Name: 体感神经元神经元膜蛋白酶体细胞亚型特异性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解神经元膜蛋白酶体在体感神经元中的细胞亚型特异性分析方法。本方案利用流式细胞术和免疫荧光技术分离NMP阳性神经元，为研究触觉、痛觉和瘙痒感知的分子机制提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.V.L 获得了芝加哥洛约拉大学斯特里奇医学院启动资金的支持。我们感谢 Robert Ladd 在 FACS 实验方面的建议与协助。

所有使用实验动物的方法均经芝加哥洛约拉大学斯特里奇医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 消化液、DRG 培养基和 FACS 培养基的制备
<ol>
	<li>配制含有 137 mM NaCl、5.3 mM KCl、1 mM MgCl2·6H2O、25 mM 山梨醇、10 mM HEPES 和 3 mM CaCl2·2H2O 的完全生理盐水溶液（CSS）。用 NaOH 调节 pH 至 7.2，并过滤除菌。</li>
	<li>通过将 190 µL 储存液（5 mg/mL 溶于 H2O）、84 µL 50 mM EDTA 和 6.5 mL CSS 混合，制备组织解离酶混合工作液（中等吹打强度）。使用前新鲜配制并过滤除菌。</li>
	<li>通过将 190 µL 酶混合储存液、150 µL 木瓜蛋白酶、84 µL 50 mM EDTA 和 6.5 mL CSS 混合，制备组织解离酶混合液（低强度吹打）-木瓜蛋白酶溶液。使用前新鲜配制并过滤除菌。</li>
	<li>通过将 7.5 mg 胰蛋白酶抑制剂和 7.5 mg BSA 溶于 5 mL DMEM/F12 培养基中，制备 BSA/TI/DMEM 溶液。新鲜配制并过滤除菌。</li>
	<li>通过将 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素、1% 谷氨酰胺和 2% 50x B27 补充剂加入 430 mL DMEM/F12 培养基中，制备背根神经节（DRG）神经元培养基。</li>
	<li>通过将 1% FBS、1x PBS、25 mM HEPES 和 1% 青霉素/链霉素溶于高压灭菌水中，制备 FACS 缓冲液。新鲜配制并过滤除菌。</li>
	<li>在实验方案开始前 24 小时，用 FACS 缓冲液充满两个 5 mL 聚苯乙烯圆底管，并置于 4 °C 环境中进行包被处理。</li>
</ol>
2. 单细胞背根神经节神经元悬液的制备
<ol>
	<li>按照先前描述的方法20,23，采集4-6只P20-P23小鼠的所有背根神经节（DRG）。</li>
	<li>将DRG转移至15 mL锥形管中，加入7 mL组织解离酶混合液（中等吹打强度）工作液。在37 °C下轻轻振荡（旋转）孵育20分钟。</li>
	<li>在120 × g下离心2分钟以沉淀神经节。小心移除上清液，避免扰动沉淀物，并将神经节重悬于7 mL组织解离酶混合液（低强度吹打）-木瓜蛋白酶工作液中。在37 °C下轻轻振荡（旋转）孵育15分钟。</li>
	<li>在120 × g下离心2分钟。弃去上清液，将神经节重悬于500 µL BSA/TI/DMEM溶液中。</li>
	<li>使用1 mL带滤塞且经火焰抛光的玻璃巴斯德吸管对神经节进行12-16次吹打解离。</li>
	<li>通过40 µm细胞筛过滤去除细胞碎片。用1 mL BSA/TI/DMEM溶液冲洗细胞筛，以确保收集所有背根神经节神经元。将细胞悬液转移至15 mL锥形管中。</li>
	<li>在120 × g下离心2分钟。弃去上清液，轻柔地将沉淀物重悬于1 mL DRG培养基中。 
	注：此即为单细胞背根神经节神经元悬液。</li>
</ol>
3. 抗体孵育标记 NMP 阳性神经元
<ol>
	<li>将DRG神经元悬液分装至两个1.5 mL离心管中，每管含500 µL，并标记为“&#34;primary&#34;”和“&#34;no primary&#34;”。</li>
	<li>向标记为“&#34;primary&#34;”的离心管中加入20 µL山羊抗蛋白酶体20S亚基α2（PSMA2）抗体（1:25稀释）。
	<ol>
		<li>可选：为检测细胞膜完整性和PSMA2抗体的特异性，可额外设置一组初级DRG样本，先与鸡抗神经丝重链（NF-H）抗体（1:1,000）孵育，再加入二抗（如488标记的抗鸡IgG，1:250）（参见步骤3.10）。 
		注意：若神经元细胞膜完整，抗NF-H标记对照应无细胞着色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C下轻柔振荡孵育30分钟。</li>
	<li>在初级抗体孵育期间，将过滤灭菌的1×PBS预热。</li>
	<li>以200 × g离心2分钟，弃去90%上清液。</li>
	<li>用500 µL预热的1×PBS重悬神经元，于37 °C轻柔振荡孵育3分钟。</li>
	<li>重复步骤3.5–3.6，共进行三次洗涤。</li>
	<li>在洗涤过程中，将4 µL抗山羊IgG（555 nm荧光染料标记）加入1,000 µL预热的DRG培养基中进行稀释（1:250稀释），以配制二抗溶液。</li>
	<li>第三次洗涤后，将“&#34;primary&#34;”和“&#34;no primary&#34;”两管均用500 µL二抗溶液重悬。 
	注意：自此步骤起，需用铝箔包裹离心管以避光。</li>
	<li>在37 °C下轻柔振荡孵育40分钟。</li>
	<li>重复步骤3.5–3.6，共进行三次细胞洗涤。</li>
	<li>第三次洗涤后，用300 µL FACS缓冲液重悬神经元，转移至两个独立的5 mL聚苯乙烯圆底管中，置于带盖冰桶内的冰上，避光保存。</li>
	<li>将前一日已预处理并含FACS缓冲液的圆底管一同放入冰桶中，与含细胞的管子一起进行后续FACS分选步骤。</li>
</ol>
4. 通过FACS分选分离NMP阳性（NMP+&#160;）和NMP阴性（NMP-&#160;）神经元
<ol>
	<li>在抗体孵育并标记背根神经节（DRG）神经元后，立即将细胞和包被的试管转移至流式细胞分选仪进行分选。</li>
	<li>加入7-氨基放线菌素D（7-AAD）（1:1,000）至两者中 &#34;初级&#34; 和 &#34;无主要抗体&#34; 离心管。在冰上孵育10-30分钟。 
	注意：7-AAD 用于在分选过程中排除死细胞。</li>
	<li>从经包被过夜的离心管中移除FACS缓冲液，并替换为1 mL新鲜FACS缓冲液。这些离心管将用作分选神经元的收集管。</li>
	<li>使用 &#34;无主要抗体&#34; 将标记的试管用于设定未标记神经元的参数和门控。</li>
	<li>应用前向散射（FSC）门控以分离与感觉神经元大小一致的细胞。感觉神经元的直径范围为10至50 µm。</li>
	<li>应用侧向散射（SSC）设门以排除死细胞和碎片（低侧向散射），并筛选出符合背根神经节（DRG）神经元颗粒度特征的事件（较高侧向散射）。</li>
