体感神经元神经元膜蛋白酶体细胞亚型特异性分析
October 10th, 2025
神经元膜蛋白酶体 （NMP） 最近在体感神经元的一个子集中被鉴定为触觉、疼痛和瘙痒感知的关键调节因子。本文介绍了使用细胞分选、转录组分析和基于培养的免疫荧光分析分析细胞类型特异性 NMP 表达和功能的强大工作流程。
我们正在研究体感神经元如何通过最近发现的神经元膜蛋白酶体或 NNP 进行交流的机制，以调节我们感知触觉、瘙痒和疼痛的方式。我们最近发现了神经元膜蛋白酶体，这是一种在一些感觉神经元中发现的特殊蛋白质降解复合物，其功能是调节对触觉、瘙痒和疼痛的敏感性。通过该协议，我们将能够在健康和疾病条件下以细胞类型特异性方式研究 NMP 的表达和调节动力学。
我们的方案能够从非 NMP 表达神经元中分离出表达 NMP 的神经元，从而能够研究其具有细胞类型特异性的功能。重要的是，这些孤立的神经元群对于下游分析仍然可行。通过这些协议，我们将开始研究不同的神经性疾病如何影响 NMP 的表达和功能，以及这如何导致触觉、瘙痒和疼痛感的改变。
首先，将收获的背根神经节转移到 15 毫升的锥形管中。使用移液器，将 7 毫升组织解离酶混合物工作溶液加入试管中，并在 37 摄氏度下轻轻搅拌孵育 20 分钟。将试管放入离心机中，以 120 G 旋转神经节两分钟。
小心地吸出上清液，不要干扰沉淀。将神经节重悬于七毫升低研磨组织解离酶与木瓜蛋白酶混合物中。再次离心管后，吸出并丢弃上清液。
然后将神经节重新悬浮在 500 微升 BSA、TI 和 DMEM 溶液中。使用一毫升，堵塞的火抛光玻璃牧场移液器，研磨神经节12至16次。将细胞悬液通过 40 微米细胞过滤器以过滤掉细胞碎片。
用一毫升BSA，TI和DMEM溶液洗涤过滤器，以收集剩余的背根神经节神经元。将过滤后的细胞悬液转移到 15 毫升锥形管中。用一大块封口膜衬里来准备免疫荧光染色托盘。
使用无菌的5-45镊子，将盖玻片从组织培养皿转移到封口膜上，确保包含背根神经节神经元的一侧朝上。将 100 微升背根神经节培养基缓慢移液到每个盖玻片上，以防止细胞变干。然后在温热的背根神经节培养基中稀释go anti PSM alpha two一抗，达到1至20的稀释度。
使用装有 P10 未过滤吸头的吸气器，慢慢地从每个盖玻片的边缘取出介质。向每个盖玻片中加入 100 微升 go 抗 PSM α 2 抗体溶液，并在室温下孵育 40 分钟。之后，小心地从每个盖玻片中吸出一抗溶液。
向细胞中加入 100 微升室温 PBS，并在室温下孵育三分钟洗涤。现在，要制备二抗 go 抗体，请将其在温热的背根神经节培养基中以 1 至 250 的稀释度稀释。完成第三次洗涤后，将 100 微升稀释的二抗溶液添加到每个盖玻片中。
将盖玻片在室温下孵育 40 分钟，同时保护细胞免受光照。然后从盖玻片中吸出二抗溶液，并如前所述使用PBS洗涤细胞三次。最终PBS洗涤后，在PBS中加入100微升含有4%对甲醛和4%蔗糖的固定溶液。
将细胞在室温下孵育10分钟后，从每个盖玻片中吸出固定剂。然后如前所述用PBS洗涤细胞三次。为了使细胞透化，在PBS中加入100微升0.1%非离子去垢剂。
将盖玻片在室温下孵育五分钟。然后从盖玻片中吸出渗透溶液，并如前所述使用PBS洗涤细胞三次。将100微升由5%胎牛血清和5%PBS中的驴血清组成的封闭溶液加入每个盖玻片中。
接下来，在封闭溶液中稀释兔抗CGRP、A选择素B四生物素偶联物和鸡抗NFH，制备背根神经节神经元细胞型特异性一抗混合物。从盖玻片中吸出封闭溶液，然后向每个盖玻片中加入 100 微升制备的一抗混合物。将盖玻片在室温下孵育 45 分钟，同时避光。
然后，从盖玻片中取出一抗溶液，并如前所述使用PBS洗涤细胞三次。现在通过在封闭溶液中将链霉亲和素、驴抗兔和驴抗鸡各稀释至各1至500来制备二抗混合物。从每个盖玻片中吸出最终的PBS洗涤液，然后加入100微升制备的二抗溶液。
将盖玻片在室温下在黑暗中孵育 45 分钟。从盖玻片上吸出最后的洗涤液。使用细尖镊子，从封口膜上提起每个盖玻片，并通过将盖玻片的边缘接触到无绒纸巾上，轻轻吸干多余的液体。
将七微升封固剂液滴放在显微镜载玻片上。小心地将盖玻片降低到封片介质上，池面朝下，确保与介质完全接触。将准备好的载玻片放入黑暗干燥的抽屉或盒子中干燥至少一小时。
用快干指甲油密封盖玻片的边缘，等待 10 至 15 分钟后再成像。以活的背根神经节神经元为食的抗体揭示了具有表面可访问蛋白酶体的神经元亚群，而缺乏一抗的对照样本则显示出没有表面标记。流式细胞术根据荧光强度鉴定了两个不同的背根神经节神经元群，使用对照将NMP阳性细胞与NMP阴性细胞分开，并建立了清晰的门控区域。
对流动分选群体的定量表明，大约4%的背根神经节神经元为NMP阳性，其余大多数为NMP阴性。分选的NMP阳性和NMP阴性神经元保留了活力，并表达了细胞类型特异性标记物NFH、IB four和CGRP，证实了工作流程适用于下游分子分析。
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概述
本研究探讨神经元膜蛋白酶体（NMP）作为体觉神经元触觉、疼痛和瘙痒感知的重要调节剂。开发了一种细胞类型特异性协议来分析NMP的表达和功能，利用细胞分选、转录组分析和免疫荧光分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经生理学
背景
- NMP是一种新认知的蛋白质降解复合物。
- 它在调节感觉感知中起着关键作用。
- 理解NMP动力学对于洞察神经病理条件很重要。
- 该研究旨在分离表达NMP的神经元以进行进一步分析。
研究目的
- 调查NMP的表达和调节动力学。
- 探索不同神经病理条件如何影响NMP功能。
- 建立一种研究神经元特异性反应的方法。
使用的方法
- 采用了基于细胞分选和培养的免疫荧光技术。
- 收集、分离并处理背根神经节进行分析。
- 使用免疫荧光染色来可视化分离神经元中的NMP表达。
- 使用小心的离心和细胞处理技术以维持细胞活力。
- 遵循特定的抗体稀释和孵化协议以获得准确的结果。
主要结果
- 分离表达NMP的神经元允许进行详细的功能研究。
- 根据NMP表达确定了不同的背根神经节神经元群体。
- 通过抗体喂养实验揭示了表面蛋白酶体的可及性。
- 研究结果表明NMP在触觉和疼痛的感觉调节中具有重要作用。
结论
- 本研究建立了一个理解NMP在感觉神经元动力学中作用的框架。
- 这些方法能够探索健康和疾病中的神经元机制。
