Name: 利用基于影像的染色质和表观遗传衰老生物标志物测量单细胞衰老 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解基于影像的染色质和表观遗传衰老生物标志物技术，用于单细胞分辨率下量化衰老与年轻化过程。该方法为非破坏性、可重复测量，适用于大规模纵向研究。

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感谢Terskikh实验室所有现任和前任成员在建立实验方案和计算框架过程中提供的帮助。本研究得到了美国国立卫生研究院资助R21 AG068913、R21 AG075483、R21 AG083782，以及华盛顿州卫生部未来健康研究与创新基金（BU/PG: 01760/47004300）对A.V.T.的支持。

所有动物实验均按照斯克里普斯研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的指南和方案（方案编号 09-0004-6）进行。本论文中展示的数据均来自雄性 i4F 小鼠，年龄范围为 2 至 14 个月。用于实验的器官（肝脏和骨骼肌）取自经低剂量多西环素（0.2 mg/ml）处理 1 周的 13.8 月龄 i4F 小鼠及其同窝对照小鼠14。细胞核样本来自年轻小鼠（3.2 个月）、年老小鼠（13.8 个月）以及经多西环素处理以过表达 OSKM 因子的年老小鼠（aged-OSKM）。
1. 样品成像
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>从刚解剖的小鼠（或其他目标物种）中取出目标器官（肝脏和骨骼肌），并用液氮速冻。将样品储存于 -80 °C，待使用时取出。</li>
		<li>将器官和组织转移至预冷的研钵中，并置于干冰上。向冷冻组织上倾倒液氮，使用预冷的研杵进行研磨。持续用预冷的研钵和研杵研磨，直至获得均匀细腻的粉末。</li>
		<li>使用预冷的金属刮勺将研磨后的组织分装至多个离心管中，未使用的样品储存于 -80 °C。 
		注：研磨后的组织样品可长期保存于 -80 °C，或直接进行细胞核分离。</li>
		<li>使用市售的细胞核裂解缓冲液试剂盒，按照制造商说明书从冷冻分装样品中提取细胞核。</li>
		<li>使用台盼蓝对细胞核进行计数。在另一离心管中将细胞核与台盼蓝按等体积混合。取 10 µl 细胞核-台盼蓝混合液，加入血细胞计数板或自动细胞计数仪中。</li>
		<li>用 PBS + 0.5% BSA 稀释样品，使每孔可接种 10,000 个细胞核，接种体积为 20–30 µL/孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种准备
	<ol>
		<li>将所有与接种准备和计算分析相关的元数据录入“接种图谱”（见补充文件 1）。在 sampleID 标签页中，按照实际孔板的布局记录样品标识符（如数字或字符）。在 condition 标签页中，同样按照实际孔板布局记录实验条件，包括样品的年龄。 
		注：condition 标签页中提供的信息将用于识别每个样品的年龄组别（即年轻或年老）。这些识别出的年龄组别将作为构建衰老（ImAge）预测模型的参考依据。因此，condition 标签页必须包含可与年龄相关联的数据，以及必要时的其他相关实验条件。</li>
		<li>在 channel#（# 替换为数字）标签页中，按照实际孔板布局记录目标生物标志物（如 H3K27me3）。确认所有元数据组合匹配无误，并在 platemap 标签页中以连续表格形式正确呈现。 
		注：表格中的每一列应对应一个指定的标签页名称（如 &#34;sampleID&#34;）。另提供一个名为 &#34;metadata&#34; 的标签页，用于记录项目目标和染色细节；该信息不会用于数据分析。可根据需要使用此标签页。</li>
		<li>将 platemap 标签页导出为 csv 文件格式，并使用简短且具有描述性的项目名称命名（如 project.csv）。 
		注：metadata 标签页提供了一个模板，用于汇总项目目标和免疫染色信息。在接种过程中，Platemap 模板中的 metadata 标签页为可选使用。但 sampleID、channel#（# 替换为数字）等其他标签页是进行计算分析所必需的。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在孔板（如 384 孔板）中每孔接种 10,000 个细胞核，接种体积为 20–30 µL。在 4 °C 下以 1,000 × g（加速度 9，减速度 4）离心 10 分钟。</li>
	<li>加入等体积的 8% 多聚甲醛（PFA）PBS 溶液固定，室温孵育 10 分钟。 
	警告：PFA 操作应在通风橱中进行，并按照机构安全规程处理废弃物。</li>