	<li>加载 &#34;初级&#34; 管并根据已确定的设门参数进行设置 &#34;无主要抗体&#34; 样本以检测未标记的（NMP-）以及 555 阳性（NMP+神经元群体。</li>
	<li>使用100 µm喷嘴和15–20 psi分选压力，将神经元分选至555+&#160;和 555-.</li>
	<li>进行分选后神经元的下游分析。</li>
</ol>
5. NMP+&#160;和 NMP-&#160;神经元的单细胞 RNA 测序
<ol>
	<li>将分选后的细胞转移至1.5 mL离心管中，置于冰上，并将细胞运送至单细胞测序中心。</li>
	<li>对分选得到的NMP+&#160;和NMP-&#160;神经元进行单细胞RNA测序，测序深度为每个细胞30,000至100,000条reads。</li>
	<li>使用多种免费可用的软件程序分析scRNA-seq数据，根据特定基因表达谱生成细胞聚类。有关此前所用分析步骤和程序的更多细节，请参见Villalón Landeros等20。</li>
	<li>利用现有数据库（如&#160;https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ 或 https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all）构建特异性基因标志物列表，以鉴定不同的神经元群体。</li>
	<li>使用特异性基因标志物列表来鉴定所获得的细胞聚类。 
	注：此前进行的scRNA-seq分析由一家独立咨询公司（www.cmcherryconsulting.com）完成。</li>
</ol>
6. 富集的 NMP+&#160;和 NMP-&#160;神经元的原代培养
<ol>
	<li>实验前一天，将直径12 mm的圆形盖玻片放入24孔培养板中（每孔1片），用70%乙醇浸泡15分钟。随后用无菌水清洗3次，于无菌细胞培养超净台中自然晾干。</li>
	<li>盖玻片干燥后，加入0.1 mg/mL的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL），4 °C孵育过夜。</li>
	<li>实验当天，吸除PLL溶液，用无菌水清洗盖玻片3次，并在细胞培养超净台中晾干。 
	注意：PLL溶液可保存并重复使用。</li>
	<li>将10 µL浓度为1 mg/mL的层粘连蛋白（laminin）加入125 µL DRG培养基中稀释，取20–30 µL滴加于每张盖玻片中央。</li>
	<li>使用前，将盖玻片与层粘连蛋白共同孵育至少40分钟。</li>
	<li>将FACS分选的细胞转移至1.5 mL离心管中，在200 × g条件下离心5分钟以收集细胞。弃去上清液，用50 µL预热的DRG培养基重悬神经元。</li>
	<li>吸除盖玻片上的层粘连蛋白溶液，让盖玻片自然干燥。</li>
	<li>将重悬的神经元细胞悬液取15–20 µL接种于每张盖玻片上。小心将接种后的培养板转移至细胞培养箱中，孵育至少30分钟（不超过1小时），使细胞充分贴附。</li>
	<li>将培养板移回细胞培养超净台，向每孔含有细胞的盖玻片中加入1 mL无菌预热的DRG培养基。 
	注意：将移液器枪头缓慢降至孔的底部角落，缓慢释放液体，避免触碰盖玻片或扰动细胞。加液过快可能引起湍流，导致细胞脱落。</li>
	<li>将培养物置于37 °C、5% CO2/95%湿度条件下培养，每2–3天更换75%培养基。</li>
</ol>
7. 细胞类型特异性 NMP 表达分析
<ol>
	<li>用一张较大的石蜡膜衬垫一个140 mm的培养皿或免疫荧光染色托盘。</li>
	<li>使用无菌的5/45镊子，将盖玻片从组织培养皿转移至染色托盘的石蜡膜上，确保含有背根神经节（DRG）神经元的一面朝上。</li>
	<li>在石蜡膜上的每片盖玻片上加入100 µL DRG培养基，以防止细胞干燥。 
	注意：加液时应使用移液器缓慢地从盖玻片边缘上方加入。</li>
	<li>用预热的DRG培养基按1:20的比例稀释山羊抗PSMA2一抗。</li>
	<li>使用装有P10无滤芯吸头的移液器，从盖玻片边缘缓慢吸除培养基。向每片盖玻片加入100 µL山羊抗PSMA2抗体溶液，并在室温下孵育40分钟。</li>
	<li>小心吸除盖玻片上的一抗溶液。加入100 μL室温的PBS缓冲液，在室温下孵育3分钟以进行洗涤。</li>
	<li>吸除盖玻片上的PBS，重复加入并吸除PBS的操作，共完成三次洗涤。</li>
	<li>用预热的DRG培养基按1:250的比例稀释抗山羊二抗（例如555标记）。</li>
	<li>第三次洗涤后，向盖玻片加入100 µL稀释后的二抗溶液，在室温下孵育40分钟。 
	注意：从本步骤开始，需避免样品暴露于光照下。</li>
	<li>吸除盖玻片上的二抗溶液，并按照步骤7.6–7.7所述方法重复洗涤三次。</li>
	<li>移除最后一次PBS洗涤液，加入100 µL固定液（含4%多聚甲醛（PFA）和4%蔗糖的1×PBS溶液）以固定细胞，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>吸除固定液，并重复步骤7.6–7.7的操作进行三次PBS洗涤。</li>
	<li>加入100 µL含0.1%非离子型去垢剂（如Triton X-100）的1×PBS溶液以通透细胞，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>吸除通透液，并重复步骤7.6–7.7的操作进行三次洗涤。</li>
	<li>加入100 µL封闭液（含5%胎牛血清和5%驴血清的1×PBS溶液），在室温下孵育40分钟。</li>
	<li>在封闭液中按以下比例配制针对DRG神经元细胞类型的特异性一抗混合液：兔抗降钙素基因相关肽（CGRP）抗体（1:500）；生物素标记的异凝集素B4（IB4）（1:50）；鸡抗NF-H抗体（1:1000）。 
	注意：这些抗体之间无交叉干扰，可同时加入同一溶液中。</li>
	<li>移除封闭液，将一抗混合液加至盖玻片上，在室温下孵育45分钟。</li>
	<li>移除抗体溶液，并重复步骤7.6–7.7的操作进行三次洗涤。</li>
	<li>配制二抗混合液：将链霉亲和素（如647标记）、驴抗兔二抗（如488标记）和驴抗鸡二抗（如405标记）分别按1:500比例稀释。</li>
	<li>移除最后一次PBS洗涤液，向盖玻片加入100 µL二抗混合液，在室温下孵育45分钟。</li>
	<li>重复步骤7.6–7.7的操作进行三次洗涤。</li>
	<li>可选步骤：配制1–10 µg/mL的核染液。加入100 µL核染液，在室温下孵育30秒，然后用去离子水（diH2O）重复步骤7.6–7.7的操作洗涤两次。</li>
	<li>吸除最后一次洗涤液，用细尖镊子将盖玻片从石蜡膜上轻轻提起。用镊子夹住盖玻片边缘，轻轻接触无尘纸以吸去多余液体。</li>
	<li>在载玻片上滴加7 µL封片剂。将盖玻片轻轻覆盖在封片剂液滴上，确保细胞面朝下并与封片剂接触。</li>
