Name: 肌动蛋白共沉淀测定; F -肌动蛋白结合蛋白分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学习肌动蛋白共沉淀测定技术，用于分析F-肌动蛋白结合蛋白的相互作用。该方法通过超速离心分离沉淀物和上清液，帮助研究人员在体外定量研究蛋白质与细胞骨架的结合特性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢加州大学旧金山分校Wittman实验室的Praveen Kumar博士提供HaCAT细胞中肌动蛋白的影像资料。

1. 肌动蛋白的制备
本实验所用的肌动蛋白来源于Cytoskeleton公司提供的非肌肉来源的人血小板（β-肌动蛋白）。将肌动蛋白储存液分装后于-70ºC冰箱中保存，浓度为10 mg/ml。实验时，将肌动蛋白用含有5 mM Tris（pH 8）、0.2 mM CaCl2、0.2 mM ATP和0.5 mM DTT的缓冲液稀释至0.4 mg/ml，并在4ºC条件下以20,000g离心10分钟。上清液即为单体肌动蛋白，可进一步用于聚合反应。通过加入50 mM KCl、1 mM ATP和2 mM MgCl2诱导肌动蛋白聚合反应，在室温下反应1小时完成聚合。
2. 蛋白质的制备
在本实验中，我们使用的是纯化后的带有 GST 标签的踝蛋白 C 末端。用于实验的蛋白质在与 F-肌动蛋白孵育前，需经过高速离心以预先清除聚集体。 蛋白质在贝克曼超速离心机中于 22ºC 下以 100,000g 离心 20 分钟。
3. 肌动蛋白-蛋白质孵育
每次实验中肌动蛋白和蛋白的用量会有所不同。本示例中，我们使用过量的肌动蛋白。通常需要计算摩尔比，例如肌动蛋白与蛋白的摩尔比为4:1。 在以下实验中，最终反应体积为150 µl。蛋白与F-肌动蛋白孵育所用的缓冲液取决于待测蛋白及其所需的实验条件。本示例中，我们使用含有10 mM Tris（pH 7.0）、1 mM ATP、0.2 mM DTT、1 mM EGTA、0.1 mM CaCl2 和 2 mM MgCl2 的缓冲液。蛋白与F-肌动蛋白在室温下于缓冲液中孵育1小时。
4. F-肌动蛋白的沉降
孵育结束后，样品在22ºC下以100,000g离心。视频中使用的是Beckman超速离心机。小心取出转子，避免扰动沉淀。
5. 蛋白质与F-肌动蛋白共沉淀的分析
用移液器小心吸出上清液，转移至一个离心管中，并加入5倍体积的Laemmli SDS-PAGE上样缓冲液。向残留的沉淀物中加入适量的1倍体积Laemmli SDS-PAGE上样缓冲液，上下吹打混匀后，转移至新的离心管中。通过SDS-PAGE分离沉淀物和上清液中的蛋白质，并经考马斯亮蓝染色或蛋白质印迹法分析其相对蛋白含量。
为了确定蛋白质与肌动蛋白相互作用的特异性，可进行肌动蛋白浓度依赖性的共沉降实验。在此类实验中，将固定量的蛋白质与一系列递增浓度的肌动蛋白共同孵育，并按照上述方法进行分析。

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

肌动蛋白共沉淀是一种简单的体外实验方法，用于分析特定蛋白质与F-肌动蛋白的结合。在本视频中，我们演示了一个如何进行简单肌动蛋白共沉淀实验的示例。我们展示了F-肌动蛋白的制备方法、待测蛋白质的准备以及肌动蛋白共沉淀的操作步骤。在进行肌动蛋白共沉淀实验时，需考虑多个因素。例如，孵育所用缓冲液的组分可能因待测蛋白质的不同而有所变化，且pH值、温度和盐浓度可能会影响蛋白质与F-肌动蛋白的结合。我们在此展示的是与F-肌动蛋白的简单结合实验，但此类实验可进一步拓展，用于确定某种蛋白质或蛋白质结构域与F-肌动蛋白结合的特异性。

肌动蛋白共沉淀实验；用于分析蛋白质与f-肌动蛋白的结合

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

细胞内的肌动蛋白细胞骨架是由肌动蛋白丝构成的网络结构，可介导细胞运动及各种细胞过程，并产生张力以维持细胞形态。尽管肌动蛋白细胞骨架具有一定的刚性，但它是一个不断发生动态重塑的可变结构。多种蛋白质能够与肌动蛋白细胞骨架结合。特异性蛋白质与F-肌动蛋白（F-actin）的结合常被用于支持细胞生物学观察结果，或进一步理解由肌动蛋白骨架重塑所引发的动态过程。肌动蛋白共沉降实验是一种体外常规用于分析特定蛋白质或蛋白质结构域与F-肌动蛋白结合能力的方法。该实验的基本原理包括：将目标蛋白质（全长或结构域）与F-肌动蛋白共同孵育，通过超速离心使F-肌动蛋白沉淀，随后分析与F-肌动蛋白共沉淀的蛋白质。根据实验设计，肌动蛋白共沉降实验可用于测定肌动蛋白结合亲和力，也可用于竞争性结合实验。

