小鼠咳嗽与喷嚏反射的精确诱导与区分

本方案重点关注小鼠的呼吸反射。我们旨在刺激气管和鼻腔以诱导咳嗽和打喷嚏，并根据声音特征区分这两种事件。以往的研究通常使用雾化的辣椒素或柠檬酸来刺激小鼠的呼吸反应以及咳嗽和打喷嚏行为。

然而，目前尚不清楚通过雾化刺激呼吸检查是否会引起咳嗽、打喷嚏，或两者皆有，因为当前尚无可靠的方法来区分这两种反应。在本项目中，我们建立了一种通过选择性刺激气管或鼻腔来诱导咳嗽和打喷嚏的方法。此外，我们还利用声学分析来识别咳嗽与打喷嚏之间的特征性差异。

我们的大规模研究提供了一种强有力的工具，将直接推动针对咳嗽和喷嚏障碍的未来药物研发。首先，将一根28号针头截成一段长约五毫米的套管。使用镊子和砂纸将套管两端打磨光滑，并将其中一端连接到硅胶管上。

将连接导管的套管接至一支一毫升注射器上，并用水冲洗套管以确认其通畅性。接着，以2比3至3比3的臂长比例将套管弯曲成90度角。将较长的一端插入五厘米长的硅胶管中。

将小鼠随机分为三组，每组六只。现在，将麻醉后的小鼠仰卧位固定在实验台上。剃除颅颈部毛发后，用碘伏和酒精对区域进行消毒。

在显微镜下，切开颈部皮肤约一厘米，钝性分离组织和肌肉以暴露气管。使用32号针头穿刺环状软骨与气管软骨之间的软组织。然后，用眼科剪刀制作一个微小的气管开口。

将硅胶套金属套管插入气管腔内约一毫米，并用7-0缝线固定套管与气管连接处。接着，切开头皮约一厘米，从颈部皮下钝性分离至颅骨。将硅胶管经皮下隧道引至颅骨，并用牙科水泥将其固定在颅骨上，然后缝合皮肤。

缝合颈部切口，让动物恢复五天。将超声探头安装与端口兼容的密封环，并将探头插入全身体积描记室的端口，以确保气密性接触。将全身体积描记室连接至流量传感器和偏置气流系统。

将颅骨固定的硅胶管连接至一根30厘米长的延长管，并将小鼠放入全身体积描记室中。将导管从舱室顶部的端口穿出，并用油泥在导管周围密封该端口。通过确认呼吸波形峰值落在4±2范围内，验证系统的气密性。

将装有5毫升辣椒素溶液的1毫升注射器连接到延长管上，并将其安装到微量注射泵上。将高速摄像机对准腔室，调整摄像机距离和焦距以获得清晰视野，并将采样率设置为每秒160帧。

现在，同时启动全身体积描记仪、超声设备和相机软件。触发泵以开始辣椒素输注，并记录10分钟内的咳嗽次数。准备好实验动物及该操作所需的所有材料。

麻醉并准备好小鼠后，将其固定在立体定位仪上。使用碘伏和酒精对术区进行消毒。用手术刀在颅骨和鼻骨上方切开皮肤，暴露鼻骨。

使用微型钻头，在鼻骨与鼻中隔软骨侧突连接处钻出一个0.5毫米的孔。通过该钻孔暴露鼻黏膜。用32号针头轻轻抬起鼻黏膜，以暴露鼻腔。

然后，将聚乙烯管固定在立体定位仪的机械臂上。调整管尖，使其与颅骨钻孔开口平齐，使用牙科水泥将管道固定在鼻骨上，然后缝合皮肤。将小鼠置于加热垫上，使其恢复直至意识清醒。

根据制造商手册，将全身体积描记室连接至流量传感器和偏置气流系统。接着，为超声探头安装适配端口的垫圈。将探头插入体积描记室，并确认密封严密不漏气。

将小鼠放入体积描记室中，并将聚乙烯管从顶部端口穿出。使用油泥密封端口以固定管路。检查室腔的气密性，并按照之前演示的方法设置相机。

最后，将一根直径为0.25毫米的尼龙细丝通过软管推进至鼻腔内0至3毫米深度处，软管外的手持部分应留出5厘米长的细丝。每次刺激时，按压细丝的自由端直至其弯曲约45度，使鼻黏膜受到约0.6克的力，持续1秒钟。

每30秒重复刺激一次，持续记录10分钟内的喷嚏反应。接受气管或鼻部手术并分别接受机械性鼻刺激和辣椒素气管激发的小鼠，其喷嚏和咳嗽事件显著增加。整体容积描记法记录显示，辣椒素诱导的咳嗽和机械诱导的喷嚏均表现为单峰和双峰的呼吸波形。

声波波形图显示，咳嗽声音在起始时具有突然出现的高强度峰值，且能量主要集中在0至30千赫兹范围内；而喷嚏声音的强度则逐渐增强，频率范围覆盖0至80千赫兹，持续时间更长。单峰咳嗽的压缩阶段平均约为32.39毫秒，显著短于双峰咳嗽的约53.17毫秒。

单峰喷嚏的平均压缩阶段持续时间约为44.03毫秒，而双峰喷嚏平均约为74.24毫秒，显著更长。咳嗽中77.55%表现为单峰模式，而仅有32.42%的喷嚏表现为单峰，双峰模式占主导，达67.58%。喷嚏的声音持续时间显著长于咳嗽，但两者范围存在重叠。切断鼻部感觉传入神经可显著减少辣椒素诱导的喷嚏，而咳嗽则不受影响。