	<li>将带有盖玻片的载玻片置于黑暗、干燥的抽屉或盒子中至少1小时，使其干燥并封闭盖玻片边缘。随后用快干指甲油完全封边，等待10–15分钟后再进行成像。</li>
	<li>使用配备适当激发滤光片的荧光显微镜或转盘共聚焦显微镜，对载玻片进行成像，以观察蓝色、绿色、红色和远红荧光信号。</li>
</ol>

<ol><li>Cartelli, D., Cavaletti, G., Lauria, G., Meregalli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+proteasome+system+and+microtubules+are+master+regulators+of+central+and+peripheral+nervous+system+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin proteasome system and microtubules are master regulators of central and peripheral nervous system axon degeneration.</a> Cells. 11 (8), 1358(2022).</li>
<li>Fortun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+proteasome+activity+and+accumulation+of+ubiquitinated+substrates+in+a+hereditary+neuropathy+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Impaired proteasome activity and accumulation of ubiquitinated substrates in a hereditary neuropathy model.</a> J Neurochem. 92 (6), 1531-1541 (2005).</li>
<li>Thibaudeau, T. A., Smith, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+review+of+proteasome+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">A practical review of proteasome pharmacology.</a> Pharmacol Rev. 71 (2), 170-197 (2019).</li>
<li>Türker, F., Cook, E. K., Margolis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteasome+and+its+role+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The proteasome and its role in the nervous system.</a> Cell Chem Biol. 28 (7), 903-917 (2021).</li>
<li>VerPlank, J. J. S., Lokireddy, S., Feltri, M. L., Goldberg, A. L., Wrabetz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+protein+degradation+and+proteasome+function+in+hereditary+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Impairment of protein degradation and proteasome function in hereditary neuropathies.</a> Glia. 66 (2), 379-395 (2018).</li>
<li>Moss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role of the ubiquitin-proteasome system in neuropathic pain.</a> J Neurosci. 22 (4), 1363-1372 (2002).</li>
<li>Meregalli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib-induced+painful+neuropathy+in+rats%3A+a+behavioral%2C+neurophysiological+and+pathological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pain%22%5BJournal%5D)">Bortezomib-induced painful neuropathy in rats: a behavioral, neurophysiological and pathological study.</a> Eur J Pain. 14 (4), 343-350 (2010).</li>
<li>Meregalli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+bortezomib-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxics%22%5BJournal%5D)">An overview of bortezomib-induced neurotoxicity.</a> Toxics. 3 (3), 294-303 (2015).</li>
<li>Velasco, R., Alberti, P., Bruna, J., Psimaras, D., Argyriou, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib+and+other+proteosome+inhibitors-induced+peripheral+neurotoxicity%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Bortezomib and other proteosome inhibitors-induced peripheral neurotoxicity: from pathogenesis to treatment.</a> J Peripher Nerv Syst. 24 (Suppl 2), S52-S62 (2019).</li>