蛋白质通过不同的肌动蛋白结合结构域与丝状肌动蛋白（F-actin）结合。在本视频中，我们演示了肌动蛋白共沉淀实验的操作流程，这是一种体外常规使用的分析方法，用于研究能够与F-actin结合的蛋白质或特定结构域。

肌动蛋白共沉淀实验；用于分析蛋白质与F-肌动蛋白的结合

细胞内的肌动蛋白细胞骨架是由肌动蛋白丝组成的网络结构，能够介导细胞运动和细胞活动过程，并产生……

在细胞内，肌动蛋白细胞骨架是一种动态结构，其重塑在细胞分裂、细胞迁移和物质运输等多种过程中具有重要作用。多种蛋白质可通过不同的肌动蛋白结合结构域与肌动蛋白细胞骨架结合。在本视频中，我们将演示肌动蛋白共沉淀实验的操作流程。这是一种体外分析方法，常用于研究能够结合丝状肌动蛋白的蛋白质或其特定结构域。大家好，我是来自加州大学旧金山分校（UCSF）细胞与组织生物学系Diane Barber博士实验室的Jody Var。在本视频中，我将向您展示如何进行肌动蛋白共沉淀实验。该方法是一种用于分析特异性结合丝状肌动蛋白的蛋白质并测定其结合亲和力的技术。该实验流程包括以下步骤：丝状肌动蛋白的制备、待测蛋白的准备、将目标蛋白与丝状肌动蛋白（简称F-actin）共孵育，通过超速离心（100,000 ×g）沉淀F-actin，随后进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，以观察上清和沉淀组分中的蛋白分布情况。最后，分析在腭部组分中与F-肌动蛋白共同沉淀的蛋白质。那么，让我们开始吧。为了制备肌动蛋白丝，最佳做法是确保我们所使用的肌动蛋白处于单体形式。从–80 °C冰箱中取出浓度为10 M/毫升的肌动蛋白储备液，用含有Tris、氯化钙、ATP（用于单体稳定）和DTT的缓冲液将其稀释至工作浓度2.4 mg/毫升。将稀释后的溶液置于冰上孵育1小时。孵育结束后，将肌动蛋白溶液在4 °C条件下以14,000 ×g离心10分钟。所得上清液即为单体肌动蛋白。现在，通过向这些纯化的肌动蛋白单体中加入氯化钾、氯化镁和ATP，在室温下孵育一小时，即可生成丝状肌动蛋白。此时，丝状肌动蛋白已准备就绪，可与目标蛋白或目标蛋白结构域进行孵育，我们将在下一步中向您展示该过程。为了进行肌动蛋白共沉淀实验，我们必须准备待检测的蛋白质。今天我使用的是经过纯化的GSC融合蛋白形式的clan。该蛋白质通过超速离心去除聚集体，所得上清液现已可用于实验。为了检测蛋白质与肌动蛋白的结合，必须使肌动蛋白过量。在此情况下，将10微克肌动蛋白与5微克蛋白质在含有Tris、ATP、BTME（巯基乙醇）、EDTA、氯化钙的缓冲液中孵育，总体积为150微升。蛋白质与肌动蛋白的孵育直接在超速离心管中进行，室温孵育1小时。试管1和试管2为对照组。试管1仅含有肌动蛋白和缓冲液。二号样品管仅含有缓冲液中的蛋白质。三号样品管含有缓冲液中的肌动蛋白（actin）和尾部蛋白（tailn）的CNU结构域。四号样品为非特异性结合的额外对照，仅含有肌动蛋白和GST蛋白。经过一小时的孵育后，我们的样品被小心地放入贝克曼（Beckman）转子中。然后将超速离心机设置为十万 ×g，在 22°C 下离心 20 分钟。离心结束后，即可对样品进行 SDS-PAGE 上样前的准备。在 20 分钟离心后，小心地从转子中取出样品，避免扰动沉淀。在离心管侧壁标记沉淀所在的位置。小心地将上清液转移至 eino 管中，加入五倍 XSCS 上样缓冲液。向超速离心管中残留的沉淀加入一倍 XSCS 上样缓冲液。上下吹打混匀后，将重悬的沉淀转移至新的 eend orph 管中。然后将样品在加热块中煮沸最多10分钟。煮沸后，将样品上样至SDS-PAGE凝胶。此处我使用的是预先制备好的10%凝胶。将样品按正确顺序小心地加入到凝胶孔中。在室温下以恒定电压电泳约一小时。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色以观察蛋白质。应使用Kumasi蓝色溶液完全覆盖凝胶。将凝胶置于摇床中至少20分钟。随后去除ESI蓝色溶液，并将凝胶浸入脱色液中。将凝胶置于摇床上静置约一小时，直至凝胶中出现条带。考马斯亮蓝染色后，可分析凝胶以确定上清液与沉淀组分中蛋白质的相对含量。观察第1和第2泳道的凝胶，可以看到仅含肌动蛋白的上清和沉淀组分。在第三和第四泳道中，我们分别加入了仅 C 末端尾肽的上清和沉淀组分。在第五和第六泳道中，我们分别加入了肌动蛋白与 C 末端尾肽共孵育后的上清和沉淀组分。在第七和第八泳道中，我们分别加入了肌动蛋白与 GST 蛋白共孵育后的上清和沉淀组分。如您所见，尾部的CT仅在第六道的腭部组分中可见。该凝胶结果表明C端尾部与肌动蛋白存在特异性结合。在本视频中，您已学习了如何进行肌动蛋白共沉降实验。Acton Co 沉降分析是一种用于分析肌动蛋白结合蛋白的体外方法。进行此实验时，需牢记以下要点：应预先清除目标蛋白，并为每种蛋白与肌动蛋白的孵育体系设置仅含蛋白的阴性对照。该对照用于检测是否有预先清除的蛋白质自行沉淀，因为某些蛋白质与肌动蛋白的结合可能对缓冲液的 pH、温度或盐浓度敏感。就这些。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肌动蛋白共沉淀测定;​​ F -肌动蛋白结合蛋白分析

