利用基于成像的染色质与表观遗传衰老生物标志物测量单细胞衰老

我们开发了基于成像的染色质与表观遗传年龄图像技术，这是一种用于在单细胞分辨率下量化衰老与 rejuvenation（重编程）的新方法。DNA甲基化时钟可估算生物年龄，但依赖线性回归，需要大样本队列，且会破坏样本，使其成本高昂，不适用于大规模或纵向研究。首先，将冷冻的器官和组织转移至置于干冰上的预冷研钵中。

将液氮倾倒在冷冻的组织上，使用预冷的研钵充分研磨，直至获得均匀细腻的粉末。使用预冷的金属刮勺，将研磨后的组织分装到多个离心管中。提取细胞核后，在另一管中以等比例将其与台盼蓝混合。

将10微升混合物转移至血细胞计数板，或加载到自动细胞计数器中。在孔板图中输入并核对所有元数据，包括样本编号、条件和生物标志物，并导出CSV文件。现在，将10,000个细胞核以20至30微升的体积分配至384孔板的每个孔中。

将培养板在4°C条件下，以1000g离心10分钟，加速度设为9，减速度设为4。接着，加入等体积的8%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）固定细胞核，在室温下孵育10分钟。去除固定液后，加入30微升PBS配制的0.1摩尔甘氨酸溶液，在室温下孵育5分钟。

吸去甘氨酸溶液，用 100 微升 PBS 洗涤各孔两次。移除每孔中的 PBS，加入含 2% BSA 和 0.5% Triton X-100 的 PBS 封闭液 30 微升。室温孵育 1 小时。

除去封闭液后，加入25微升一抗溶液，在4摄氏度下孵育样本。接着，用100微升PBS洗涤三次，每次洗涤在室温下持续三分钟。加入25微升二抗溶液，在4摄氏度下孵育两小时。

然后，用 100 微升 PBS 洗涤各孔三次，每次洗涤在室温下持续三分钟。通过加入 30 微升浓度为 0.01 毫克/毫升的 DAPI 或 Hoechst 染料对细胞核进行染色，并用 100 微升 PBS 洗涤一次，以去除多余的染料。从 GitHub 仓库下载工作流程脚本。

下载完成后，解压缩文件以提取其内容。整理克隆的镜像仓库，使文件夹结构符合工作流程所假设的格式，以确保脚本正确执行。然后，在 Linux 或 Mac OS 系统上打开终端应用程序，或在使用 Windows 系统时打开 WSL 应用程序。

在终端中输入相应命令并按 Enter 键，将工作目录更改为已克隆的仓库文件夹。使用 Conda 创建一个名为 Image_workflow 的新计算环境，并指定 Python 版本为 3.10，然后按 Enter 键。通过输入命令 conda activate Image_workflow 激活新创建的 Conda 环境。

使用 PIP 安装程序在已激活的环境中安装 Python 包管理器 Poetry。然后，使用 Poetry 安装工作流程所需的所有先决 Python 包。接下来，在 Conda 环境中配置 CUDA，以在分割步骤期间启用图形处理单元功能。

打开终端应用程序，并将文件夹切换至克隆的目录。通过输入以下命令并按 Enter 键来激活 Conda 环境。使用代码或文本编辑器（如 VS Code 或记事本）打开工作流主文件，以配置分析参数。

通过将变量 p 设置为一个简短且符合文件系统安全规范的标识符，来指定项目名称，以便组织输出结果。在 chs 中设置用于特征提取的通道列表，如果需要从分割通道提取特征，则需包含该分割通道。使用 ImageIndex 并以通道标签作为键，将文件名中的图像通道标识符映射到之前保存的大小写敏感的板图列标题。

然后，通过将 orgDataLoadPath 设为数据集路径，根据需要将 orgDataSubfolder 设为图像子文件夹，将 resultsSavePath 设为输出路径，以设置数据位置。确认 imageFileFormat 中的文件名扩展名。接着，编辑 imageFileRegEx，使用 Python 命名的捕获组来提取所需的部分，包括行、列、视野、Z 位置和通道。

现在，将 segmentation_ch 中的分割通道设置为用于对象检测的核通道。通过设置 a illumiCorrection 决定是否使用照明校正，设为 true 以计算并应用基础模型。然后，根据显微镜元数据，以 ZYX 顺序在 voxel_dim 中设置以微米为单位的物理体素尺寸。

保存文件并在确认每个参数后关闭编辑器。最后，运行工作流脚本以获取图像读出结果并进行验证，在脚本运行期间保持终端打开。可视化结果，并导出原始图像读出数据以用于外部软件中的进一步分析。

诱导性多能干细胞的代表性图像显示，细胞核经DAPI染色后清晰分离，同时可见赖氨酸27位三甲基化的组蛋白H3以及赖氨酸27位乙酰化的组蛋白H3。对肝脏和骨骼肌的图像分析显示，年轻样本与老年样本之间存在显著差异，其中老年OSKM小鼠的图像信号较老年对照组减弱，提示发生了部分重编程。对个体动物的分析表明，部分老年OSKM样本的图像信号值显著低于老年对照小鼠。

本方案使研究人员能够在单细胞分辨率下研究不同细胞类型和不同组织中与年龄相关的染色质及表观遗传结构的变化。我们基于成像的方法具有非破坏性，可保持染色质结构，并允许重复测量，在大规模或纵向研究中更具成本效益。未来的研究将聚焦于增加更多表观遗传标记，并研究与衰老相关的细胞核内结构。