<li>Cavaletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib-induced+peripheral+neurotoxicity%3A+a+neurophysiological+and+pathological+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bortezomib-induced peripheral neurotoxicity: a neurophysiological and pathological study in the rat.</a> Exp Neurol. 204 (1), 317-325 (2007).</li>
<li>Cata, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+sensory+findings+in+patients+with+bortezomib-induced+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain%22%5BJournal%5D)">Quantitative sensory findings in patients with bortezomib-induced pain.</a> J Pain. 8 (4), 296-306 (2007).</li>
<li>Meng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+neuropathy+during+concomitant+administration+of+proteasome+inhibitors+and+factor+Xa+inhibitors%3A+identifying+the+likelihood+of+drug-drug+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Peripheral neuropathy during concomitant administration of proteasome inhibitors and factor Xa inhibitors: identifying the likelihood of drug-drug interactions.</a> Front Pharmacol. 13, 757415(2022).</li>
<li>Mina, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-marketing+analysis+of+peripheral+neuropathy+burden+with+new-generation+proteasome+inhibitors+using+the+FDA+adverse+event+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Post-marketing analysis of peripheral neuropathy burden with new-generation proteasome inhibitors using the FDA adverse event reporting system.</a> Turk J Hematol. 38 (3), 218-221 (2021).</li>
<li>Holzer, A. -K., Suciu, I., Karreman, C., Goj, T., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+attenuation+of+purinergic+signaling+during+bortezomib-induced+peripheral+neuropathy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific attenuation of purinergic signaling during bortezomib-induced peripheral neuropathy in vitro.</a> Int J Mol Sci. 23 (7), 3734(2022).</li>
<li>Meng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+potent+and+selective+proteasome+inhibitor%2C+exhibits+in+vivo+antiinflammatory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (18), 10403-10408 (1999).</li>
<li>Maupin-Furlow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasomes+and+protein+conjugation+across+domains+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteasomes and protein conjugation across domains of life.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (2), 73-82 (2012).</li>
<li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu Rev Biochem. 65 (1), 801-847 (1996).</li>
<li>Groll, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+20S+proteasome+from+yeast+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 Å resolution.</a> Nature. 386 (6624), 463-471 (1997).</li>
<li>Pines, J., Lindon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis%3A+anytime%2C+any+place%2C+anywhere%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis: anytime, any place, anywhere.</a> Nat Cell Biol. 7 (8), 731-735 (2005).</li>
<li>Landeros, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nociceptive+activity+of+peripheral+sensory+neurons+is+modulated+by+the+neuronal+membrane+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The nociceptive activity of peripheral sensory neurons is modulated by the neuronal membrane proteasome.</a> Cell Rep. 43 (4), 114058(2024).</li>
