Name: 使用 NgTET 辅助 CRISPR-Cas 系统进行精确噬菌体诱变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学习利用NgTET酶辅助CRISPR-Cas系统对噬菌体进行精确无疤痕诱变的方法。该技术通过减少DNA修饰，实现高效的噬菌体基因组工程，为噬菌体治疗和生物技术应用开辟新途径。

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该项目获得了德国研究基金会（DFG；SPP 2330 项目编号 464500427，RTG 2355 项目 11，以及 RTG 2937（项目编号 505997786））和马克斯·普朗克学会（授予 K.H. 的马克斯·普朗克研究组组长资助）的资助。

<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
<li>Adler, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+CRISPR-Cas13a+enables+efficient+phage+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing.</a> Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).</li>
<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

KH 和 NP 已为“噬菌体工程”提交欧洲专利申请，欧洲专利申请号为 23 175 257.7。其他作者声明无竞争利益。

本研究提出了一种高效且可适应的策略，用于在噬菌体基因组中引入精确的点突变，包括单核苷酸改变。该实验流程的核心是在每个阶段整合严格的验证步骤，这对于确保基因组编辑的准确性和效率至关重要。鉴于该流程具有多步骤特性，以及噬菌体与其细菌宿主之间存在动态相互作用，这些因素引入了大量可能直接影响噬菌体诱变成功率的变量，因此验证尤为关键。这些因素包括但不限于：I）靶标DNA区域的可及性，II）CRISPR相关核酸酶的活性，III）在大肠杆菌（E. coli）宿主菌株中进行CRISPR-Cas介导诱变时供体DNA的稳定性，IV）由于自然选择或进化导致所需突变的丢失，以及V）噬菌体感染周期短暂所带来的时间限制。这些参数最终可能影响所述基因组编辑方法的整体效率。
下文将讨论这些潜在的影响因素，强调工作流程中的关键步骤，并提出可能的解决方案以应对这些挑战。
首个关键的验证步骤是立即验证 NgTET 处理后 DNA 去修饰的效果，可通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）或 CRISPR-Cas 切割实验实现。该步骤对于确认酶活性以及推...