- 获得的见解可能为感觉障碍的治疗策略做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Subtype-specific analysis of the neuronal membrane proteasome (NMP) in somatosensory neurons enables precise interrogation of pain, itch, and touch signaling pathways. This workflow supports predictive confidence in target validation for sensory modulation and pain management portfolios. The ability to isolate and profile NMP-expressing neurons advances mechanistic de-risking at the discovery and preclinical interface.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables cell-type-specific interrogation of NMP function in sensory neuron subpopulations.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing NMP-dependent signaling from global proteasome effects.
- Facilitates identification of novel pain and itch modulation targets with reduced neuropathy risk.
Screening & Assay Development
- Provides validated isolation of NMP-positive and NMP-negative neurons for downstream assays.
- Enables reproducible preparation of viable neuronal populations for quantitative expression profiling.
- Supports development of cell-based assays to evaluate NMP modulation and compound effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling analysis of NMP dynamics in neuropathic conditions.
- Supports translational biomarker discovery through scRNA-seq of sorted neuronal populations.
- Facilitates risk-adjusted advancement of NMP-targeted interventions for pain and sensory disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, target validation, and translational continuity for sensory neuron targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of NMP's role in neuron-to-neuron communication and sensory modulation.
- Screening: Delivers reproducible, cell-type-specific populations for quantitative assay development.
- Analytics: Enables measurement of NMP expression and functional outputs via flow cytometry and scRNA-seq.
- Translational Research: Connects molecular profiling to disease-relevant phenotypes in pain and itch models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for isolating and profiling neuronal subtypes across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sensory target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Standardizes isolation and profiling of neuronal subtypes for scalable R&D workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for NMP-targeted pain management programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of novel sensory modulation targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal cell isolation, immunofluorescence, and flow cytometry.
- Demands access to FACS instrumentation and single-cell RNA sequencing platforms.
- Necessitates standardized antibody validation and gating strategies for reproducibility.
- Adaptable to various sensory neuron models and disease conditions with protocol optimization.
- Dependent on viability and marker expression of sorted neuronal populations for downstream analyses.
