使用 NgTET 辅助 CRISPR-Cas 系统进行精确噬菌体诱变

我们在分子水平上研究噬菌体感染。这确实是基础科学。然而，我们不仅在做基础科学，我们还热衷于将这一基础科学转化为应用，我们将这些知识用于研究噬菌体感染，并将其用于噬菌体工程和治疗应用。

噬菌体研究领域的最新发展之一是细菌免疫系统的发现。这种免疫系统存在于所有细菌中，它们识别或生成了真正对抗噬菌体的工具。然而，噬菌体非常聪明。

噬菌体也能够识别工具，并开发出使他能够逃脱这些免疫系统的工具。而其中一种工具，其实就是通过修饰来修饰它的DNA。这对我们来说尤其有趣，因为研究噬菌体为逃避免疫系统而产生的这些 DNA 修饰的化学性质真的很有趣，也让我们成为最终设计噬菌体的工具。

在过去的 10 年里，全球各地的优秀同事开发了出色的技术。例如，其中一项技术是下一代测序。基于这项技术，我们可以真正对噬菌体进行测序，也可以在分子水平上对整个宿主基因组进行测序。

另一方面，质谱法，类似蛋白质组学的东西被开发出来。CRISPR 是一个很棒的工具，现在被应用于各个生命王国。我们现在也在用它来设计噬菌体基因组。

这些只是一些奇妙的技术，它们重塑了我们今天对噬菌体的看法。当我们谈论当前的挑战时，我们看到的挑战之一是噬菌体基因组的工程生物 CRISPR。噬菌体基因组完全通过 DNA 修饰进行修饰，而 CRISPR 核 ACE 实际上无法切割 DNA。

因此，如果我们想设计细菌噬菌体的基因组，这确实是我们需要克服的挑战。我的小组发现了一种全新的 RNA 构建块。我们发现特定的转录本在其五个主要末端携带，即所谓的氧化还原幽灵、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸短 NAD，我们最近也首次在大肠杆菌 T4 噬菌体相互作用中发现了这一点。

基于这一发现，我们还发现RNA和蛋白质可以以一种全新的方式相互作用。我们发现我之前描述的这种 NAD 就像分子胶一样将 RNA 和蛋白质相互连接起来。这种 RNA 兴高采烈是 RNA 和蛋白质在自然界中相互作用的一种全新方式。

我们在生态抗噬菌体相互作用方面取得了这一发现。我们现在也热衷于将这一基础科学转化为应用，例如，进入基于 RNA 的治疗领域。首先，用 20 单位的 DNA 1 处理 500 微升噬菌体悬液。

将两微升混合的 RNA AT1 加入管中。将处理过的混合物在37摄氏度下孵育30分钟。接下来，将 500 微升处理过的噬菌体溶液加载到准备好的蔗糖梯度之上。

在4摄氏度下以70， 000 G离心梯度20分钟。从底部点亮离心管，以观察梯度中的混浊噬菌体条带。然后用钝插管小心地将含有噬菌体的部分取出到新的超超速离心管中。

现在，将 30 毫升冰冷的 TM 缓冲液加入管中并离心。然后在弃去上清液后将沉淀重悬于 500 微升 TM 缓冲液中。将重悬的噬菌体储存在四摄氏度的玻璃瓶中过夜。

将一微克蛋白酶K加入重悬的噬菌体中。将混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。然后向样品中加入等体积的苯酚氯仿、异戊醇混合物。

倒置以充分混合并离心。将水相转移到新的反应管中，重复萃取三次。使用等体积的氯仿进行三次氯仿反提取，以去除残留的苯酚。

然后通过加入 0.1 体积的 PH 5.5 三摩尔乙酸钠和 2.5 体积的乙醇来沉淀 DNA。将混合物在零下20摄氏度下孵育过夜。第二天，将样品在 15， 000 G 下在 4 摄氏度下离心一小时以沉淀 DNA。

用 200 微升 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀两次。轻轻摇动试管并再次离心。小心地除去上清液。

然后复苏，将纯化的DNA悬浮在超纯水中。将 DNA 储存在零下 20 摄氏度直至进一步使用。接种用 PET 28 NGTet 质粒和 CAS 12 或 CAS 9 表达质粒转化的大肠杆菌 BL 21D 3 细胞。

在 37 摄氏度下在补充适当抗生素的 LB 培养基中摇晃培养物。通过加入0.05毫摩尔IPTG诱导NG TED表达，并在37摄氏度下再孵育两个小时。作为对照，比较有和没有 NgTET 过表达的大肠杆菌 BL 21 D3 菌株。

将 300 微升大肠杆菌培养物转移到无菌管中。用 T4 野生型或 NgTET 处理的噬菌体感染培养物，感染倍数为 0.01。轻轻混合以确保噬菌体分布均匀，然后再次孵育。

将细菌噬菌体混合物加入含有0.75%螺旋钻和抗生素的4毫升LB软螺旋钻中。彻底混合，但要轻柔，以避免形成气泡。将软螺旋混合物倒在预热的 LB 螺旋钻板上。

让板在室温下短暂凝固，并在37摄氏度下孵育过夜。第二天，计算斑块以确定斑块形成单位的数量。对于反选择，使用要反选择的噬菌体感染大肠杆菌铸造 13 A 间隔区。

在用于诱变的相同条件下执行计数器选择。孵育后，通过0.45微米过滤器过滤SUP入质物以去除细菌碎片。使用计数器选择和过滤的噬菌体对大肠杆菌 B 菌株进行斑块测定，以分离单个斑块以进行下游验证。

当T4噬菌体样品足够浓缩时，噬菌体条带清晰可见。SDS 噬菌体证实了 NgTET 蛋白在大肠杆菌中的表达，显示其存在于细胞裂解和离心后的可溶性和不溶性组分中。色谱图显示，野生型和NgTET处理的T4噬菌体DNA中二氧腺苷、二碘羟基喹啉和胸苷的相对丰度没有变化。

与未处理的样品相比，NgTET处理的噬菌体DNA中修饰的胞嘧啶衍生物的丰度显着降低。使用金门克隆构建含有NgTET基因和靶向诱变的同源区域的质粒。PCR 筛选证实，在 agros 凝胶的第二到第九泳道中成功扩增了靶基因母马，表明采摘的斑块中呈阳性命中。

野生型T4噬菌体DNA中，5糖基羟乙基2优质脱氧丁相对丰度较高。在 NgTET 处理的 T4 噬菌体 DNA 中，与野生型相比，5 种糖基羟乙基 2 主要脱氧定的水平显着降低。用催化非活性突变体 NgTET D234 A 处理的 T4 噬菌体 DNA 保留了高水平的 5 乙醇羟乙基 2 主要脱氧丁。

与野生型相比，回收的 T 4 噬菌体后代显示出几乎恢复的 5 羟甲基 2 主要脱氧定水平。