒发芽）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 细菌菌落定量
<ol>
	<li>土壤悬液制备与稀释
	<ol>
		<li>称取5 g经培养的土壤-生物炭混合物，分别加入50 mL无菌锥形管中。</li>
		<li>加入25 mL无菌蒸馏水，充分振荡30秒。</li>
		<li>室温下静置2小时，使悬液均匀混合。</li>
		<li>使用无菌纱布或滤网过滤悬液，并以此原液制备系列稀释液。</li>
		<li>准备5支试管，每管含9 mL无菌蒸馏水。</li>
		<li>使用无菌移液器进行10倍系列稀释，例如，从原液中取1 mL加入第一支试管得10-1，再从中取1 mL加入下一支试管得10-2，依此类推。</li>
		<li>使用10-2稀释度进行涂布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>涂布与菌落计数
	<ol>
		<li>取0.2 mL的10-2稀释液滴加于无菌营养琼脂平板上。</li>
		<li>使用灭菌涂布棒将样品均匀涂布。</li>
		<li>将平板倒置于27 °C培养箱中培养24小时。</li>
		<li>使用菌落计数器对菌落进行计数。</li>
		<li>使用以下公式计算混合物中的菌落形成单位（CFU）mL-1： 
		<img alt="菌落形成单位计算公式：用于微生物分析的CFU/mL计算公式。" src="/files/ftp_upload/68994/68994eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式3"> 
		注意：如有条件，应在生物安全柜中操作。每次更换样品时，需将工具在火焰上灭菌以避免交叉污染。 
		废弃前，所有平板均需用70%乙醇消毒或经高压灭菌处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 干物质（DM）的测定
注意：处理高温容器时请使用耐热手套。
<ol>
	<li>称取10 g土壤样品放入耐热的玻璃或瓷皿中。</li>
	<li>将皿放入已预热至105 °C的烘箱中，干燥2 h。</li>
	<li>干燥后，将皿转移至干燥器中，冷却10 min，以防止样品从空气中吸收水分。</li>
	<li>使用分析天平再次称量冷却后的皿重。</li>
	<li>至少重复该操作三次，以确保结果的准确性。</li>
	<li>使用以下公式计算干物质（DM）含量： 
	<img alt="干物质计算公式，DM(%)=Md/Mw×100，方程。" src="/files/ftp_upload/68994/68994eq4.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 4"> 
	其中： 
	DM — 干物质含量（%） 
	Md — 干燥后样品质量，单位为g 
	Mw — 未干燥（原始）样品质量，单位为g</li>
</ol>
9. 脱氢酶活性（DHA）检测
<ol>
	<li>按照标准协议（ISO 23753-1:2019）18进行测试。</li>
	<li>试剂制备
	<ol>
		<li>TRIS缓冲液（100 mmol/L，pH 7.6）。
		<ol>
			<li>将12.12 g三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）溶解于800 mL蒸馏水中。</li>
			<li>用1 M盐酸（HCl）调节pH至7.6。</li>
			<li>用蒸馏水定容至1 L。</li>
			<li>4 °C保存，并在一周内使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>TTC底物溶液（300 mmol/L）
		<ol>
			<li>将1 g TTC溶解于10 mL已配制的Tris缓冲液中。</li>
			<li>避光、4 °C保存，并在1周内使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备用于标准曲线的TPF标准溶液：
		<ol>
			<li>将100 mg TPF加入10 mL 96%乙醇中，搅拌至完全溶解，得到TPF储备液（33 mmol/L）。</li>
			<li>取0.5 mL已配制的TPF储备液，用乙醇稀释至50 mL，得到TPF工作液（330 nmol/mL）。</li>
			<li>从工作液中分别取0、0.1、0.2、0.5和1.0 mL，用乙醇定容至3 mL，制备成系列工作标准溶液。</li>
			<li>在485 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>将5 g每种土壤-生物炭混合物加入50 mL锥形管中。</li>
		<li>在测试组中加入4 mL Tris缓冲液（100 mmol/L，pH 7.6）和1 mL TTC溶液。</li>
		<li>在对照组中仅加入4 mL Tris缓冲液。</li>
		<li>轻轻翻转混匀各管，在25 °C避光条件下孵育6 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲臜提取
	<ol>
		<li>孵育结束后，向每管加入25 mL乙醇。</li>