噬菌体是一类特异性靶向细菌的病毒。由于其在生物技术和医学领域，特别是在对抗多重耐药细菌方面具有巨大潜力，噬菌体已引起广泛的研究关注1,2,3。尽管如此，噬菌体生物学的研究仍相对不足。要充分挖掘其治疗和生物技术应用潜力，深入理解噬菌体劫持细菌宿主的分子机制至关重要4。为了研究高效噬菌体感染背后的分子机制，并进一步对噬菌体进行工程化改造以用于特定应用，必须具备对噬菌体基因组进行遗传修饰的能力。然而，这仍是噬菌体生物学领域中最重大的挑战之一3,5,6。
噬菌体DNA通常通过嘌呤和嘧啶碱基的特定化学修饰而发生改变，例如胞嘧啶的糖基化和甲基化。这些修饰可保护噬菌体遗传物质不被宿主核酸酶识别和降解6。尽管这些修饰对噬菌体的适应性至关重要，但它们却对依赖DNA靶向系统的噬菌体基因组工程方法构成了重大障碍2,3,7。
现有的诱变策略，包括限制性修饰系统和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白（Cas）技术，在对噬菌体DNA进行修饰时面临重大挑战，原因在于存在如胞嘧啶糖基化等保护性表观遗传修饰8。CRISPR-Cas介导的基因组编辑在细菌和真核细胞中具有高度有效性，其依赖于两个关键步骤：首先由Cas核酸酶在基因组靶位点精确切割DNA，随后通过与携带目标突变的供体DNA进行同源重组实现DNA修复1。然而，在噬菌体中，DNA修饰通常会阻碍Cas核酸酶有效结合或切割基因组。此外，噬菌体复制过程快速且短暂，也可能进一步限制同源重组的效率。这些障碍使得将靶向DNA的CRISPR-Cas技术应用于噬菌体诱变尤为困难。已有研究证实，噬菌体DNA修饰可在体外（in vitro）和体内（in vivo）显著削弱CRISPR-Cas对噬菌体DNA的靶向能力6,7。
为应对噬菌体中保护性DNA修饰带来的挑战，我们提出一种基因组诱变策略，该策略利用十一种易位（ten-eleven translocation, TET）甲基胞嘧啶双加氧酶（特别是NgTET）的活性。在真核生物中，TET酶通过逐级氧化反应催化甲基化胞嘧啶的转化：甲基胞嘧啶（5mdC）首先被转化为羟甲基胞嘧啶（5hmdC），然后转化为甲酰基胞嘧啶（5fdC），最终转化为羧基胞嘧啶（5cadC）（图1）。
在我们的噬菌体诱变方法中，NgTET 用于暂时降低保护性 DNA 修饰的丰度，从而增强噬菌体 DNA 对基因组编辑工具（如 Cas 酶）的可及性9。选择 NgTET 来调控噬菌体基因组，是基于先前报道其在异源细菌宿主（尤其是 E. coli）中能够成功表达为有活性的可溶性蛋白。这一特性至关重要，因为 NgTET 必须在噬菌体感染过程中保持活性10。
<img alt="TET双加氧酶介导的真核生物dC代谢；脱羧过程；化学结构示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：TET双加氧酶对5-甲基胞嘧啶的逐步氧化1。 TET双加氧酶催化5-甲基-2′-脱氧胞苷（5mdC）依次氧化为5-羟甲基-2′-脱氧胞苷（5hmdC）、5-甲酰基-2′-脱氧胞苷（5fdC），最终生成5-羧基-2′-脱氧胞苷（5cadC）。终产物5cadC可通过非酶促或酶促途径回复为未修饰的胞苷（dC），从而参与动态的表观遗传调控。该多步反应过程在真核生物主动DNA去甲基化中起核心作用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
由于甲基胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶是噬菌体DNA超修饰（包括糖基化等大体积保护性结构）的常见前体，因此可利用TET双加氧酶的氧化活性来阻止这些DNA超修饰的形成9。在基于TET的基因组诱变方法中，我们在E. coli中异源表达重组NgTET，以在噬菌体感染过程中氧化噬菌体基因组中的羟甲基胞嘧啶，从而阻止大体积糖基化的形成。通过降低这些大体积DNA修饰的丰度，该方法可提高噬菌体DNA对CRISPR-Cas核酸酶的可及性。这种增强的可及性有助于实现高效靶标识别、精确DNA切割，并在噬菌体基因组中引入无痕点突变，从而区别于依赖基因缺失、报告基因插入或人工连接子整合以进行基于PCR的突变体筛选的传统噬菌体诱变方法1,11。迄今为止，这些传统策略是噬菌体基因组靶向诱变唯一可用的工具，因此为本文所介绍的方法提供了重要基础。然而，单个噬菌体蛋白可能具有多种功能。删除编码目标蛋白的整个基因会破坏其所有相关功能。相比之下，靶向引入点突变可选择性地失活特定功能，从而实现对其作用的详细分析。目前，许多噬菌体蛋白的功能仍基本未被表征；因此，我们可能忽略了与特定基因相关的其他活性。因此，优先选择一种简约的方法，即仅去除单一功能，同时对整体蛋白造成最小程度的改变12,13。本文所述方法可在不破坏整体基因组结构或功能的前提下实现精确的遗传修饰。以往噬菌体诱变方法的另一主要挑战是效率低下，通常突变率仅为约0.1%1,11。通过本技术，我们提出了首个能够引入单密码子改变的诱变策略，实现了显著的七倍靶向效率提升。结合基于ONT的高通量筛选方法，点突变的检测得以简化，无需筛选大量噬菌体群体即可分离出单个突变体。本文所述的基于TET的诱变策略解决了该领域长期存在的局限性，实现了更可靠的基因组编辑14。
总体而言，该方法不仅可用于深入理解噬菌体感染机制，而且在合成生物学领域也具有重要意义。通过实现对噬菌体基因组的精确高效改造，该方法为定制化设计噬菌体以满足特定应用需求铺平了道路，从而增强了其在生物技术和医学应用中的潜力。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 反应管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 标准管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 开口薄壁聚丙烯管</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm（用于超速离心）</td></tr><tr><td>50 mL 标准管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x GC 缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>F519L</td><td></td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA 上样染料&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>R1161</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Meridian BIOSCIENCE</td><td>BIO-41025</td><td>分子级</td></tr><tr><td>Avanti J-30I 离心机</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>序列号 JKY14M01，https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>硼酸&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>NEB</td><td>R3733S</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化钙</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>7774-34-7</td><td>97%，特纯&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞密度计</td><td>Harvard Biochrom&amp;nbsp;</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>药用级</td></tr><tr><td>一次性玻璃巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>230 mm</td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>10 U/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>dNTP 混合液（每种 dNTP 10 mM）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>内部产品。</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>包含 CRISPR-Cas12/ModA sgRNA 的质粒构建体</td></tr><tr><td>DS-spCas（CRISPR-Cas9 系统）</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>48645（Addgene 附属编号）</td><td>用于构建含间隔序列的 CRISPR-Cas 质粒（CRISPR-Cas9 系统）以进行噬菌体诱变（步骤 3.2）</td></tr><tr><td>用于 T4 感染的大肠杆菌 B 菌株</td><td>DSMZ</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>大肠杆菌（Migula 1895）Castellani 和 Chalmers 1919（DSM 613，ATCC 11303）</td></tr><tr><td>大肠杆菌 BL21 (DE3) 表达菌株，感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>C600003</td><td>表达菌株，感受态细胞。</td></tr><tr><td>大肠杆菌 DH5&amp;alpha; 克隆菌株，感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>18265017</td><td>克隆菌株，感受态细胞。