可视化血脑屏障守门人：基于伊文思蓝染料的成年斑马鱼血脑屏障通透性评估

本研究旨在建立一种可靠、简便且经济有效的方法，用于评估成年斑马鱼的血脑屏障完整性。目前大多数斑马鱼研究缺乏易于操作且可靠的血脑屏障破坏检测手段，而现有方法往往较为复杂或成本较高。因此，本实验方案提供了一种实用且经济的解决方案。

该方案简单、经济，结合了可视化和可量化分析，且无需昂贵的设备或复杂的操作步骤。通过提供一种简单且可重复的实验流程，将有助于实验室更便捷地研究成年斑马鱼疾病模型中的神经血管变化。首先，通过将水温从12摄氏度逐渐降低至7摄氏度，使斑马鱼麻醉，直至其对触觉刺激不再有反应。

使用31号胰岛素注射器，向鱼的腹腔内注射20微升1%伊文思蓝（Evans blue）染料（EB染料），并在注射部位施加轻柔压力10秒，以防止液体回流。随后将鱼转移至恢复缸中，静置恢复30分钟。在此期间密切观察鱼是否有损伤、死亡或行为异常。

为建立阳性对照，准备一个连接胰岛素注射器的无菌31号针头，用于进行刺伤损伤操作。经过30分钟恢复期后，再次麻醉斑马鱼，操作方法如前所述。将斑马鱼垂直放置在平坦的低温表面（如冰袋）上。

将针头以90度角插入头胸部的一侧，深度不超过1.5毫米。然后将鱼转移至恢复缸中，使其恢复30分钟。通过低温法处死鱼后，使用无菌刀片或手术剪将已处死的鱼断头。

用1:20的鱼体与1×PBS比例，将头部在1×PBS中冲洗两次，以去除多余的血液和伊文思蓝染料。然后用1:20的鱼体与4%多聚甲醛比例固定头部，并在4摄氏度下孵育过夜。将固定后的头部置于洁净的培养皿中，使用尖头镊子解剖出脑组织。

解剖过程中持续滴加PBS，以保持组织湿润并防止干燥。将解剖所得脑组织分别在两份独立的PBS溶液中各清洗一次，随后置于1%琼脂糖板上，以保持水分并防止收缩。在体视显微镜下观察解剖后的脑组织。

开始定量分析时，下载并安装 Fiji 软件，然后在 Fiji 中打开脑图像文件。依次选择图像（Image）、颜色（Color）、颜色解卷积（Color Deconvolution），并选择 RGB。这将生成三个独立的图像，分别代表红色、绿色和蓝色通道。

现在，通过单击图像激活蓝色通道图像（通常标记为Color 3）。选择“Image”，然后选择“Type”和“8-bit”，将其转换为8位灰度图像。接下来，为了测量该8位图像的灰度强度，选择“Analyze”并点击“Set Measurements”，以设置测量参数。

然后选择区域和平均灰度值。使用矩形选区工具，绘制一个大小一致的兴趣区域，并通过选择“分析”（Analyze），然后选择“测量”（Measure），来测量灰度强度。正常的斑马鱼表现出典型的棕褐色皮肤色调，而EB注射的斑马鱼则呈现出明显的蓝紫色调。

为了研究成年斑马鱼帕金森病模型中血脑屏障的完整性，比较了生理盐水注射对照组与帕金森病斑马鱼脑组织中伊文思蓝（EB）染料的外渗情况。在阴性对照组中，脑部血管呈红色，表明无伊文思蓝染料外渗。相比之下，生理盐水注射对照组、阳性对照组以及帕金森病组的脑血管均呈现蓝色，证实伊文思蓝染料已成功进入全身循环。

阴性对照组小鼠的离体脑组织呈白色，血管清晰可见，证实无伊文思蓝染色。在阳性对照损伤组中，脑组织周围出现明显的蓝色着色，表明由于人为破坏血脑屏障导致染料外渗。在生理盐水注射组中，伊文思蓝染色局限于血管内，提示血脑屏障保持完整。

帕金森病组呈现出较深且更弥散的蓝色染色模式，表明伊文思蓝染料存在显著渗漏及血脑屏障受损。定量灰度分析显示，与生理盐水注射组相比，帕金森病组的灰度强度值显著降低。