		<li>将样品置于避光条件下，25 °C、250 min-1振荡1 h。</li>
		<li>振荡结束后，向对照管中加入1 mL TTC。</li>
		<li>所有试管在25 °C下以2,000 × g离心5 min，分离上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定与计算
	<ol>
		<li>将上清液转移至洁净比色皿中。</li>
		<li>使用分光光度计在485 nm处测定吸光度。</li>
		<li>利用标准曲线确定样品中TPF的浓度（nmol/L）。</li>
		<li>使用以下公式计算脱氢酶活性： 
		<img alt="静态平衡方程 A=((Cs-Cb)×V)/(m×DM×RT)；热力学分析。" src="/files/ftp_upload/68994/68994eq5.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式5"> 
		其中： 
		A — 干土中酶活性，单位为mU g-1（或nmol min-1 g-1） 
		Cs — 测试样品中TPF浓度，单位为nmol mL-1 
		Cb — 对照样品中TPF浓度，单位为nmol mL-1 
		V — 总反应体积（底物、缓冲液和乙醇体积之和，单位为mL） 
		RT — 反应时间（单位为分钟） 
		M — 每管土壤质量（单位为g） 
		DM — 土壤干物质含量（%） 
		注意：TTC和TPF可能具有致突变性，操作时应佩戴手套。配制含乙醇试剂时应在通风橱中进行。 
		测试完成后，将含乙醇和TTC的废弃物置于指定的化学废液容器中处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="生物炭原料工作流程图，包含土壤测试、pH 测定、植物毒性及分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68994/68994fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验工作流程示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

土壤与废弃咖啡渣生物炭的混合物呈强碱性，pH值为8.94，与先前报道的pH值9.4一致19。与对照样品相比，该生物炭的重量损失增幅最大，表明其持水能力较低，这可能是由于其比表面积较小，限制了水分吸附倾向20,21。这些物理特性为E. albidus创造了不利的生存环境，导致其存活率和繁殖率受到20%的抑制。
S. alba 在植物毒性测试中，在 1% w/w 浓度下表现出 79.16% 的促进作用，而在较高浓度下（如 5% w/w），生物炭使根伸长受到 47.08% 的抑制。这与已有报道一致22，即咖啡渣生物炭对 Lactuca sativa 的植物毒性是由羧酸引起的。此外，研究显示可溶性酚类和羧酸也会干扰生长素的运输，从而导致植物毒性的阈值23。
随着咖啡生物炭浓度的增加，细菌菌落数量也随之增加（在10% w/w浓度下为1.50 × 10-5 CFU/mL），表明该生物炭为可培养细菌提供了有利的生长条件。咖啡生物炭还表现出最高的脱氢酶活性（3.53 × 10-3 mU/g），说明其对可培养和不可培养的微生物种群均有促进作用。此前的研究24观察到咖啡生物炭对土壤酶活性具有积极影响，进一步支持了这一结论。
啤酒花生物炭导致土壤碱性增加，并表现出中等程度的平均重量损失（10%）。在植物毒性试验中，该生物炭对根系伸长具有促进作用，尤其在较高浓度下效果显著（促进率达162.96%）。就微生物活性而言，啤酒花生物炭对细菌数量未引起显著变化（最高达1.00 × 10-5 CFU/mL），这可能与其化学组成的平衡性有关。尽管啤酒花生物炭含有最高浓度的铜（Cu），而铜可通过抑制细菌酶系统对微生物产生毒性25，但其同时也含有较高水平的钾（K）和磷（P）等元素，这些元素可通过促进幼苗叶绿素合成来支持微生物生长26。DHA活性也反映了这种中性效应，表明其生物学影响有限，响应稳定。
随着时间推移，烟头生物炭导致土壤碱性逐渐升高（最高达pH 9.48）。该生物炭在较高的热解温度（700 °C）下制备，因而呈更强的碱性，有利于细菌生长。这一观察结果与先前的研究一致27，这些研究指出生物炭可改善土壤pH值，从而优化栖息环境条件。在所有处理中，烟头生物炭保持了最高的含水量（高达94%），这可能解释了其对E. albidus存活和繁殖的促进作用。高持水能力可能与700 °C下发生的微观结构变化有关，该条件形成了可截留水膜的微孔结构28。促进效应的另一个原因可能是烟头生物炭中含有较高含量的钙（Ca）、磷（P）和钾（K），这些元素对蚯蚓的生存和繁殖具有积极作用。
在微生物评估中，香烟滤嘴的生物炭在较高浓度下表现出最强的细菌刺激作用，达到约1.00 × 10-6 CFU/mL，而DHA活性则未显示出同等程度的增加。该结果提示，生物炭对可培养细菌具有选择性刺激作用，而非对整个微生物群落产生普遍促进。
土壤与云杉木炭的混合物仅导致pH值轻微上升，这一现象也见于其他研究29，其中报道了源自针叶树的生物炭pH值为7.87。该生物炭的制备温度是本研究中所用所有生物炭中最低的（600 °C）。与其他类型的生物炭相比，其持水能力中等，因其未表现出极端的重量损失。