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（无水）&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Flongle 流动池</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>R10.4.1. 化学体系，https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>Gene JET 质粒小提试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA 标准品</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler ULR DNA 标准品&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SM1213</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Master 108</td><td>BIOCOMP</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Heraeus Pico 17 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>Infors HT Minitron 摇床培养箱</td><td>Infors AG</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Carl Roth</td><td>T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-琼脂</td><td>Carl-Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（Luria/Miller）&amp;nbsp;</td><td>Carl-Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>MinION 设备&amp;nbsp;</td><td>Oxfrod Nanopore Technologies</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA&lt;br/&gt; ACAAGCGGTAATGATAC&lt;br/&gt; CAGCT</td><td>用于引入 ModA E165A 点突变并产生黏性末端以进行 Golden Gate 克隆的正向引物（步骤 3.1）</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>IDT</td><td>CATATTACGATAACGA&lt;br/&gt; TGACTATCCGGAAAC</td><td>用于引入 ModA E165A 点突变并产生黏性末端以进行 Golden Gate 克隆的反向引物（步骤 3.1）</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC&lt;br/&gt; AGTAGAAATTAATTTAAA&lt;br/&gt; GTTCTTAGACCCG</td><td>用于生成 CRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13 系统间隔序列以进行噬菌体诱变和反向筛选的正向引物（步骤 3.2 和步骤 4.1）</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT&lt;br/&gt; TTAAATAATTTCTACTGT&lt;br/&gt; TGTAGATGCTAC</td><td>用于生成 CRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13 系统间隔序列以进行噬菌体诱变和反向筛选的反向引物（步骤 3.2 和步骤 4.1）</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 分光光度计&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>NucleoMag 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Machery Nagel</td><td>REF 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>核苷消化混合液&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560（CRISPR-Cas13 系统）</td><td>Addgene</td><td>186236（Addgene 附属编号）</td><td>编码用于反向筛选的 CRISPR-Cas13 系统的质粒（步骤 4.1）</td></tr><tr><td>pCpfl-sp 质粒（CRISPR-Cas12 系统）</td><td>Addgene</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>pCpfl-sp 质粒（CRISPR-Cas12 系统）</td><td>Addgene</td><td>122186（Addgene 附属编号）</td><td>用于构建含间隔序列的 CRISPR-Cas 质粒（CRISPR-Cas12 系统）以进行噬菌体诱变（步骤 3.2）</td></tr><tr><td>PCR 反应管</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>PeqGREEN</td><td>VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&amp;nbsp;</td><td>内部产品。</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>质粒可应要求提供，质粒图谱见 https://zenodo.org/records/10615143&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&amp;nbsp;</td><td>内部产品。</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>用于通过 Golden Gate 克隆构建 pET28a_NgTET_供体 DNA 的质粒（步骤 3.1），质粒&amp;nbsp;可应要求提供，质粒图谱见 https://zenodo.org/records/10615143&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm，带卡扣</td></tr><tr><td>Phusion DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>一碱式</td></tr><tr><td>PowerPac 通用电源</td><td>Bio Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>7528.1</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Quantus 荧光计，QuantiFluor dsDNA 系统</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>RNase A/T1&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0551</td><td>混合液：2 mg/mL RNase A 与 5000 U/mL RNase T1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>用于 DNA 提取的 Roti-Aqua P/C/I&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X985.1</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>SQK-LSK109 连接测序试剂盒</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>无目录&amp;nbsp;编号</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 孔径 Steritop 滤器</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td>250 mL 和 500 mL</td></tr><tr><td>链霉素 50 mg/L</td><td>Carl Roth</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>NeoFroxx GmbH</td><td>57-50-1</td><td>分子生物学级&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>摆动式铝制转子&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶 5 U/&amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>B69</td><td></td></tr><tr><td>试管，厚壁，无边</td><td>Karl Hecht GmbH</td><td>42775054</td><td>100 mm x 18 mm</td></tr><tr><td>热循环仪，T100</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅，VWB2&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>462-0557</td><td>12 L 容量</td></tr></tbody></table>