<li>Qi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+DRG+genetic+toolkit+reveals+morphological+and+physiological+diversity+of+somatosensory+neuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mouse DRG genetic toolkit reveals morphological and physiological diversity of somatosensory neuron subtypes.</a> Cell. 187 (6), 1508-1526.e16 (2024).</li>
<li>Sharif, B., Ase, A. R., Ribeiro-da-Silva, A., Séguéla, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+coding+of+itch+and+pain+by+a+subpopulation+of+primary+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential coding of itch and pain by a subpopulation of primary afferent neurons.</a> Neuron. 106 (6), 940-951.e4 (2020).</li>
<li>Krueger, E. R., Church, T. R., Brennan, A., Türker, F., Landeros, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+study+neuronal+membrane+proteasome+function+in+mouse+peripheral+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to study neuronal membrane proteasome function in mouse peripheral sensory neurons.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103552(2025).</li>
<li>Chiu, M. L., Goulet, D. R., Teplyakov, A., Gilliland, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+structure+and+function%3A+the+basis+for+engineering+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Antibody structure and function: the basis for engineering therapeutics.</a> Antibodies. 8 (4), 55(2019).</li>
<li>Ramachandran, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+degradation+of+the+nascentome+by+the+neuronal+membrane+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent degradation of the nascentome by the neuronal membrane proteasome.</a> Mol Cell. 71 (1), 169-177.e6 (2018).</li>
<li>He, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+membrane+proteasomes+regulate+neuronal+circuit+activity+in+vivo+and+are+required+for+learning-induced+behavioral+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal membrane proteasomes regulate neuronal circuit activity in vivo and are required for learning-induced behavioral plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (3), e2216537120(2023).</li>
<li>Paradise, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE+isoforms+differentially+regulate+neuronal+membrane+proteasomes+to+shift+the+threshold+for+pathological+aggregation+of+endogenous+tau%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ApoE isoforms differentially regulate neuronal membrane proteasomes to shift the threshold for pathological aggregation of endogenous tau.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd edn, MIT Press. (1998).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

蛋白酶体在所有细胞中均至关重要，并存在于细胞的各个区室中19。近期在中枢25,26,27和外周20神经系统神经元中发现了一种特化的蛋白酶体复合物——膜相关蛋白酶体（NMP），这一发现改变了人们对蛋白酶体功能的现有认知。先前的研究表明，NMP作为一种信号传导型蛋白酶体，介导感觉神经元之间的串扰，从而调控对机械刺激、疼痛和瘙痒感觉的敏感性20。NMP在结构上似乎与胞质中的20S蛋白酶体完全相同，提示其功能独特性可能源于其在细胞膜上的定位20。选择性地标记NMP以研究其功能、形成及再循环过程具有较大挑战性。本实验方案中描述的方法可使研究人员在活体单细胞背根神经节（DRG）神经元悬液中可靠地标记NMP，并通过流式细胞分选（FACS）分离出NMP+&#...