然而，在Eisenia foetida的存活与繁殖方面，云杉木生物炭表现出最高的毒性（致死效应达53%）。可能的原因之一是铝（Al）、铁（Fe）和锰（Mn）等元素含量升高，这些元素对蚯蚓具有毒性，会干扰其肠道pH调节并引发氧化应激30。类似的研究发现，在因过度使用农用化学品导致土壤重金属毒性的条件下，Eisenia foetida的生物量显著下降31。
在植物毒性试验中，云杉木炭对根系伸长的促进作用最为显著（最高可达206%的促进率）。这表明，与蚯蚓的敏感性不同，高浓度的金属元素可作为白柳（S. alba）等植物必需的微量营养元素。该生物炭在低浓度下可促进细菌菌落生长；然而，随着浓度升高，菌落数量则下降。这一效应表明细菌对低水平的钾（K）和磷（P）以及高含量的有毒元素（如铝、铁、锰）具有敏感性。该观察结果与所测得的脱氢酶活性（DHA）一致：其活性低于对照土壤，可能归因于较低的氢碳比（H/C），导致碳源无法被有效利用32。这些发现表明，云杉木炭由于营养成分匮乏或含有抑制性化合物，不利于微生物的生长。
生物炭作为测试材料来自外部实验室，并由各供应商在其常规条件下制备，其中包括不同的热解温度。我们的目标是评估直接提供的、源自废弃物的代表性生物炭，而非在不同原料之间单独分离温度的影响；因此，在本研究中无法完全区分温度效应与原料效应。供应商未提供详细的制备参数，如升温速率、气体氛围和停留时间；仅报告了所提供的温度和元素特性（见表1和表2）。
根据本研究的结果，可以得出结论：啤酒花生物炭总体上具有较为均衡的效果，且对环境的副作用适中。它在所有浓度下均能促进植物生长，引起中等程度的pH值变化和具有中等的持水能力，此外，与其他测试的生物炭相比，对土壤微生物和蚯蚓的影响较小。
这些结果表明，选择合适的生物炭类型及其适宜的施用浓度对于土壤改良至关重要，以确保切实改善土壤质量和促进植物生长，同时避免产生负面副作用。
该实验方案中的多个步骤，包括热解温度和生物炭施用量，对该研究的结果产生了显著影响。较高的热解温度导致生物炭碱性增强，并促进了蚯蚓繁殖和细菌生长，香烟滤嘴来源的生物炭即表现出此效应。相比之下，较低的热解温度产生的生物炭碱性较弱，与蚯蚓毒性最高及微生物活性降低相关，例如云杉木屑来源的生物炭即属此类情况。施用量的影响取决于生物炭类型及所测试的生物体。咖啡渣生物炭在低浓度下对根系伸长具有促进作用，并表现出较高的脱氢酶活性（DHA），而香烟滤嘴生物炭在高浓度下则导致可培养细菌生长最为显著。
在研究方法上进行了某些调整，以解决诸如菌落数量不一致等常见问题。这些调整包括将土壤悬浮液均质化2小时，并采用10-2梯度稀释，以获得最佳且可比的菌落数量。此外，经济合作与发展组织（OECD）指南测试编号220旨在评估受试化学品对线蚓科蠕虫的影响。该指南建议根据预试验中测试的一系列化学浓度，计算半致死浓度（LC50）。在本研究中，目的是评估废弃物衍生生物炭对蠕虫存活和繁殖的整体毒性效应；因此，致死效应通过测试开始至结束时蠕虫数量的百分比变化来确定，并以“致死效应%”表示。
该方案在实验室条件下和小规模（例如100 g样品）时具有可重复性。然而，扩大土壤体积可能导致结果差异。可通过土壤与所用生物炭的充分机械混合，以及采用可控的灌溉系统以维持恒定的湿度水平，来控制此类差异。此外，生物炭的效果随原料类型和热解温度变化显著，提示未来研究应在应用前对每种材料进行单独表征。
该方案与其他土壤健康评估技术的不同之处在于，它结合了pH值、持水能力等理化参数，以及土壤添加不同类型生物炭后的生物学响应。通过将酶活性分析与传统的微生物菌落计数相结合，可深入了解不可培养微生物的功能。此外，本研究基于多种原料来源的生物炭在不同浓度下的表现，为实际应用中的土壤改良策略提供了实践指导意义。
未来的研究可能涉及测试其他原料，如粪肥、稻壳或污水污泥，以比较它们对土壤生态系统的影响。长期田间试验也可进行调整，以评估季节性影响和作物产量结果。本研究表明，来源于废弃物的生物炭对土壤健康的影响具有原料类型和浓度依赖性。某些生物炭促进了微生物活性和植物生长，而其他生物炭则对土壤生物产生抑制或毒性反应。在土壤管理中，选择合适的生物炭类型和施用剂量对于最大化效益并最小化风险至关重要。

近年来，生物炭作为一种多功能且环境友好的土壤改良剂，已被应用于农业1，并成为缓解全球变暖的一种手段2。在全球面临土地退化、作物生产力下降以及碳排放增加的背景下，生物炭已成为传统肥料3和碳封存方法4的一种绿色替代方案。与合成肥料相比，生物炭能够从根本上提高土壤肥力5，减少养分流失6，并增强土壤持水能力7，因此在土壤退化或贫瘠地区具有重要应用价值。此外，生物炭通过为有益土壤微生物提供稳定的栖息环境和碳源，增强了微生物功能，而这些微生物在有机质分解和养分循环过程中起着关键作用8。
除了农业之外，生物炭还可作为废弃物处理的绿色解决方案，因为它能将农业废弃物、林业废弃物和食物垃圾等生物质残留物转化为长期稳定的碳材料9。这不仅限制了废弃物的积累，还通过固定原本会以二氧化碳（CO2）或甲烷（CH4）形式释放的碳，从而抵消温室气体排放。与其他碳封存方式相比，生物炭提供了一种长期、综合的土壤管理策略，可减少大气中的CO2&#160;，同时促进土壤健康并提高作物产量10。
尽管生物炭具有公认的益处——例如提高土壤肥力、增强持水能力以及促进微生物活性——但人们仍持续关注其对土壤生物可能产生的生态毒理学影响11。虽然生物炭通常对微生物活性和多样性具有积极作用，但某些原料或加工条件可能产生有毒化合物，从而损害土壤微生物及其生态功能12。
