体感神经元中神经元膜蛋白酶体的细胞亚型特异性分析

我们正在研究体感神经元如何通过新近发现的神经元膜蛋白酶体（NNP）进行通讯，从而调控触觉、痒觉和痛觉感知的机制。我们近期发现了神经元膜蛋白酶体，这是一种存在于部分感觉神经元中的特化蛋白质降解复合物，其功能是调节对触觉、痒觉和痛觉的敏感性。通过本实验方案，我们将能够在健康和疾病状态下，以细胞类型特异性的方式研究NMP的表达及其调控动态。

本方案能够将表达NMP的神经元与不表达NMP的神经元分离，从而实现对这些神经元功能的细胞类型特异性研究。重要的是，这些分离后的神经元群体在后续分析中仍保持活性。通过这些方案，我们将开始探究不同神经病理性状态如何影响NMP的表达与功能，以及这种影响如何导致触觉、痒觉和痛觉的异常。

首先，将收获的背根神经节转移至一个15毫升的锥形管中。使用移液器向管中加入7毫升组织解离酶工作液，于37摄氏度轻柔振荡孵育20分钟。将管子放入离心机，以120 ×g离心2分钟，使神经节沉淀。

小心吸除上清液，避免扰动沉淀物。将神经节重悬于7 mL低吹打组织解离酶混合液（含木瓜蛋白酶）中。再次离心后，吸除并弃去上清液。

然后将神经节重悬于500微升的BSA、TI和DMEM溶液中。使用一支1毫升、带塞且经火焰抛光的玻璃移液管，将神经节吹打12至16次。将细胞悬液通过40微米细胞筛网，以滤除细胞碎片。

用一毫升 BSA、TI 和 DMEM 溶液冲洗滤网，以收集残留的背根神经节神经元。将过滤后的细胞悬液转移至 15 毫升锥形管中。用一张较大的 Parafilm 膜铺垫免疫荧光染色托盘，做好准备。

使用无菌的5-45镊子，将盖玻片从组织培养皿转移至Parafilm上，确保含有背根神经节神经元的一面朝上。缓慢地用移液器向每张盖玻片加入100 µL背根神经节培养基，以防止细胞干燥。然后用预热的背根神经节培养基将Go抗PSM alpha 2一抗按1:20比例稀释。

使用装有P10无滤芯吸头的移液器，从每个盖玻片边缘缓慢吸除培养基。向每个盖玻片加入100 µL抗PSMα2一抗溶液，在室温下孵育40分钟。随后，小心吸除每个盖玻片上的一抗溶液。

向细胞中加入 100 µL 室温 PBS，室温孵育 3 分钟以洗涤。现在，为制备二抗，将其用预热的背根神经节培养基按 1:250 的比例稀释。完成第三次洗涤后，向每张盖玻片中加入 100 µL 稀释后的二抗溶液。

将盖玻片在室温下孵育40分钟，同时避免光照。然后吸去盖玻片上的二抗溶液，并用PBS如前所述洗涤细胞3次。最后一次PBS洗涤后，加入100 µL固定液，其中含4%多聚甲醛和4%蔗糖（溶于PBS中）。

将细胞在室温下孵育10分钟后，吸去每个盖玻片上的固定剂。随后按照前述方法用PBS洗涤细胞三次。为了通透细胞，加入100微升含0.1%非离子型去垢剂的PBS溶液。

将盖玻片在室温下孵育五分钟。然后吸去盖玻片上的通透溶液，并用 PBS 按前述方法洗涤细胞三次。向每张盖玻片加入 100 µL 封闭液，封闭液组成为含 5% 胎牛血清和 5% 驴血清的 PBS 溶液。

接下来，将兔抗CGRP抗体、A选择素B4生物素偶联物以及鸡抗NFH抗体用封闭液稀释，配制背根神经节神经元细胞类型特异性的一抗混合液。吸除盖玻片上的封闭液，随后向每张盖玻片加入100 µL配制好的一抗混合液。将盖玻片置于室温避光孵育45分钟。

随后，从盖玻片上移除一抗溶液，并用 PBS 按前述方法洗涤细胞三次。现在，通过将链霉亲和素、驴抗兔抗体和驴抗鸡抗体分别以 1:500 的比例溶于封闭液中，配制二抗混合液。吸除每张盖玻片上的最后一次 PBS 洗涤液，然后加入 100 微升（µL）配制好的二抗溶液。

将盖玻片置于室温下避光孵育45分钟。吸除盖玻片上的最后一次洗涤液。使用细头镊子从帕拉膜上提起每张盖玻片，并用盖玻片边缘轻轻接触无绒纸巾，以吸去多余液体。

在显微镜载玻片上滴加7 µL封片剂。将盖玻片细胞面朝下小心地覆盖在封片剂上，确保与封片剂完全接触。将制备好的载玻片置于避光干燥的抽屉或盒子中，干燥至少一小时。

用快干指甲油密封盖玻片边缘，并在成像前等待10至15分钟。对活体背根神经节神经元进行抗体孵育实验，结果显示存在一个具有表面可及性蛋白酶体的神经元亚群，而未加一抗的对照样品则未显示表面标记信号。流式细胞术根据荧光强度鉴定出两类不同的背根神经节神经元群体，利用对照样本设定明确的分选门控区域，将NMP阳性细胞与NMP阴性细胞区分开来。

流式分选群体的定量结果显示，约4%的背根神经节神经元呈NMP阳性，而其余大多数为NMP阴性。分选后的NMP阳性和NMP阴性神经元均保持活力，并表达细胞类型特异性标志物NFH、IB4和CGRP，证实该实验流程适用于后续的分子分析。