	<li>移除溶液。加入 30 µL PBS 配制的 0.1 M 甘氨酸，室温孵育 5 分钟。移除溶液后，用 100 µL PBS 洗涤 2 次，最后加入 30 µL PBS 用于储存。 
	注：细胞可储存于 4 °C，或立即进行免疫标记。</li>
	<li>免疫标记
	<ol>
		<li>移除 PBS。加入 30 µL 封闭液（含 2% BSA 和 0.5% Triton X-100 的 PBS），室温孵育 1 小时。移除封闭液。</li>
		<li>加入 25 µL 一抗：Mouse anti-H3K27ac（1:250）和 Rabbit anti-H3K27me3（1:250），用封闭缓冲液（0.4–2 µg/mL）稀释。4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>移除一抗溶液。用 100 µL PBS 室温洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
		<li>加入 25 µL 二抗：Alexa 488 Donkey Anti-Mouse（1:250）和 Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit（1:250），用封闭缓冲液（1–10 µg/mL）稀释。4 °C 孵育 2 小时，或室温孵育 1 小时。</li>
		<li>用 100 µL PBS 室温洗涤 3 次，每次 3 分钟。加入 DAPI/Hoechst 染色，浓度为 0.01 mg/mL，体积为 30 µL。再用 100 µL PBS 洗涤。 
		注：将孔板用铝箔包裹后储存于 4 °C，或立即进行成像。DAPI/Hoechst 染色是细胞核分割步骤所必需的。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像
	<ol>
		<li>使用高内涵成像仪进行细胞成像，以获得最高分辨率（本数据集使用 20x 物镜，但推荐使用 63x）。 
		注：尽管可使用任意高内涵成像仪，本方案假设图像采集后采用扁平文件夹结构，且输出图像格式为通用格式（如 .tiff）（图 2）。</li>
		<li>每孔采集多个视野和多个 z 轴层叠图像，理想情况下应覆盖细胞核的顶部到底部。沿 z 轴 10 µm 的覆盖范围（例如，0.5 µm 步长，共 20 层 z 切片）通常足以覆盖大多数小鼠细胞核。所需尺寸和覆盖范围取决于目标物种和细胞类型。代表性成像结果见 图 3。</li>
		<li>将成像数据转移至用于计算分析的计算机中，文件夹结构应遵循 图 2 所示。</li>
		<li>将步骤 1.2.2 中定义的项目名称前缀加上方括号标注，添加至图像数据文件夹名中（例如，[project]original_folder_name）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 成像数据的计算分析
<ol>
	<li>系统软件需求准备（仅初始设置时需要）
	<ol>
		<li>如果在 Windows 计算机上操作，请按照 https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install 的说明安装 Windows 子系统 for Linux (WSL)。请按照 https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main&#160;的说明安装 Anaconda 或 Miniconda。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算环境准备（仅初始设置时需要）
	<ol>
		<li>从 GitHub 仓库下载工作流程脚本&#160;https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow。解压下载的文件。 
		注意：数据存储位置可任意指定；但建议选择与系统文件存储位置（例如 Windows 上的 C 盘）不同的目录。</li>
		<li>整理克隆的 ImAge 仓库，使其符合脚本正确执行所需的文件夹结构（图 2）。</li>
		<li>如果在 Linux 或 macOS 上操作，请打开终端应用程序；如果在 Windows 上操作，请打开 WSL 应用程序。</li>
		<li>将当前目录切换至克隆的仓库文件夹。此后，“命令：”表示将后续代码复制粘贴到终端应用程序中，然后按 Enter 键。 
		命令：cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main 