为了评估生物炭的潜在风险，有必要进行生态毒理学评价。在土壤和沉积物生态毒理学研究中，常选用细菌（分解者）、植物（生产者）和无脊椎动物（消费者）等分类群。这些类群代表了陆生和水生两种环境13。
在土壤生态系统功能中，线蚓与蚯蚓的互补作用是为这些生物开发生物测定方法的基础。在生物测定中，线蚓作为陆生生物学模型，用于研究农药（如敌百虫、阿特拉津、多菌灵）和痕量金属（如铅、锌、铜、镉）等化学物质的影响14。
除了基于生物体的检测方法外，微生物酶活性也是评估土壤健康状况的另一种方式。土壤脱氢酶活性是微生物氧化活性的指标15。在土壤-生物炭混合物中进行脱氢酶检测，可有效量化微生物活性及整体土壤健康状况。由于脱氢酶参与微生物呼吸过程，其活性反映了土壤生物活性的程度。该方法可用于评估土壤质量、肥力以及生物炭对微生物的影响。该检测通过分光光度法测定三苯基四氮唑氯盐（TTC）还原为三苯基甲臜（TPF）的过程。TPF生成量越高，表明微生物活性越高。
我们预计，由不同原料制备的生物炭将对土壤健康产生不同的影响。这些影响取决于生物炭的化学和物理特性，这些特性可能改变土壤的理化参数，从而影响微生物活性、植物生长以及土壤生物的毒性。
本研究评估了来源于废弃物的生物炭对多种土壤健康指标的影响，包括pH值、微生物活性、植物生长以及无脊椎动物存活率（图1）。将四种不同来源的废弃物生物炭以三个浓度（1%、5%、10% w/w）与园艺土壤混合，并评估上述各项指标的影响。通过严格控制水分含量、pH值以及测试生物的选择，以确保研究具有生态相关性。

<table><tbody><tr><td>1,3,5-三苯基四氮唑甲臜</td><td>Sigma-Aldrich, 捷克共和国</td><td>93145</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基四氮唑氯化物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 捷克共和国</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器 CertoClav Classic</td><td>CertoClav, 奥地利</td><td>8510174</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钙&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 捷克共和国</td><td>239216</td><td></td></tr><tr><td>离心机 MPW-251</td><td>MPW Med. Instrument, 波兰</td><td>10251</td><td></td></tr><tr><td>香烟滤嘴生物炭</td><td>德国霍恩海姆大学</td><td></td><td>在 700 &amp;deg;C&amp;nbsp;下制备</td></tr><tr><td>菌落计数器 CC-200</td><td>Cole-Parmer</td><td>14212-04</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Enchytraeus albidus&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>INVITAL aqua s.r.o.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Penta, 捷克共和国</td><td>70390-11003</td><td></td></tr><tr><td>啤酒花生物质生物炭</td><td>捷克共和国科学院实验室</td><td></td><td>在 650 &amp;deg;C&amp;nbsp;下制备</td></tr><tr><td>培养箱 Q-cell</td><td>Pol-Lab, 波兰</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波消解仪</td><td>安东帕, Multiwave PRO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>笔记本电脑 DELL Latitude 3510</td><td>Dell Products, 爱尔兰</td><td></td><td></td></tr><tr><td>营养琼脂培养基&amp;nbsp;</td><td>OXOID, 捷克共和国</td><td>CM0003B</td><td></td></tr><tr><td>OECD 土壤&amp;nbsp;</td><td>Microbiotest, 比利时</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计 WTW inoLab pH 7110&amp;nbsp;</td><td>Xylem Analytics, 德国</td><td>1AA112</td><td></td></tr><tr><td>白芥子种子&amp;nbsp;</td><td>Microbiotest, 比利时</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计 