结构功能分析中蛋白质浓度准确性对动力学与亲和力测定的重要性

本视频介绍了研究原代人结肠癌细胞中细胞骨架和黏着斑的技术，以了解其随基质刚度变化的差异。通过在软硬基质上培养癌细胞，可进行多种下游生物物理测量，用于癌症预后评估。...

细胞骨架与黏着斑组织检测：一种基于免疫荧光的细胞在基质上黏附与铺展研究方法

FtsZ的聚合对细菌细胞分裂至关重要。本文中，我们详细描述了监测FtsZ聚合活性的简单实验方案，并讨论了缓冲液组成对聚合的影响。这些方案可用于研究FtsZ与调控蛋白或影响FtsZ聚合的抗菌药物之间的相互作用。...

FtsZ 聚合实验：简易方案与注意事项

本方案描述了一种检测蛋白质与丝状肌动蛋白（F-actin）共沉淀能力的方法，若观察到结合，则可进一步测定该相互作用的亲和力。...

通过共沉淀法测定蛋白质与F-肌动蛋白的结合

早期核内体的功能依赖于F-actin的聚合。本文介绍一种基于显微镜的 体外...

体外 早期早期内体上F-肌动蛋白的聚合

我们报告了一种基于荧光光谱法的简单、高效且高通量的检测方法，用于定量微丝中的肌动蛋白 离体...

一种基于荧光光谱法快速评估啮齿类和人类脑组织中肌动蛋白聚合状态的检测方法

为了前进，生长锥必须对外部环境施加牵引力。牵引力的产生依赖于肌动蛋白动态和离合器耦合。本研究描述了分析生长锥前进过程中肌动蛋白动态、离合器耦合以及牵引力的方法。...

生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。...

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

本方案描述了如何使用市售蛋白质组分在微珠表面产生肌动蛋白彗尾结构。此类系统可模拟细胞中的突出结构，能够以简化的方式研究力生成的生理机制。...

使用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

该方法描述了一种基于凝集素的 体外 通过沉淀实验定量测定葡聚糖磷酸酶与支链淀粉的结合亲和力。该共沉淀实验可可靠地测量葡聚糖磷酸酶的底物结合能力，并适用于多种可溶性葡聚糖底物。...

基于刀豆蛋白A的沉淀实验检测葡聚糖磷酸酶的底物结合能力

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。...

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

学习肌动蛋白共沉淀测定技术，用于分析F-肌动蛋白结合蛋白的相互作用。该方法通过超速离心分离沉淀物和上清液，帮助研究人员在体外定量研究蛋白质与细胞骨架的结合特性。

肌动蛋白共沉淀实验；用于分析蛋白质与F-肌动蛋白的结合

探索更多视频