		注意：请将 &#34;/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY&#34; 替换为用户特定的路径设置。例如，若仓库解压在 D 盘的 &#34;analysis&#34; 文件夹中，并通过 WSL 访问，则应为 &#34;/mnt/d/analysis&#34;。</li>
		<li>使用 conda（随 Anaconda/miniconda 安装的命令行工具）创建 Python 3.10 版本的新计算环境。 
		命令：conda create -n ImAge_workflow python=3.10</li>
		<li>激活新创建的环境。 
		&#8203;命令：conda activate ImAge_workflow</li>
		<li>使用 pip 安装程序（在创建 ImAge_workflow 环境时已安装的 Python 包安装工具）安装 poetry（Python 包管理器）。 
		&#8203;命令：pip install poetry</li>
		<li>使用 poetry 安装所需的 Python 软件包。 
		命令：poetry install 
		&#8203;警告：请确保当前目录为 ImAge_workflow 文件夹，可通过运行命令 pwd 进行验证。</li>
		<li>在 Conda 环境中配置 CUDA，以在分割步骤中启用图形处理单元（GPU）功能，从而加快计算速度（仅适用于配备 Nvidia GPU 的 Linux 或 Windows 计算机）。 
		命令：mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d 
		echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c &#34;import nvidia;print(nvidia.__file__)&#34;))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh 
		echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; do if [ -d &#34;$dir/lib&#34; ]; then export LD_LIBRARY_PATH=&#34;$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH&#34;; fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh 
		&#8203;注意：脚本会自动检测服务器上的 GPU 可用性。若无可用 GPU，将默认在 CPU 上运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下说明运行计算。 
	注意：计算分析包括四个步骤：细胞核分割、图像特征提取、衰老（ImAge）轴构建以及 ImAge 预测。每个过程均通过 Python 脚本执行：o1_illumination_correction、o2_segmentation、o3_extract_features 和 o4_ImAge_validation。所有这些步骤均包含在一个 Python 脚本 main.py 中。提取的 ImAge 读数可通过箱形图和小提琴图进行可视化（如 图 4 所示）。ImAge 读数也可导出为简单的表格格式（标准 .csv 文件格式），其中样本作为行，相应的读数和元数据作为列。用户可根据需要对 ImAge 读数进行额外的数值分析。这些图表和 CSV 文件可通过一个 Python 脚本 visualization.py 获得。ImAge 预测过程利用来自同一组织内单个细胞的自举信号。这些自举信号是通过对随机采样进行重复迭代得到的平均信号。该方法旨在确保分析捕捉到最可靠且具有代表性的读数，其分析不确定性与组织固有的异质性成正比。
	<ol>
		<li>如果在 Linux 或 macOS 上操作，请打开终端应用程序；如果在 Windows 上操作，请打开 WSL 应用程序。 
		命令：cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main 
		&#8203;警告：请确保当前目录为 ImAge_workflow 文件夹，可通过运行命令 pwd 进行验证。</li>
		<li>激活环境。 
		&#8203;命令：conda activate ImAge_workflow</li>
		<li>在代码或文本编辑器（例如记事本应用程序、Microsoft Visual Studio Code 等）中配置 workflow/main.py 文件中的分析参数。
		<ol>
			<li>将变量 p 设置为一个简短、文件系统安全的标识符，用于组织输出（例如 p = brain_3ages_k27me3）。</li>