蛋白酶体功能对于周围神经系统（PNS）的最佳发育和维持至关重要1,2,3,4,5,6。利用蛋白酶体抑制剂开展的体外（in vitro）和体内（in vivo）研究表明，蛋白酶体活性对神经发育、髓鞘形成、兴奋性以及胶质细胞功能均具有关键作用7,8,9,10。此外，基于蛋白酶体抑制剂的化疗会导致30%至60%的患者出现疼痛性神经病变，通常表现为四肢的慢性疼痛和感觉异常8,9,11,12,13。有趣的是，低剂量使用这些相同的抑制剂可降低对疼痛刺激的敏感性，提示蛋白酶体在感觉信息处理中具有复杂作用6,14,15。然而，尽管已有大量相关研究，蛋白酶体在PNS中的具体功能仍不甚明确。
蛋白酶体是所有生命领域中主要的蛋白质降解机器，对于维持蛋白质稳态至关重要16。20S核心蛋白酶体由四个七聚体环组成，其亚基排列为α、β、β、α，介导泛素非依赖性的蛋白质降解17,18。当其与调节颗粒结合时，可形成26S和30S帽状蛋白酶体，介导泛素依赖性的蛋白质降解4,17。在神经元中，蛋白酶体存在于所有细胞区室中，其亚细胞定位已知会影响其功能19。然而，许多常用的蛋白酶体抑制剂缺乏特异性，无法选择性地靶向不同定位的蛋白酶体群体。
事实上，通过使用膜不通透性蛋白酶体抑制剂以及在未透化的细胞中进行抗体标记，发现在部分躯体感觉神经元中存在一种神经元特异性的蛋白酶体复合物定位于质膜上20。对原代背根神经节（DRG）神经元进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，通过针对蛋白酶体亚基的抗体摄取及FACS分选，将细胞分为NMP+和NMP-&#160;两个群体，结果共鉴定出20个转录上不同的细胞簇20。进一步分析显示，NMP+细胞仅聚类于这20个簇中的3个。利用特定神经元亚型的基因标记集，共鉴定出13种不同的躯体感觉神经元亚型20。大多数NMP+神经元与MrgprA3+&#160;和Cysltr2+感觉神经元聚类在一起20。极少数NMP+&#160;细胞聚类于第三个簇，该簇未发现特异性基因集合，因此未予归类20。MrgprA3+&#160;和Cysltr2+&#160;神经元属于C型伤害性感受器，分别对热、机械和致痒刺激敏感，对应于CGRP-θ和SST神经元亚型21,22。在鉴定出的20个细胞簇中，有7个NMP-簇表达与非神经元细胞一致的基因标记，包括施万细胞、卫星胶质细胞和免疫细胞，这些也被列为未归类20。这些细胞群体的存在是可预期的，因为在DRG神经元培养过程中无法将非神经元细胞与神经元细胞完全分离20。
研究其功能发现，体外抑制NMP会改变神经元对KCl、组胺和αβ-亚甲基腺苷5'-三磷酸刺激的兴奋性20。在体内，抑制NMP可降低对机械刺激和痛觉刺激的敏感性，但对温度感觉无影响20。这些结果表明，NMP是机械觉、痛觉和痒觉感知的关键调控因子，也是疼痛管理的潜在治疗靶点20。然而，NMP活性在不同疾病背景下与疼痛发生之间的具体机制仍不清楚。因此，有必要进一步研究NMP在疼痛及相关神经病变条件下的表达动态及其功能。
本文介绍了一种用于鉴定和分离 NMP+&#160;DRG 神经元群体的可靠工作流程（图 1）。该方法结合 FACS 分选、单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和免疫染色，可实现对 NMP 表达动态的细胞类型特异性研究。这些技术能够以高分辨率、细胞类型特异性地分析 NMP 的表达，可用于探究 NMP 在正常状态及多种与疼痛相关条件下的作用。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES 缓冲液，pH 7.3</td><td>Quality Biological</td><td>118-089-721</td><td>FACS 缓冲液</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td>FACS 缓冲液</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛（PFA）储备液；电镜级</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>固定液</td></tr><tr><td>1x 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-023</td><td>FACS 洗涤液</td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-6</td><td>FACS 管</td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素 D（7-AAD）</td><td>Invitrogen</td><td>A1310</td><td>标记死细胞</td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9647; CAS: 9048-46-8</td><td>BSA/TI/DMEM</td></tr><tr><td>二水氯化钙（CaCl₂·2H₂O）</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7902</td><td>完全生理盐水溶液</td></tr><tr><td>鸡抗神经丝重链（NF-H）抗体</td><td>MilliporeSigma</td><td>AB5539</td><td>抗体</td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td>培养基；BSA/TI/DMEM</td></tr><tr><td>驴抗山羊 IgG（H+L）Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32816</td><td>抗体</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG（H+L）Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32790</td><td>抗体</td></tr><tr><td>DyLight 405 驴抗鸡抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-475-155</td><td>抗体</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E5134; CAS: 6381-92-6</td><td>Liberase TM/Liberase TL-木瓜蛋白酶工作液</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9647</td><td>培养基/FACS 