利用NgTET辅助的CRISPR-Cas系统实现精确的噬菌体诱变

我们在分子水平上研究噬菌体感染。这属于基础科学。然而，我们不仅从事基础科学研究，还致力于将这些基础科学发现转化为实际应用，利用这些知识来研究噬菌体感染过程，并将其应用于噬菌体工程和治疗领域。

噬菌体研究领域最近最重要的进展之一是发现了细菌的免疫系统。这种免疫系统存在于所有细菌中，它们能够识别或产生用以抵抗噬菌体的工具。然而，噬菌体相当聪明。

噬菌体不仅能够识别各种工具，还能开发出使其逃逸宿主免疫系统的工具。其中一种工具就是通过修饰其DNA来实现的。这一点对我们而言尤其重要，因为研究噬菌体为逃避免疫系统而产生的DNA修饰的化学本质具有重要意义，同时也有助于我们最终将这些机制转化为改造噬菌体的工具。

在过去的10年中，全球各地的优秀同行开发出了许多出色的技术。其中一项技术就是下一代测序。基于该技术，我们能够对噬菌体以及宿主的完整基因组在分子水平上进行测序。

另一方面，质谱技术得以发展，类似于蛋白质组学。CRISPR 是一种出色的工具，现已被应用于生命的各种界。我们目前也正在利用这一技术对噬菌体基因组进行改造。

这些只是少数几种已经重塑了我们当今对噬菌体认知的杰出技术。当我们谈到当前面临的挑战时，其中一个挑战就是噬菌体基因组的CRISPR生物工程。噬菌体基因组经过了完全的DNA修饰，而CRISPR核酸酶实际上无法切割这类DNA。

因此，如果我们想要对噬菌体的基因组进行改造，这确实是一个需要克服的重大挑战。我们课题组发现了一种全新的RNA结构单元。我们发现，某些特定转录本在其5'末端携带一种称为氧化还原辅因子的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。最近，我们首次在大肠杆菌T4噬菌体的相互作用中也发现了这一现象。

基于这一发现，我们还确定了RNA与蛋白质之间存在一种全新的相互作用方式。我们发现，此前描述的NAD分子可像分子胶水一样，将RNA与蛋白质连接在一起。这种RNA关联方式是自然界中RNA与蛋白质相互作用的一种全新模式。

我们在生态抗噬菌体相互作用中做出了这一发现。现在，我们还迫切希望将这种基础科学转化为应用，例如应用于基于RNA的治疗领域。首先，用20单位的DNA酶I处理500微升噬菌体悬液。

加入2 µL AT1 RNA混合物至离心管中。将处理后的混合物在37°C孵育30分钟。接着，将500 µL处理后的噬菌体溶液加至已制备好的蔗糖梯度顶部。

在 4 摄氏度下，以 70,000 G 离心 20 分钟。从离心管底部用光照射，以观察梯度中浑浊的噬菌体条带。然后用钝头套管小心地将含有噬菌体的组分转移至新的超速离心管中。

现在，向离心管中加入 30 毫升预冷的 TM 缓冲液，然后离心。弃去上清液后，将沉淀物重悬于 500 微升 TM 缓冲液中。将重悬的噬菌体于 4 摄氏度下在玻璃小瓶中保存过夜。

向重悬的噬菌体中加入一微克蛋白酶K。将混合物在37摄氏度孵育30分钟。然后向样品中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液。

倒置以充分混匀，然后离心。将水相转移至新的反应管中，并重复提取三次。使用等体积氯仿进行三次反向提取，以去除残留的苯酚。

然后加入0.1体积的3摩尔乙酸钠（pH 5.5）和2.5体积的乙醇，使DNA沉淀。将混合物在-20摄氏度下孵育过夜。第二天，在4摄氏度下以15,000 ×g离心1小时，使DNA形成沉淀。

用200微升70%乙醇洗涤DNA沉淀两次。轻轻振荡离心管，再次离心。小心移除上清液。

然后，将纯化的DNA重悬于超纯水中，于-20摄氏度保存备用。接种已转化含有PET 28 NGTet质粒以及CAS 12或CAS 9表达质粒的大肠杆菌BL 21D 3细胞。

在含有适当抗生素的 LB 培养基中，37 摄氏度振荡培养。加入 0.05 毫摩尔的 IPTG 以诱导 NG TED 表达，并在 37 摄氏度继续孵育两小时。作为对照，比较大肠杆菌 BL21 D3 菌株在过表达 NgTET 与不表达 NgTET 的情况。

将300微升的大肠杆菌培养物转移至无菌离心管中。以感染复数为0.01的T4野生型或NgTET处理的噬菌体感染培养物。轻轻混匀以确保噬菌体均匀分布，然后再次孵育。

将细菌与噬菌体混合物加入含有0.75%琼脂和抗生素的4毫升LB软琼脂中。充分但轻柔地混匀，避免产生气泡。将软琼脂混合物倒入预热的LB琼脂平板上。

将平板在室温下短暂静置使其凝固，随后在37摄氏度下孵育过夜。次日，计数噬菌斑以确定噬菌斑形成单位的数量。对于反向筛选，使用待筛选的噬菌体感染大肠杆菌（E.coli）cast 13 A间隔序列。

在与诱变实验相同的条件下进行反向筛选。孵育后，将SUP上清液通过0.45微米滤膜过滤，以去除细菌碎片。将经过反向筛选并过滤的噬菌体用于在大肠杆菌B株上进行噬斑实验，以分离单个噬斑用于后续验证。

当T4噬菌体样品充分浓缩时，噬菌体条带清晰可见。通过SDS噬菌体实验证实了NgTET蛋白在大肠杆菌（E.coli）中的表达，结果显示在细胞裂解和离心后，该蛋白存在于可溶性和不溶性组分中。色谱图显示，野生型与经NgTET处理的T4噬菌体DNA中，二氧腺苷、二碘羟基喹啉和胸苷的相对丰度保持不变。

与未经处理的样本相比，经 NgTET 处理的噬菌体 DNA 中修饰的胞嘧啶衍生物丰度显著降低。通过黄金门克隆技术构建了包含 NgTET 基因及用于靶向诱变同源区域的质粒。PCR 筛选证实，在琼脂糖凝胶的第 2 至第 9 泳道中成功扩增出目标基因 mare，表明所挑选的噬菌斑中存在阳性克隆。

在野生型 T4 噬菌体 DNA 中，5-糖基羟乙基-2′-脱氧尿苷的相对丰度较高。在经 NgTET 处理的 T4 噬菌体 DNA 中，5-糖基羟乙基-2′-脱氧尿苷的水平相较于野生型显著降低。而用催化失活突变体 NgTET D234A 处理的 T4 噬菌体 DNA 则仍保持较高的 5-糖基羟乙基-2′-脱氧尿苷水平。

与野生型相比，回收的T4噬菌体子代中5-羟甲基-2′-脱氧尿苷的水平几乎恢复至正常。