M4</td><td>VWR</td><td>76520-716</td><td></td></tr><tr><td>废弃咖啡渣生物炭</td><td>捷克共和国科学院实验室</td><td></td><td>在 650 &amp;deg;C&amp;nbsp;下制备</td></tr><tr><td>云杉木生物炭</td><td>Olesnice, 捷克共和国</td><td></td><td>在 600 &amp;deg;C&amp;nbsp;下制备</td></tr><tr><td>体视显微镜 MSZ5000-T-IL-TL</td><td>A.Kruss Optronic, 德国</td><td>MSZ5000-T-IL-TL</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, 捷克共和国</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>视频目镜 VOPC93 USB 2.0</td><td>A.Kruss Optronic, 德国</td><td>&amp;nbsp;VOPC93</td><td></td></tr><tr><td>电子天平 KERN EMB&amp;nbsp;</td><td>KERN, 德国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

评估废弃物衍生生物炭对土壤健康与生物活性的影响

Assessment of Waste-Derived Biochars on the Health and Biological Activity of Soil

生物炭是通过高温热解生物质所获得的产物，因其在改善土壤持水性、pH值和养分有效性等方面的潜力，已成为一种常见的土壤改良剂。然而，由某些废弃物制备的生物炭可能对土壤生物产生负面的生态毒理学效应。本研究的总体目标是评估来源于咖啡渣、废弃酒花、云杉木屑和烟蒂的几种选定生物炭对土壤健康的影响，重点关注微生物活性、植物生长以及潜在的生态毒性。将添加生物炭的土壤培养15天，并进行一系列测定，包括脱氢酶活性、细菌数量测定、利用白芥（Sinapis alba）种子进行的植物毒性生物测定，以及利用白色长足蚓（Enchytraeus albidus）进行的生态毒性测试。生物炭的添加可改变土壤pH值并影响持水能力。烟蒂生物炭对细菌菌落的促进作用最为显著，菌落数量高达1.00 × 106 CFU/mL，而对照组仅为8.47 × 104 CFU/mL；相比之下，咖啡渣生物炭提高了脱氢酶活性（3.53 × 10-3 mU/g），表明其具有更高的微生物代谢能力。植物毒性试验表明，酒花生物炭（促进162.96%）和云杉木生物炭（促进206.66%）可促进植物生长，而高施用量的烟蒂生物炭则抑制了幼苗生长（抑制率达62.36%）。利用白色长足蚓（Enchytraeus albidus）进行的生态毒性测试显示，除烟蒂生物炭外（促进33%），所有其他生物炭均对测试生物产生不利影响。本研究结果表明，生物炭对土壤健康的影响具有原料来源依赖性，这对土壤管理具有重要意义。研究揭示了需根据生物炭的种类和施用量调整其应用方式，以最大化其效益并最小化对土壤系统的潜在危害。

化学表征 
生物炭在元素组成上表现出显著差异（表2）。钙（Ca）和钾（K）在烟头生物炭和废啤酒花生物炭中含量最高。云杉木生物炭的铝（Al）和铁（Fe）含量最高。铜（Cu）和镁（Mg）在废啤酒花生物炭中显著富集。铅（Pb）、镉（Cd）及其他痕量金属在所有样品中均仅以少量存在。
表2：生物炭的化学组成。 本研究中所用不同生物炭的主要元素含量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994_Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
培养期间 pH 值的变化 
在所有处理中，土壤-生物炭混合物的 pH 值随时间呈轻微上升趋势（图 2）。其中，10% w/w 的烟头生物炭混合物在第 15 天达到最高 pH 值，为 9.48，该处理随时间的增幅最大。咖啡渣生物炭也表现出逐渐升高趋势，在第 15 天 10% w/w 条件下 pH 值最高达 8.94。酒花生物炭使 pH 值提高了 16.57%，在 10% w/w 条件下最高达 9.20。相比之下，云杉木生物炭混合物在 10% w/w 条件下的 pH 值为 8.56。对照组的 pH 值最低，范围为 6.57 至 7.66，且随时间变化极小。
<img alt="堆肥pH变化柱状图；第0、10、15天；咖啡渣、啤酒花、香烟残余、云杉、对照组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68994/68994fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图2"> 
图2：土壤-生物炭混合物中pH随时间的变化。在第0、10和15天测定每种生物炭在1%、5%和10%（w/w）添加量下的土壤pH值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994fig2largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