利用ngtet辅助的crispr-cas系统实现精确的噬菌体诱变

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

噬菌体是一类特异性靶向细菌宿主的病毒，在生物技术和医学领域具有重要应用潜力，尤其在应对多重耐药性感染方面。然而，噬菌体感染背后的分子机制在很大程度上仍未被充分研究。对噬菌体进行精确的位点特异性突变是阐明基因功能及噬菌体-宿主相互作用的有力工具。
然而，噬菌体基因组诱变的一个主要挑战是存在会干扰常规基因组编辑工具（如 CRISPR-Cas）的噬菌体 DNA 修饰。
尽管CRISPR-Cas系统已成功用于多种生物的靶向诱变，但其在噬菌体诱变中的有效性常受到DNA修饰（如胞嘧啶糖基化）的限制。为克服这一障碍，我们开发了一种高效方法，可暂时降低噬菌体DNA修饰的丰度，从而实现高效的CRISPR-Cas靶向并精确地将突变引入噬菌体基因组。具体而言，我们采用了源自Naegleria gruberi（NgTET）的Ten Eleven Translocation（TET）甲基胞嘧啶双加氧酶，该酶可在DNA中对甲基化和羟甲基化胞嘧啶进行逐级去修饰。通过氧化噬菌体DNA中的羟甲基化胞嘧啶，NgTET可阻止后续的胞嘧啶修饰（如糖基化），并显著提高Cas介导的DNA切割效率。
综上所述，本文介绍的无痕且精确的基因组编辑方法能够在维持噬菌体基因组天然基因结构的同时，高效地引入点突变。通过保持完整的转录和翻译框架，该方法最大限度地减少了对复杂调控网络的意外干扰。这对于研究必需或具有多种功能的噬菌体蛋白尤为重要。在不引入外源序列的情况下实现靶向遗传修饰的能力，显著拓展了噬菌体生物学的实验工具箱。该策略不仅有助于开展深入的功能研究，还增强了噬菌体在治疗和生物技术应用中进行理性设计与改造的潜力。

梯度中噬菌体条带的鉴定。 
梯度中噬菌体条带的可见性取决于加载到梯度上初始样品中的噬菌体浓度。当噬菌体浓度足够高时（~&gt;1 × 1011 PFU/mL），可通过从底部用光源照射梯度来清晰观察到条带（见图3）。
然而，在噬菌体浓度较低时，条带可能不易观察。在此情况下，我们建议通过在暗处从试管底部照射光源，重新尝试观察，这有助于检测噬菌体的存在。
如果噬菌体条带仍然不可见，需使用钝头套管小心地从上层开始逐层收集梯度液，每份收集1.5 mL。随后可通过噬菌斑实验分析这些组分，以确定噬菌体浓度。应将噬菌体浓度最高的两份组分合并，用于后续的DNA提取。
<img alt="蔗糖梯度离心示意图，显示T4噬菌体在CsCl梯度中的分离及噬菌体条带的可见性。" class="xf...