缓冲液/封闭液</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管，9 英寸</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td>吹打</td></tr><tr><td>山羊抗 PSMA2 抗体（实验室自制）</td><td>made in house</td><td>NA</td><td>抗体</td></tr><tr><td>HEPES 粉末</td><td>MilliporeSigma</td><td>H4034</td><td>完全生理盐水溶液</td></tr><tr><td>Hoechst 染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td>细胞核染色剂</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050070</td><td>封闭液</td></tr><tr><td>IB4，生物素偶联物</td><td>MilliporeSigma</td><td>L2140</td><td>抗体</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td>培养皿</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Liberase 低吹打型（TL）</td><td>MilliporeSigma</td><td>54010200001</td><td>Liberase TL 储备液</td></tr><tr><td>Liberase 中等吹打型（TM）</td><td>MilliporeSigma</td><td>5401119001</td><td>Liberase TM 储备液</td></tr><tr><td>六水氯化镁（MgCl₂·6H₂O）</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2393</td><td>完全生理盐水溶液</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>Cat#: 9001-73-4</td><td>Liberase TL-木瓜蛋白酶工作液</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>MilliporeSigma</td><td>15140122</td><td>培养基/FACS 缓冲液</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL）</td><td>MilliporeSigma</td><td>P4707</td><td>培养皿</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5405</td><td>完全生理盐水溶液</td></tr><tr><td>兔抗 CGRP 抗体</td><td>Immunostar</td><td>24112</td><td>抗体</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>MilliporeSigma</td><td>S9888; CAS: 7647-14-5</td><td>完全生理盐水溶液</td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>MilliporeSigma</td><td>56755-M</td><td>完全生理盐水溶液</td></tr><tr><td>链霉亲和素 Alexa Fluor 647 偶联物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S21374</td><td>抗体</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td>固定液</td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>MilliporeSigma</td><td>T9253; CAS: 9035-91-8</td><td>BSA/TI/DMEM</td></tr></tbody></table>

体感神经元中神经元膜蛋白酶体的细胞亚型特异性分析

Cell Subtype-specific Analysis of Neuronal Membrane Proteasome in Somatosensory Neurons

感觉神经元信号传导依赖于功能正常的蛋白酶体，而蛋白酶体的亚细胞定位会影响其功能。最近在部分外周体感神经元中发现了一种特化的蛋白酶体复合物，称为神经元膜蛋白酶体（neuronal membrane proteasome, NMP）。NMP 仅定位于胞体以及近端和远端轴突的质膜上。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）显示，在正常条件下，NMP 主要在 MrgprA3+&#160;和 Cysltr2+&#160;神经元中表达，这些神经元介导机械觉、瘙痒和疼痛感知。在小鼠足垫皮肤中急性、选择性地抑制 NMP 可降低机械觉和痛觉敏感性，但不影响温度觉。值得注意的是，与全局性蛋白酶体抑制不同，选择性抑制 NMP 不会引起神经病变。体外研究表明，NMP 可能通过释放信号肽促进神经元之间的通讯，并对神经元正常响应刺激至关重要。这些发现表明，NMP 是调控感觉神经元间串扰的关键因子，对正常的触觉、痛觉和痒觉感知必不可少。因此，NMP 是疼痛管理的潜在靶点。本文介绍了利用抗体孵育和荧光激活细胞分选（FACS）技术分离表达 NMP 与不表达 NMP 的神经元群体的方法。这些细胞群体适用于通过 scRNA-seq 进行细胞类型特异性的表达谱分析，或用于基于培养的 NMP 表达动态研究。这些方法共同构成了一个可靠的工作流程，可用于研究 NMP 表达动态及其在与疼痛相关疾病状态中的作用。

区分核膜蛋白酶体（NMP）与细胞内蛋白酶体的能力依赖于膜不通透性标记方法。抗体孵育法允许在活神经元上使用蛋白酶体亚基特异性抗体，仅标记细胞外可接触的蛋白酶体。由于抗体的分子大小和亲水性，其无法穿过完整的细胞膜24。活神经元保持细胞膜完整性，阻止抗体进入细胞内。利用该方法，可可靠地标记NMP，并区分表达NMP的神经元（NMP+）与不表达NMP的神经元（NMP-）（图2A）。仅接受二抗标记的对照细胞未显示NMP标记信号（图2B）。此外，该方法表明仅背根神经节（DRG）神经元的一个亚群表达NMP。为将DRG神经元分为NMP+和NMP-群体以进行后续研究，可采用流式细胞分选（FACS）。对NMP标记的神经元进行细胞分选已获得一致结果。首先通过前向散射和侧向散射设门策略调整分选仪，排除死细胞和碎片，筛选出符合DRG神经元大小（&g...