持水能力与重量损失 
所有类型生物炭的持水能力均低于未添加生物炭的对照土壤（图3）。对照组在15天内重量减少了3.67%，表明其持水能力最高。在各类生物炭中，烟头生物炭的水分损失最少，在培养期间重量减少了5.89%，因此在所有生物炭中持水能力最强。啤酒花生物炭表现出类似但较温和的趋势（总重量损失为9.22%，且在较高浓度下损失更大）。咖啡渣生物炭的重量损失最大（最高达16.56%），表明其持水能力最低。云杉木混合物平均重量损失为10.22%。
<img alt="分解速率柱状图：咖啡渣、啤酒花、烟头、云杉木、对照组在15天内的变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68994/68994fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：培养期间土壤-生物炭混合物的重量损失。 所有生物炭及其浓度在15天内的重量变化，作为持水性的指标。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994fig3largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
E. albidus 毒性与繁殖试验 
在5% w/w 生物炭条件下，E. albidus 的繁殖表现出显著的原料依赖性。在OECD土壤对照组中，种群数量从15条增加到24条（增长60%，图4）。云杉木生物炭组仅存活7条（抑制率53%，图5）。啤酒花和咖啡渣生物炭组各存活12条（抑制率20%，图5）。香烟滤嘴生物炭则促进繁殖，总个体数达20条（含子代），繁殖率提高33%。
<img alt="线虫种群数量比较柱状图；不同基质中初始与最终数量：咖啡渣、啤酒花、烟头。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68994/68994fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 4"> 
图 4：生物炭处理土壤中 E. albidus 的净种群变化。 处理5天后的初始与最终线虫数量。每种生物炭的测试浓度为5% w/w。数据表示为均值±标准差（n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994fig4largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="致死效应百分比，柱状图；咖啡渣、啤酒花、烟头、云杉木、对照组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68994/68994fig5.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 5"> 
图 5：E. albidus 的毒性或刺激效应。与对照组相比，对蚯蚓的净效应。正值表示抑制作用；负值表示刺激作用。数据表示为平均值 ± 标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994fig5largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
植物毒性 
在1%、5%和10%（w/w）条件下，于培养10天后测量了S. alba的根伸长长度（图6）。在未添加生物炭的土壤中，平均根长为237 mm。1%（w/w）的咖啡渣生物炭处理使根长促进79.16%；更高浓度则导致抑制作用，在5%（w/w）时抑制率达47.08%。云杉木生物炭在所有浓度下均促进根的生长，其中10%（w/w）时促进效果最高，达206.66%。香烟滤嘴生物炭在1%（w/w）时促进生长41.01%，但在5%和10%（w/w）时抑制生长，其中10%（w/w）时抑制率达62.36%。啤酒花生物炭在所有浓度下均促进生长，分别在1%、5%和10%（w/w）时促进率分别为38.97%、31.75%和162.96%。
<img alt="抑制率（%）图；不同底物；咖啡渣、酒花、烟头、云杉木屑的分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68994/68994fig6.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 6"> 
图 6：生物炭对 Sinapis alba 的植物毒性效应。 在所有生物炭处理条件下培养 10 天后，相对于对照组的根系生长抑制或促进情况。正值表示抑制，负值表示促进。数据表示为平均值 ± 标准偏差（n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994fig6largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
细菌菌落定量 
在培养10天后进行细菌菌落计数评估（图7）。对照组平均为 8.47 × 104 CFU/mL。咖啡生物炭在1% w/w时为 7.33 × 104 CFU/mL，在5%和10% w/w时分别增加至 1.18 × 105 和 1.50 × 105 CFU/mL。云杉木生物炭在1% w/w时达到 1.97 × 105 CFU/mL，但在5%和10% w/w时分别下降至 9.73 × 104 和 4.93 × 104 CFU/mL。烟头生物炭在1% w/w时产生 5.40 × 104 CFU/mL，在10% w/w时刺激效果最强，达到 1.00 × 106 CFU/mL。啤酒花生物炭在所有浓度下均表现出轻微刺激作用，在5% w/w时达到峰值，为 1.07 × 105 CFU/mL。