			<li>在 chs 中设置用于特征提取的通道列表。如果需要从该通道获取特征用于分析，则包括分割通道（chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']）。</li>
			<li>使用 imageIndex 将图像通道标识符从文件名映射到板图（platemap）列。确定成像系统用于获取图像数据的通道标签格式，并将该标签用作键。将每个标签映射到步骤 1.2.2 中保存的板图文件中确切的、区分大小写的列标题（例如 imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}）。 
			警告：列名区分大小写，必须与您的板图文件一致。</li>
			<li>设置数据位置：orgDataLoadPath 指向数据集根目录，如有必要，orgDataSubFolder 指向图像子文件夹，resultsSavePath 指向输出根目录。</li>
			<li>确认 imageFileFormat 中的文件名扩展名，并编辑 imageFileRegEx，使用 Python 命名捕获组表示所有必需部分：row、col、field、zposition 和 channel。使用以下语法：(?P&#60;GROUP&#62;\d+)，其中 GROUP 替换为 row、col、field、zposition 或 channel。 
			注意：如果文件名不同，请更新正则表达式；所有命名组必须能正确解析。例如，文件名 r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff 应转换为以下形式：r(?P&#60;raw&#62;\d+)c(?P&#60;col&#62;\d+)f(?P&#60;field&#62;\d+)p(?P&#60;zposition&#62;\d+)-ch(?P&#60;channel&#62;\d+)sk1fk1fl1\.tiff。</li>
			<li>将 segmentation_ch 设置为用于对象检测的核通道（例如 segmentation_ch = 'DAPI'）。</li>
			<li>通过设置 illumiCorrection 决定是否使用照明校正。设为 True 以计算并应用 BaSiC 模型；设为 False 以处理原始图像。 
			注意：对于包含 ≥ 25 个孔的板，建议进行照明校正以减少系统性偏差。</li>
			<li>以微米为单位设置物理体素尺寸 voxel_dim，格式为 [z, y, x]。使用显微镜元数据确定间距（例如 voxel_dim = [1.0, 0.6, 0.6]）。验证每个参数后保存文件并关闭编辑器。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>运行脚本以获取 ImAge 读数并执行验证。运行脚本期间，请勿关闭终端或 WSL&#160;应用程序。 
		命令：Python workflow/main.py 
		注意：该脚本（main.py）默认包含所有步骤，包括分割、特征提取、ImAge 轴构建和预测。脚本将为每个步骤（例如细胞核分割）生成预计完成时间。每个过程（例如 o1_illumination_correction）将生成 .pickle 格式的中间文件，其中包含各过程的结果。然而，这仅用于进程间的数据传递，以确保标准化处理，本文中不建议用户直接操作这些文件。尽管如此，如果用户需要操作或采用这些文件，请参阅每个 Python 函数中包含的文档以了解数据形状和类型13。</li>
		<li>可视化结果，并将原始 ImAge 读数导出以供外部软件进行进一步分析。命令：Python workflow/visualization.py 
		注意：此步骤生成 ImAge 读数的图表和表格，文件分别位于 fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN 和 export_o4_ImAge_validation 文件夹中（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Alvarez-Kuglen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImAge+quantitates+aging+and+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Aging%22%5BJournal%5D)">ImAge quantitates aging and rejuvenation.</a> Nat Aging. 4, 1308-1327 (2024).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

