用于单细胞质谱代谢组学研究的样品制备：结合细胞洗涤、淬灭、干燥和储存

我们开发了用于单细胞质谱研究的方案来保持细胞代谢物的完整性。我们研究了洗涤、淬火和储存条件如何影响细胞代谢物。最近开发了新的样品制备方法和质谱技术，以推进单细胞代谢组学研究，以更好地了解细胞异质性和疾病机制。

研究人员需要克服多项关键挑战，包括样品量有限、样品复杂性导致的检测灵敏度降低以及样品制备和分析导致代谢物改变。我们展示了全面的样品制备技术，可以保留细胞代谢物和细胞完整性，用于单细胞质谱代谢组学研究。我们的方案可以提供一种简单有效的方法，用于使用不同的质谱技术制备、储存和运输样品，用于单细胞代谢组学研究。

首先，将细胞在含有 5% 二氧化碳的加湿培养箱中以 37 摄氏度孵育。每天监测细胞的汇合度，并在培养物达到 80% 汇合度时传代它们。传代时，从培养皿中吸出培养基并用五毫升PBS冲洗一次。

将细胞与两毫升0.25%胰蛋白酶EDTA在37摄氏度下孵育三分钟，以促进细胞分离。通过加入八毫升预热完全培养基并轻轻移液以分散细胞来中和胰蛋白酶。将一毫升悬浮液转移到九毫升新鲜的完全培养基中，用于计数细胞。

要接种细胞，请将它们稀释至最终浓度为 10 的 10 倍，每毫升 6 个细胞的幂次方。将单个 18 毫米玻璃盖玻片放入 12 孔板的孔中。向每个孔中加入两毫升完全培养基和 200 微升细胞悬液，以达到每孔 5 个细胞的 10 次方的两倍。

将细胞孵育过夜以允许附着。为了洗涤细胞，向 12 孔板的每个孔中加入两毫升冷甲酸铵溶液。然后使用无菌镊子，轻轻地从孔中提起每个含有粘附细胞的盖玻片，并将其短暂放置在预装有两毫升冷 0.9% 甲酸铵溶液的单独孔中两到三秒钟。

将每个冲洗过的甲酸铵盖玻片，将细胞朝上放入铝箔容器内的培养皿中。将 10 至 20 毫升液氮缓慢倒在盖玻片上，以确保完全覆盖。并立即用镊子倾斜培养皿以倒出任何剩余的液氮。

使用低温手套和绝缘镊子，将装有液氮冷藏盖滑块的培养皿放入真空浓缩室中。使用标准真空设置处理样品五到七分钟，直到可见的液氮蒸发并且盖玻片看起来干燥。确保干燥的盖玻片不含任何残留的液氮或冰晶。

接下来，用纸巾包裹容器并将其转移到 80 摄氏度的冰箱中 48 小时。储存后，将装有培养皿的盖玻片转移到室温干燥剂中10分钟。在将盖玻片从干燥器中取出之前，请确保盖玻片上的冷凝霜或水完全消失。

将样品分为两组并适当处理。现在，将单个探头安装到 XYZ 载物台上，并将其固定在数码显微镜下方的电动 XYZ 机械手上。将单个探针装置耦合到质谱仪以进行 SCMS 分析。

使用纯度至少为99.9%的含有0.1%甲酸的丙酮丁腈作为提取溶剂，并使用注射泵以每分钟150纳升的流速输送。设置正离子和负离子模式的质谱参数。现在，将第一组和第二组的两个盖玻片一起放在单探针SCMS设置的电动XYZ载物台上，并使用显微镜随机选择细胞进行分析。

采集质谱图后，使用相同的单个探针、溶剂流速和电离电压分析每组约 30 个细胞。使用自定义 R 脚本对原始 SCMS 数据进行预处理，并应用背景和噪声去除，然后对总离子电流进行离子强度归一化。使用 Python 包 MSD 同位素对 SCMS 数据进行去同位素处理。

使用内部 Python 脚本执行峰对齐。将箱宽设置为 0.01 主电荷比进行分级，将质量公差设置为 0.01 主电荷比或百万分之五用于峰对齐。使用 Metabo Analyst 6.0 进行统计数据分析。

执行 T 检验并生成显示相对代谢物水平的热图。选择使用前 100 名和 T 检验或 Inova 的选项，以生成按显着性排名的前 100 种代谢物，并使用这些具有显着差异的前 100 种代谢物绘制热图。最后，使用百万分之十的质量公差对照人类代谢组数据库搜索准确的主电荷值，以进行数据库搜索。

正离子模式下的主成分分析表明，第一组和第二组重叠密切，表明代谢物谱高度相似。在负离子模式下，观察到类似的模式，尽管第二组看起来稍微明显一些。对前 100 种代谢物的热图分析显示，在两种离子模式下，第一组和第二组之间的丰度模式高度一致。

没有观察到重大变化或特定于群体的聚类。尽管少数代谢物簇的微小变化可能反映了电离效率或代谢物稳定性的差异。