<img alt="细菌生长柱状图；咖啡渣、啤酒花、烟头、云杉木、对照组；CFU/mL；1%-10% w/w。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68994/68994fig7.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 7"> 
图 7：经生物炭处理土壤中的细菌生长情况。 所有处理组及浓度在培养10天后的细菌CFU/mL。包含对照组用于比较。数据表示为平均值 ± 标准差（n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994fig7largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
脱氢酶活性 
咖啡渣生物炭在不同浓度下均表现出最高的脱氢酶活性，在1% w/w时达到峰值（3.53 × 10-3 mU/g），在5%和10% w/w时仍保持相近水平（分别为2.38 × 10-3 和 2.62 × 10-3 mU/g）（见图8）。啤酒花生物炭在1% w/w时活性增强（2.39 × 10-3 mU/g），但在5%时下降至（6.34 × 10-4 mU/g），在10% w/w时变为负值（−8.30 × 10-4 mU/g）。烟蒂生物炭在1% w/w时为正值（1.29 × 10-3 mU/g），在5%和10% w/w时分别降低至−7.26 × 10-4 和−8.53 × 10-4 mU/g。云杉木生物炭在所有浓度下均为负值（1%和5% w/w时分别为−5.53 × 10-4 和−5.19 × 10-4 mU/g；10% w/w时为−3.11 × 10-4 mU/g），且始终低于对照组。
<img alt="比较1%、5%和10%浓度下废弃物中DHA活性的柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68994/68994fig8.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图8"> 
图8：添加生物炭土壤中的脱氢酶活性。 各类生物炭及其不同浓度下的微生物酶活性。数值以未添加生物炭的对照土壤为基准进行相对比较。正值表示酶活性高于对照，负值表示酶活性低于对照。数据表示为平均值 ± 标准差（n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994fig8largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
结果摘要见表3和表4。
表3：生物炭对土壤pH值和持水能力的影响。显示培养期间的初始和最终pH值、ΔpH以及水分损失百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994_Table_3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：生物学效应和DHA结果汇总。 所有处理组在蠕虫繁殖、植物毒性、微生物数量和酶活性方面的综合数据。<img alt="向上的箭头符号；用于矢量分析或在图表中表示增加" src="/files/ftp_upload/68994/68994eq6.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Equation 6"> 表示促进作用，<img alt="静态平衡；ΣFx=0；示意图；力平衡；平衡分析；矢量力；物理学研究" src="/files/ftp_upload/68994/68994eq7.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Equation 7"> 表示抑制作用。对于DHA结果，正值表示酶活性高于对照组，负值表示酶活性低于对照组。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68994/68994_Table%204.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
数据可用性： 
数据将上传至公共存储库：DOI/URL： https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30128803.v1

本文评估了由咖啡渣、废弃酒花、云杉木和烟头等废弃物制备的生物炭对土壤健康的影响，检测了微生物活性、植物生长以及对无脊椎动物的潜在生态毒性。

生物炭是通过高温热解生物质获得的产物，因其……而成为一种常见的土壤改良剂