样品制备 
进行样品制备时，应迅速采集目标组织并立即在液氮中速冻。使用研钵和研杵研磨组织时，可使用研钵硅胶盖以防止样品损失。若组织难以粉碎，可添加更多液氮。对于较脆弱的组织，也可直接使用新鲜样品（而非冷冻样品）进行处理，以减少机械破坏或组织损伤。细胞核分离方案可能需要根据组织类型进行优化；请参考生产商的说明书。在分离并计数细胞核后，确保在384孔板中每孔的加样体积至少为20 µL，以完全覆盖孔底并保证分布均匀。
铺板准备 
将细胞核悬浮于含0.5% BSA的PBS中；对于完整细胞，使用培养基以提高存活率。保持样品置于冰上，并将悬浮液加入每孔中央，避免在边缘聚集。离心前将离心机预冷至4 °C。较慢的减速有助于防止细胞核移向边缘，但会延长转子停止时间。应优化减速参数，以平衡处理时间与样品完整性。通过分批处理样品，尽量缩短铺板与固定之间的时间间隔。固定和淬灭步骤应按照方法中所述保持一致，确保所有样品的表位可及性无差异。一旦完成固定，同一块板可多次离心。避免使用超过1000 × g 的...

随着平均寿命的延长和全球人口老龄化加剧，对功能性或生物学年龄的有效生物标志物的需求日益凸显1,2,3。这些生物标志物对于准确预测疾病风险和寿命至关重要，可显著改善老年医学护理并降低相关成本。尽管DNA甲基化（DNAm）时钟在量化生物学衰老方面已取得显著进展4,5,6，但其通常依赖线性回归方法，并需要大规模队列数据，可能忽略个体特异性的、细微且依赖于具体生物学背景的成分7,8。此外，这类基于测序的技术需要细胞裂解、复杂的样本制备过程，且每个细胞均需使用昂贵的试剂，导致成本较高，在需要高通量、大规模或纵向研究的应用中，样本破坏性成为其主要局限9。
为了克服这些局限性，我们开发了基于成像的染色质和表观遗传年龄（ImAge）技术，这是一种旨在以单细胞分辨率量化衰老与 rejuvenation（重编程）的新方法。该技术已在小鼠外周血及多种实体器官中得到应用和验证，相关研究由 Alvarez-Kuglen 等人1详细描述。本文详细阐述了优化后的实验方案，以便其他研究人员能够根据需要将其适配并应用于各种研究场景。
该方法与传统的DNA甲基化时钟有本质区别，其基于单个细胞核内染色质的空间组织和表观遗传标记来捕捉内在的、与年龄相关的动态轨迹1。基于成像的技术具有显著优势：它本质上是非破坏性的，意味着细胞在处理过程中不会被破坏，而测序方法则通常会破坏细胞。这种非破坏性特征至关重要，因为它能够在单细胞水平上保留染色质和表观遗传标记的空间结构，维持细胞在组织中的空间背景——而这一信息在传统的测序流程中常常丢失。此外，成像技术通常在大规模或纵向研究中更具成本效益，因为它不需要为每个细胞使用昂贵的试剂或进行复杂的文库构建，因而适用于随时间推移的重复观察10,11。
ImAge 的一个关键优势在于，它能够揭示与年龄相关的轨迹，这些轨迹是数据本身固有的主要特征，无需对实际年龄进行回归分析。ImAge 在小鼠外周血单个核细胞及多种实体器官中均表现出与实际年龄的高度相关性1。尤为重要的是，ImAge 能有效捕捉生物年龄的预期扰动：在化疗处理后显示升高，而在热量限制以及通过瞬时表达 OSKM 实现部分重编程的情况下，肝脏和骨骼肌中的 ImAge 水平则下降。此外，在实际年龄相同的小鼠中，ImAge 的读数被观察到与运动活动能力呈负相关，表明其在衡量生物年龄和功能年龄方面具有应用价值。
实施ImAge方法需要具备湿实验操作12和计算分析1（图1）两方面的专业知识；因此，本文提供了这两个方面的全面、逐步操作方案。该优化后的实验流程旨在促进ImAge方法的广泛应用，使研究人员能够在单细胞分辨率下研究多种细胞类型和组织中与年龄相关的染色质及表观遗传结构变化。在本方案中，选择了H3K27ac和H3K27me3这两个能够为ImAge测定提供足够对比度和分辨率的标志物作为代表性标记。研究人员可沿用本方案来量化生物衰老程度、评估长寿干预措施的影响，并在个体水平上探索衰老与重编程过程中的内在异质性。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa 488&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>组蛋白H3K27ac抗体（单克隆抗体）&amp;nbsp;</td><td>Active Motif</td><td>39685</td><td></td></tr><tr><td>组蛋白H3K27me3抗体（多克隆抗体）&amp;nbsp;</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>细胞核分离试剂盒：Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NUC101</td><td></td></tr><tr><td>Operetta CLS 高内涵成像系统</td><td>Revvity</td><td>https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液，电镜级</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384孔微孔板</td><td>Revvity</td><td>6057302</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15250061&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于成像的染色质与表观遗传衰老生物标志物测量单细胞衰老

