单细胞质谱代谢组学研究的样品制备：细胞洗涤、淬灭、干燥与储存的联合操作

我们已开发出用于保护单细胞质谱研究中细胞代谢物完整性的实验方案。我们研究了洗涤、淬灭和储存条件对细胞代谢物的影响。近年来，新的样品制备方法和质谱技术不断发展，以推动单细胞代谢组学研究，从而更深入地理解细胞异质性和疾病机制。

研究人员需要克服多个关键挑战，包括样本量有限、由于样本复杂性导致检测灵敏度降低，以及样本制备和分析过程中代谢物的改变。我们展示了全面的样本制备技术，可在单细胞质谱代谢组学研究中保持细胞内代谢物和细胞完整性。我们的方案可为采用不同质谱技术进行单细胞代谢组学研究的样本制备、储存与运输提供一种简单而有效的方法。

首先，在含有5%二氧化碳的湿润化培养箱中，于37摄氏度条件下孵育细胞。每天监测细胞融合度，当培养物达到80%融合度时进行传代。传代时，从培养皿中吸除培养基，并用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗一次。

加入2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，在37摄氏度下孵育3分钟，以促进细胞脱落。加入8毫升预热的完全培养基中和胰蛋白酶，并轻轻吹打使细胞分散。取1毫升细胞悬液加入到9毫升新鲜完全培养基中，用于细胞计数。

接种细胞时，将细胞稀释至终浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞。将18毫米的玻璃盖玻片分别放入12孔板的各孔中。每孔加入2毫升完全培养基和200微升细胞悬液，使每孔细胞数量达到2 × 10⁵个。

将细胞孵育过夜以促进贴壁。清洗细胞时，向12孔板的每个孔中加入2毫升冰冷的甲酸铵溶液。然后用无菌镊子轻轻取出每个含有贴壁细胞的盖玻片，并将其短暂地放入预先加入2毫升冰冷0.9%甲酸铵溶液的独立孔中，浸泡2至3秒。

将每张经甲酸铵漂洗、细胞面朝上的盖玻片放入铝箔包裹的培养皿中。缓慢倾倒10至20毫升液氮覆盖盖玻片，确保完全浸没。然后立即用镊子倾斜培养皿，倒出残留的液氮。

使用低温手套和隔热镊子，将含有液氮冷冻盖玻片的培养皿放入真空浓缩仪腔室内。采用标准真空设置处理样品，持续五到七分钟，直至可见的液氮完全蒸发，盖玻片表面呈现干燥状态。确保干燥后的盖玻片上无任何残留的液氮或冰晶。

接下来，用纸巾包裹容器，并将其转移至 -80 °C 的冰箱中保存 48 小时。保存结束后，将含有培养皿的盖玻片转移至室温干燥器中，放置 10 分钟。在从干燥器中取出盖玻片前，需确保其表面凝结的霜或水分已完全消失。

将样品分为两组并进行相应的处理。现在，将单探针安装到XYZ载物台上，并将其固定在数字显微镜下方的电动XYZ操纵器上。将单探针装置与质谱仪耦合，用于单细胞质谱分析（SCMS）。

使用纯度不低于99.9%、含0.1%甲酸的乙腈作为提取溶剂，通过注射泵以每分钟150纳升的流速输送。设定质谱仪在正离子和负离子模式下的参数。现在，将第一组和第二组的两张盖玻片一起放置在单探针SCMS装置的电动XYZ载物台上，并利用显微镜随机选择细胞进行分析。

获取质谱数据后，使用相同的单探针、溶剂流速和电离电压，对每组约30个细胞进行分析。使用自定义的R脚本对原始单细胞质谱（SCMS）数据进行预处理，依次进行背景扣除和去噪，然后对离子强度进行总离子流归一化。使用Python软件包MSD isotope对SCMS数据进行去同位素处理。

使用内部开发的 Python 脚本进行峰对齐。设置 0.01 质荷比作为分箱的 bin 宽度，峰对齐时采用 0.01 质荷比或五百万分之五的质量容差。使用 Metabo Analyst 6.0 进行统计数据分析。

进行 T 检验并生成显示相对代谢物水平的热图。选择使用“前 100”和“T 检验”或“Inova”选项，以生成按显著性排序的前 100 个代谢物，并利用这些具有显著差异的前 100 个代谢物绘制热图。最后，使用 10 ppm 的质量容差，将精确的母离子电荷值与人类代谢组数据库进行比对检索。

正离子模式下的主成分分析显示，第一组与第二组高度重叠，表明其代谢物谱图极为相似。在负离子模式下也观察到类似模式，尽管第二组表现出略微明显的区分。对前100种代谢物进行热图分析，在两种离子模式下均显示出第一组与第二组之间高度一致的丰度模式。

未观察到显著的偏移或特定组别的聚类现象。尽管少数代谢物簇的微小变化可能反映了离子化效率或代谢物稳定性的差异。