我们研究不同类型的生物炭对土壤的影响。通过测试其对微生物、植物和无脊椎动物的作用，来了解其益处和潜在风险。当前的研究重点是来自不同制备方法的生物炭，并开展超越标准实验室测试的长期田间试验。目前存在多种技术，例如用于微生物的DNA测序、土壤结构成像，以及用于监测土壤中气体、水分和养分含量的一些传感器。生物炭并非完全相同，其性质随原料类型和热解温度而变化，因此通常难以对实验进行标准化，或将其结果与实际田间条件相关联。本研究表明，生物炭的效果在很大程度上取决于原料类型以及所测试的生物种类。某些生物炭可促进微生物和植物生长，而另一些则对土壤生物具有毒性。首先，采集试验田的表层土壤。使用戴手套的手工方法去除可见的表面杂物，例如植物残体或石块，并将土壤过筛至颗粒大小小于五毫米，以去除更细小的杂质。现在使用电子天平称取100克过筛后的土壤，并将其转移至已标记的测试容器中。每100克土壤分别加入1克、5克或10克的不同类型生物炭，按质量比制备1%、5%和10%的土壤生物炭改良剂。接下来，向每个容器中加入蒸馏水，使水量达到土壤最大持水能力的60%，然后用刮刀搅拌每个容器中的内容物，以确保土壤、生物炭和水均匀分布。混合后称量每个容器的重量并记录。用封口膜覆盖容器，以尽量减少蒸发。然后将容器置于设定为27摄氏度的培养箱中培养10天。进行pH值测定时，使用天平称取10克土壤-生物炭混合物至50毫升锥形管中，并向管中加入25毫升蒸馏水。使用涡旋振荡器以中等速度振荡混匀，然后用Whatman一号滤纸将溶液过滤至洁净的100毫升烧杯中。现在使用校准过的pH计，在20至25摄氏度的室温下测定滤液的pH值。将20克已培养的土壤-生物炭混合物加入一个洁净的9厘米培养皿中。使用洁净的刮铲轻轻抚平土壤表面，形成均匀的一层。每种生物炭浓度制备三个重复样本，并设置两个未添加生物炭的对照培养皿。在培养皿的土壤表面均匀放置10粒白芥（Sinapis alba）种子，让种子自然停留在土壤表面，不要按压进入土壤。用培养皿盖盖好后，放入培养箱中。置于25摄氏度左右，避光培养五天。培养结束后，使用塑料直尺测量每粒已萌发种子的根长，从种子边缘量至根尖。对于已裂开但未伸长的种子，根长记为0.1厘米。使用公式计算抑制效果百分比。使用分析天平称取10克土壤，放入耐热的玻璃或瓷碗中，并将碗置于已预热至105摄氏度的烘箱内干燥两小时。干燥后，将碗转移至干燥器中，冷却10分钟，以防止从空气中吸收水分。冷却后，使用分析天平再次称量碗的重量。利用公式计算干物质百分比。进行DHA测定时，将12.12克三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800毫升蒸馏水中，配制100毫摩尔/升的缓冲液，用1摩尔/升盐酸调节pH至7.6。用蒸馏水定容至一升，将溶液储存在4°C，一周内使用。接下来，将一克TTC溶解于10毫升已配制的Tris缓冲液中，制成300毫摩尔的TTC底物溶液。避光保存于4°C，并在一周内使用。取100毫克TPF加入10毫升96%乙醇中，搅拌至完全溶解，得到33毫摩尔的TPF储备液。取0.5毫升储备液用50毫升乙醇稀释，配制浓度为330纳摩尔/毫升的工作溶液，然后分别从TPF工作溶液中取0、0.1、0.2、0.5和1毫升，用乙醇定容至3毫升，配制成工作标准溶液。在485纳米处测定这些标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。现在将五克土壤生物炭混合物称量至一个50毫升的锥形管中，并向每个测试样品中加入4毫升Tris缓冲液和1毫升TTC溶液。对于对照样品，仅加入4毫升Tris缓冲液。轻轻翻转混匀试管，并在25摄氏度避光条件下孵育6小时。孵育结束后，向试管中加入25毫升乙醇，并置于25摄氏度避光环境中，以250转/分钟在摇床中振荡1小时。振荡结束后，向对照管中加入1毫升TTC，然后将所有试管在25摄氏度下以2000 ×g离心5分钟。将所得上清液转移至洁净的离心管中用于分析，并使用分光光度计在485纳米处测定吸光度。最后，利用标准曲线确定每个测试样本和对照样本中TPF的浓度（单位为纳摩尔/毫升），并根据公式计算脱氢酶活性。香烟滤嘴和废弃啤酒花生物炭中的钙和钾含量最高，而云杉木生物炭中铝和铁的含量最高。铜和镁在使用过的啤酒花生物炭中也显著富集。所有处理组的土壤 pH 值均随时间逐渐升高，其中卷烟滤嘴生物炭在重量比 10% 的条件下第 15 天达到最高 pH 值 9.48，而啤酒花生物炭在重量比 10% 时 pH 值最高达到 9.2，增幅为 16.57%。对照组的保水性最高，在 15 天内仅损失了其重量的 3.67%。在各种生物炭中，烟头生物炭的重量损失最小，为5.89%，而咖啡渣生物炭的重量损失最高，达16.56%。对照土壤中白色长足蚓（Enchytraeus albidus）种群数量增加了60%，而云杉木生物炭处理组则表现出53%的抑制作用。咖啡渣和啤酒花生物炭均导致20%的抑制作用，而烟头生物炭则使蚯蚓繁殖率提高了33%。白芥（Sinapis alba）的根伸长在1%（重量比）咖啡渣生物炭处理下被促进79.16%，但在5%浓度下则被抑制47.08%。云杉木生物炭在所有浓度下均促进根系生长，其中10%浓度下促进效果最高，达206.66%。细菌菌落数量在10%烟头生物炭处理下最高，其次为1%（重量比）云杉木生物炭处理。咖啡渣和啤酒花生物炭在较高浓度下表现出中等程度的促进作用。脱氢酶活性在1%（重量/重量）的咖啡渣生物炭中最高，约为每克3.53 × 10⁻³ 毫克单位。而云杉木生物炭在所有浓度下均表现出负值。啤酒花和烟头生物炭的活性随浓度增加而降低。

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