Measuring Single-Cell Aging with an Imaging-based Biomarker of Chromatin and Epigenetic Aging

为了推进个性化医疗并评估潜在的 rejuvenation（恢复活力）策略，能够反映生物年龄的生物标志物至关重要。我们提出了基于成像的染色质与表观遗传年龄（ImAge），这是一种基于单个细胞核内染色质空间组织和表观遗传标记所衍生的成像型生物标志物，可捕捉内在的与年龄相关的变化。ImAge 能有效捕捉并量化调节生物年龄干预措施的影响，在采用恢复活力策略（如热量限制以及通过短暂表达 Oct4、Sox2、Klf4 和 Myc（OSKM）进行部分重编程）后显著降低，而在化疗等处理后则显著升高，显示出高度敏感性。此外，较低的 ImAge 与较高的运动活性相关，表明其不仅反映生物年龄的逆转，还能捕捉功能上的改善，因而为评估长寿干预提供了一种有前景的单细胞工具。由于 ImAge 是一种整合性方法，需要高质量的成像数据以及精细的计算分析，因此我们旨在提供详尽的操作指南以提取和验证该指标。本综合实验方案将详细阐述湿实验流程（样本制备与成像）以及开源计算流程（环境配置与成像数据处理）的正确使用方法，以实现 ImAge 的提取与验证。

代表性图像应具有足够的细胞密度以获得单个细胞，但各个细胞核之间不应相互接触，否则会降低细胞核分割的质量。图3展示了获得可靠计算分析结果的代表性成像效果。
本方法论文中所述结果改编自Alvarez-Kuglen等人发表的ImAge研究论文1。ImAge成功检测到通过OSKM在体（in vivo）诱导的局部重编程所实现的衰老逆转（图4）。研究分析了i4F小鼠的肝脏和骨骼肌组织，这是一种经基因工程改造的小鼠模型，可诱导表达OSKM因子。这些小鼠接受了低剂量多西环素处理，从而在i4F小鼠中触发OSKM的表达14。根据本实验方案所述方法，对年轻小鼠（3.2个月）、老年小鼠（13.8个月）以及经多西环素处理的老年小鼠（old-OSKM）的细胞核进行免疫标记和成像。年轻组与老年组样本之间ImAge存在显著差异，而old-OSKM组的ImAge较老年组降低，但高于年轻...