本文介绍了一种利用NgTET酶减少噬菌体DNA修饰的实验方案，可实现高效且无痕的CRISPR-Cas诱变。该方法有助于对噬菌体进行遗传改造，推动其在生物技术和噬菌体治疗中的应用。

利用NgTET辅助的CRISPR-Cas系统实现精确的噬菌体诱变

噬菌体是一类特异性靶向其细菌宿主的病毒，在生物技术和医学领域具有重要潜力，尤其在对抗...

我们在分子水平上研究噬菌体感染。这属于基础科学。然而，我们不仅从事基础科学研究，还致力于将这些基础科学发现转化为实际应用，利用这些知识来研究噬菌体感染过程，并将其应用于噬菌体工程和治疗领域。噬菌体研究领域最近最重要的进展之一是发现了细菌的免疫系统。这种免疫系统存在于所有细菌中，它们能够识别或产生用以抵抗噬菌体的工具。然而，噬菌体相当聪明。噬菌体不仅能够识别各种工具，还能开发出使其逃逸宿主免疫系统的工具。其中一种工具就是通过修饰其DNA来实现的。这一点对我们而言尤其重要，因为研究噬菌体为逃避免疫系统而产生的DNA修饰的化学本质具有重要意义，同时也有助于我们最终将这些机制转化为改造噬菌体的工具。在过去的10年中，全球各地的优秀同行开发出了许多出色的技术。其中一项技术就是下一代测序。基于该技术，我们能够对噬菌体以及宿主的完整基因组在分子水平上进行测序。另一方面，质谱技术得以发展，类似于蛋白质组学。CRISPR 是一种出色的工具，现已被应用于生命的各种界。我们目前也正在利用这一技术对噬菌体基因组进行改造。这些只是少数几种已经重塑了我们当今对噬菌体认知的杰出技术。当我们谈到当前面临的挑战时，其中一个挑战就是噬菌体基因组的CRISPR生物工程。噬菌体基因组经过了完全的DNA修饰，而CRISPR核酸酶实际上无法切割这类DNA。因此，如果我们想要对噬菌体的基因组进行改造，这确实是一个需要克服的重大挑战。我们课题组发现了一种全新的RNA结构单元。我们发现，某些特定转录本在其5'末端携带一种称为氧化还原辅因子的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。最近，我们首次在大肠杆菌T4噬菌体的相互作用中也发现了这一现象。基于这一发现，我们还确定了RNA与蛋白质之间存在一种全新的相互作用方式。我们发现，此前描述的NAD分子可像分子胶水一样，将RNA与蛋白质连接在一起。这种RNA关联方式是自然界中RNA与蛋白质相互作用的一种全新模式。我们在生态抗噬菌体相互作用中做出了这一发现。现在，我们还迫切希望将这种基础科学转化为应用，例如应用于基于RNA的治疗领域。首先，用20单位的DNA酶I处理500微升噬菌体悬液。加入2 µL AT1 RNA混合物至离心管中。将处理后的混合物在37°C孵育30分钟。接着，将500 µL处理后的噬菌体溶液加至已制备好的蔗糖梯度顶部。在 4 摄氏度下，以 70,000 G 离心 20 分钟。从离心管底部用光照射，以观察梯度中浑浊的噬菌体条带。然后用钝头套管小心地将含有噬菌体的组分转移至新的超速离心管中。现在，向离心管中加入 30 毫升预冷的 TM 缓冲液，然后离心。弃去上清液后，将沉淀物重悬于 500 微升 TM 缓冲液中。将重悬的噬菌体于 4 摄氏度下在玻璃小瓶中保存过夜。向重悬的噬菌体中加入一微克蛋白酶K。将混合物在37摄氏度孵育30分钟。然后向样品中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液。倒置以充分混匀，然后离心。将水相转移至新的反应管中，并重复提取三次。使用等体积氯仿进行三次反向提取，以去除残留的苯酚。然后加入0.1体积的3摩尔乙酸钠（pH 5.5）和2.5体积的乙醇，使DNA沉淀。将混合物在-20摄氏度下孵育过夜。第二天，在4摄氏度下以15,000 ×g离心1小时，使DNA形成沉淀。用200微升70%乙醇洗涤DNA沉淀两次。轻轻振荡离心管，再次离心。小心移除上清液。然后，将纯化的DNA重悬于超纯水中，于-20摄氏度保存备用。接种已转化含有PET 28 NGTet质粒以及CAS 12或CAS 9表达质粒的大肠杆菌BL 21D 3细胞。在含有适当抗生素的 LB 培养基中，37 摄氏度振荡培养。加入 0.05 毫摩尔的 IPTG 以诱导 NG TED 表达，并在 37 摄氏度继续孵育两小时。作为对照，比较大肠杆菌 BL21 D3 菌株在过表达 NgTET 与不表达 NgTET 的情况。将300微升的大肠杆菌培养物转移至无菌离心管中。