本方案介绍了提取和验证基于成像的染色质与表观遗传年龄（ImAge）的成像与计算工作流程。

为了推进个性化医疗并评估潜在的 rejuvenation 策略，能够反映生物年龄的生物标志物至关重要。我们已引入……

我们开发了基于成像的染色质与表观遗传年龄图像技术，这是一种用于在单细胞分辨率下量化衰老与 rejuvenation（重编程）的新方法。DNA甲基化时钟可估算生物年龄，但依赖线性回归，需要大样本队列，且会破坏样本，使其成本高昂，不适用于大规模或纵向研究。首先，将冷冻的器官和组织转移至置于干冰上的预冷研钵中。将液氮倾倒在冷冻的组织上，使用预冷的研钵充分研磨，直至获得均匀细腻的粉末。使用预冷的金属刮勺，将研磨后的组织分装到多个离心管中。提取细胞核后，在另一管中以等比例将其与台盼蓝混合。将10微升混合物转移至血细胞计数板，或加载到自动细胞计数器中。在孔板图中输入并核对所有元数据，包括样本编号、条件和生物标志物，并导出CSV文件。现在，将10,000个细胞核以20至30微升的体积分配至384孔板的每个孔中。将培养板在4°C条件下，以1000g离心10分钟，加速度设为9，减速度设为4。接着，加入等体积的8%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）固定细胞核，在室温下孵育10分钟。去除固定液后，加入30微升PBS配制的0.1摩尔甘氨酸溶液，在室温下孵育5分钟。吸去甘氨酸溶液，用 100 微升 PBS 洗涤各孔两次。移除每孔中的 PBS，加入含 2% BSA 和 0.5% Triton X-100 的 PBS 封闭液 30 微升。室温孵育 1 小时。除去封闭液后，加入25微升一抗溶液，在4摄氏度下孵育样本。接着，用100微升PBS洗涤三次，每次洗涤在室温下持续三分钟。加入25微升二抗溶液，在4摄氏度下孵育两小时。然后，用 100 微升 PBS 洗涤各孔三次，每次洗涤在室温下持续三分钟。通过加入 30 微升浓度为 0.01 毫克/毫升的 DAPI 或 Hoechst 染料对细胞核进行染色，并用 100 微升 PBS 洗涤一次，以去除多余的染料。从 GitHub 仓库下载工作流程脚本。下载完成后，解压缩文件以提取其内容。整理克隆的镜像仓库，使文件夹结构符合工作流程所假设的格式，以确保脚本正确执行。然后，在 Linux 或 Mac OS 系统上打开终端应用程序，或在使用 Windows 系统时打开 WSL 应用程序。在终端中输入相应命令并按 Enter 键，将工作目录更改为已克隆的仓库文件夹。使用 Conda 创建一个名为 Image_workflow 的新计算环境，并指定 Python 版本为 3.10，然后按 Enter 键。通过输入命令 conda activate Image_workflow 激活新创建的 Conda 环境。使用 PIP 安装程序在已激活的环境中安装 Python 包管理器 Poetry。然后，使用 Poetry 安装工作流程所需的所有先决 Python 包。接下来，在 Conda 环境中配置 CUDA，以在分割步骤期间启用图形处理单元功能。打开终端应用程序，并将文件夹切换至克隆的目录。通过输入以下命令并按 Enter 键来激活 Conda 环境。使用代码或文本编辑器（如 VS Code 或记事本）打开工作流主文件，以配置分析参数。通过将变量 p 设置为一个简短且符合文件系统安全规范的标识符，来指定项目名称，以便组织输出结果。在 chs 中设置用于特征提取的通道列表，如果需要从分割通道提取特征，则需包含该分割通道。使用 ImageIndex 并以通道标签作为键，将文件名中的图像通道标识符映射到之前保存的大小写敏感的板图列标题。然后，通过将 orgDataLoadPath 设为数据集路径，根据需要将 orgDataSubfolder 设为图像子文件夹，将 resultsSavePath 设为输出路径，以设置数据位置。确认 imageFileFormat 中的文件名扩展名。接着，编辑 imageFileRegEx，使用 Python 命名的捕获组来提取所需的部分，包括行、列、视野、Z 位置和通道。现在，将 segmentation_ch 中的分割通道设置为用于对象检测的核通道。通过设置 a illumiCorrection 决定是否使用照明校正，设为 true 以计算并应用基础模型。然后，根据显微镜元数据，以 ZYX 顺序在 voxel_dim 中设置以微米为单位的物理体素尺寸。保存文件并在确认每个参数后关闭编辑器。最后，运行工作流脚本以获取图像读出结果并进行验证，在脚本运行期间保持终端打开。可视化结果，并导出原始图像读出数据以用于外部软件中的进一步分析。诱导性多能干细胞的代表性图像显示，细胞核经DAPI染色后清晰分离，同时可见赖氨酸27位三甲基化的组蛋白H3以及赖氨酸27位乙酰化的组蛋白H3。对肝脏和骨骼肌的图像分析显示，年轻样本与老年样本之间存在显著差异，其中老年OSKM小鼠的图像信号较老年对照组减弱，提示发生了部分重编程。对个体动物的分析表明，部分老年OSKM样本的图像信号值显著低于老年对照小鼠。本方案使研究人员能够在单细胞分辨率下研究不同细胞类型和不同组织中与年龄相关的染色质及表观遗传结构的变化。我们基于成像的方法具有非破坏性，可保持染色质结构，并允许重复测量，在大规模或纵向研究中更具成本效益。未来的研究将聚焦于增加更多表观遗传标记，并研究与衰老相关的细胞核内结构。