以感染复数为0.01的T4野生型或NgTET处理的噬菌体感染培养物。轻轻混匀以确保噬菌体均匀分布，然后再次孵育。将细菌与噬菌体混合物加入含有0.75%琼脂和抗生素的4毫升LB软琼脂中。充分但轻柔地混匀，避免产生气泡。将软琼脂混合物倒入预热的LB琼脂平板上。将平板在室温下短暂静置使其凝固，随后在37摄氏度下孵育过夜。次日，计数噬菌斑以确定噬菌斑形成单位的数量。对于反向筛选，使用待筛选的噬菌体感染大肠杆菌（E.coli）cast 13 A间隔序列。在与诱变实验相同的条件下进行反向筛选。孵育后，将SUP上清液通过0.45微米滤膜过滤，以去除细菌碎片。将经过反向筛选并过滤的噬菌体用于在大肠杆菌B株上进行噬斑实验，以分离单个噬斑用于后续验证。当T4噬菌体样品充分浓缩时，噬菌体条带清晰可见。通过SDS噬菌体实验证实了NgTET蛋白在大肠杆菌（E.coli）中的表达，结果显示在细胞裂解和离心后，该蛋白存在于可溶性和不溶性组分中。色谱图显示，野生型与经NgTET处理的T4噬菌体DNA中，二氧腺苷、二碘羟基喹啉和胸苷的相对丰度保持不变。与未经处理的样本相比，经 NgTET 处理的噬菌体 DNA 中修饰的胞嘧啶衍生物丰度显著降低。通过黄金门克隆技术构建了包含 NgTET 基因及用于靶向诱变同源区域的质粒。PCR 筛选证实，在琼脂糖凝胶的第 2 至第 9 泳道中成功扩增出目标基因 mare，表明所挑选的噬菌斑中存在阳性克隆。在野生型 T4 噬菌体 DNA 中，5-糖基羟乙基-2′-脱氧尿苷的相对丰度较高。在经 NgTET 处理的 T4 噬菌体 DNA 中，5-糖基羟乙基-2′-脱氧尿苷的水平相较于野生型显著降低。而用催化失活突变体 NgTET D234A 处理的 T4 噬菌体 DNA 则仍保持较高的 5-糖基羟乙基-2′-脱氧尿苷水平。与野生型相比，回收的T4噬菌体子代中5-羟甲基-2′-脱氧尿苷的水平几乎恢复至正常。

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科研

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Bioengineering

生物工程

使用 NgTET 辅助 CRISPR-Cas 系统进行精确噬菌体诱变

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。...

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

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CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas...

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

本文介绍了一种优化CRISPR-Cas9系统以在不降低靶上活性的前提下提高其特异性的实验方案。我们采用一种名为Sniper-screen的定向进化方法，筛选具有理想特性的Cas9突变体。Sniper-Cas9可与截短的单导向RNA（truncated single-guide...

利用 Sniper-Cas9 通过定向进化在不损失靶上活性的前提下最小化 CRISPR-Cas9 的脱靶效应

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利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

本研究提供了一种基于CRISPR/Cas9核糖核酸酶的蝗虫纯合突变体构建的系统优化流程，以及蝗虫卵的冷冻保存与复苏的详细方法。...

利用CRISPR/Cas9技术构建飞蝗纯合突变体

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

学习利用NgTET酶辅助CRISPR-Cas系统对噬菌体进行精确无疤痕诱变的方法。该技术通过减少DNA修饰，实现高效的噬菌体基因组工程，为噬菌体治疗和生物技术应用开辟新途径。

利用NgTET辅助的CRISPR-Cas系统实现精确的噬菌体诱变

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