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科研

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Biology

生物学

利用基于影像的染色质和表观遗传衰老生物标志物测量单细胞衰老

我们介绍了光漂白方法，包括光漂白后荧光恢复（FRAP）和光漂白过程中的荧光丢失（FLIP），用于监测胚胎干细胞（ES细胞）中染色质蛋白的动力学。染色质蛋白动力学被认为是研究染色质可塑性的手段之一，在多能性细胞中其活性增强。...

活体胚胎干细胞中染色质蛋白动态的光漂白实验（FRAP与FLIP）测定

本文介绍了一种优化的实验方案，用于制造微流控芯片以及建立微流控实验，以测量单个酵母细胞的寿命和细胞表型。...

利用微流控装置测量单个出芽酵母细胞的寿命和细胞表型

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，可由多种细胞应激因素诱导。本文描述了诱导细胞衰老的实验方案以及检测衰老标志物的方法。...

诱导与定量细胞衰老的技术

本文讨论了一系列在培养细胞中诱导和验证细胞衰老的实验方案。我们重点关注不同的衰老诱导刺激，并描述了常见的衰老相关标志物的定量方法。我们以成纤维细胞为模型提供了技术细节，但这些方案可适用于多种细胞模型。...

原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证

细胞衰老是慢性年龄相关性疾病发生的关键因素。靶向衰老细胞的治疗策略在延长健康寿命方面展现出广阔前景。本文介绍一种基于单细胞水平检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性的新型筛选方法，用于鉴定senotherapeutics（抗衰老药物）。...

基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物

本文介绍了一种评估纺锤体形成和有丝分裂进程动态变化的实验方案。通过应用延时成像技术，使用者能够识别处于有丝分裂不同阶段的细胞，追踪并鉴定有丝分裂缺陷，并分析在抗有丝分裂药物处理下纺锤体的动态行为及有丝分裂细胞的命运。...

活细胞成像评估有丝分裂纺锤体扰动后中期持续时间动态变化及细胞命运

本方案描述了一种利用可重复使用的单个细胞进行多轮表观基因组分析的单细胞方法。这种可重复使用的单个细胞允许在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记，并对结果进行统计学验证。...

可重复使用的单细胞用于迭代表观基因组分析

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

多重免疫荧光技术可在单个组织切片中实现多种抗体标记物的序贯标记，从而支持对组织结构和细胞群体的空间分析。本文介绍了一种针对衰老相关、结构及免疫标记物的多重检测工作流程，包括手动和自动化载玻片制备、迭代成像，以及利用数字病理学软件进行单细胞分析。...

多重免疫荧光检测法用于衰老标志物的空间评估 体内

本文介绍了一种活细胞LysoTracker实验方案，用于检测IMR-90人成纤维细胞衰老过程中溶酶体的重塑变化。...

利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

该过程结合使用共聚焦显微镜与荧光标记的细胞核及染色质标记品系 拟南芥 同时记录细胞核与染色质动态 拟南芥...

发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

了解基于影像的染色质和表观遗传衰老生物标志物技术，用于单细胞分辨率下量化衰老与年轻化过程。该方法为非破坏性、可重复测量，适用于大规模纵向研究。

利用基于成像的染色质与表观遗传衰老生物标志物测量单细胞衰老

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