最近在部分体感神经元中发现神经元膜蛋白酶体（NMP）是触觉、痛觉和痒觉感知的关键调控因子。本文介绍了一种强大的工作流程，通过细胞分选、转录组分析以及基于培养的免疫荧光分析，用于研究特定细胞类型的NMP表达与功能。

感觉神经元信号传导依赖于功能性的蛋白酶体，其亚细胞定位影响其功能。一种特化的蛋白酶体复合物，即……

我们正在研究体感神经元如何通过新近发现的神经元膜蛋白酶体（NNP）进行通讯，从而调控触觉、痒觉和痛觉感知的机制。我们近期发现了神经元膜蛋白酶体，这是一种存在于部分感觉神经元中的特化蛋白质降解复合物，其功能是调节对触觉、痒觉和痛觉的敏感性。通过本实验方案，我们将能够在健康和疾病状态下，以细胞类型特异性的方式研究NMP的表达及其调控动态。本方案能够将表达NMP的神经元与不表达NMP的神经元分离，从而实现对这些神经元功能的细胞类型特异性研究。重要的是，这些分离后的神经元群体在后续分析中仍保持活性。通过这些方案，我们将开始探究不同神经病理性状态如何影响NMP的表达与功能，以及这种影响如何导致触觉、痒觉和痛觉的异常。首先，将收获的背根神经节转移至一个15毫升的锥形管中。使用移液器向管中加入7毫升组织解离酶工作液，于37摄氏度轻柔振荡孵育20分钟。将管子放入离心机，以120 ×g离心2分钟，使神经节沉淀。小心吸除上清液，避免扰动沉淀物。将神经节重悬于7 mL低吹打组织解离酶混合液（含木瓜蛋白酶）中。再次离心后，吸除并弃去上清液。然后将神经节重悬于500微升的BSA、TI和DMEM溶液中。使用一支1毫升、带塞且经火焰抛光的玻璃移液管，将神经节吹打12至16次。将细胞悬液通过40微米细胞筛网，以滤除细胞碎片。用一毫升 BSA、TI 和 DMEM 溶液冲洗滤网，以收集残留的背根神经节神经元。将过滤后的细胞悬液转移至 15 毫升锥形管中。用一张较大的 Parafilm 膜铺垫免疫荧光染色托盘，做好准备。使用无菌的5-45镊子，将盖玻片从组织培养皿转移至Parafilm上，确保含有背根神经节神经元的一面朝上。缓慢地用移液器向每张盖玻片加入100 µL背根神经节培养基，以防止细胞干燥。然后用预热的背根神经节培养基将Go抗PSM alpha 2一抗按1:20比例稀释。使用装有P10无滤芯吸头的移液器，从每个盖玻片边缘缓慢吸除培养基。向每个盖玻片加入100 µL抗PSMα2一抗溶液，在室温下孵育40分钟。随后，小心吸除每个盖玻片上的一抗溶液。向细胞中加入 100 µL 室温 PBS，室温孵育 3 分钟以洗涤。现在，为制备二抗，将其用预热的背根神经节培养基按 1:250 的比例稀释。完成第三次洗涤后，向每张盖玻片中加入 100 µL 稀释后的二抗溶液。将盖玻片在室温下孵育40分钟，同时避免光照。然后吸去盖玻片上的二抗溶液，并用PBS如前所述洗涤细胞3次。最后一次PBS洗涤后，加入100 µL固定液，其中含4%多聚甲醛和4%蔗糖（溶于PBS中）。将细胞在室温下孵育10分钟后，吸去每个盖玻片上的固定剂。随后按照前述方法用PBS洗涤细胞三次。为了通透细胞，加入100微升含0.1%非离子型去垢剂的PBS溶液。将盖玻片在室温下孵育五分钟。然后吸去盖玻片上的通透溶液，并用 PBS 按前述方法洗涤细胞三次。向每张盖玻片加入 100 µL 封闭液，封闭液组成为含 5% 胎牛血清和 5% 驴血清的 PBS 溶液。接下来，将兔抗CGRP抗体、A选择素B4生物素偶联物以及鸡抗NFH抗体用封闭液稀释，配制背根神经节神经元细胞类型特异性的一抗混合液。吸除盖玻片上的封闭液，随后向每张盖玻片加入100 µL配制好的一抗混合液。将盖玻片置于室温避光孵育45分钟。随后，从盖玻片上移除一抗溶液，并用 PBS 按前述方法洗涤细胞三次。现在，通过将链霉亲和素、驴抗兔抗体和驴抗鸡抗体分别以 1:500 的比例溶于封闭液中，配制二抗混合液。吸除每张盖玻片上的最后一次 PBS 洗涤液，然后加入 100 微升（µL）配制好的二抗溶液。将盖玻片置于室温下避光孵育45分钟。吸除盖玻片上的最后一次洗涤液。使用细头镊子从帕拉膜上提起每张盖玻片，并用盖玻片边缘轻轻接触无绒纸巾，以吸去多余液体。在显微镜载玻片上滴加7 µL封片剂。将盖玻片细胞面朝下小心地覆盖在封片剂上，确保与封片剂完全接触。将制备好的载玻片置于避光干燥的抽屉或盒子中，干燥至少一小时。用快干指甲油密封盖玻片边缘，并在成像前等待10至15分钟。对活体背根神经节神经元进行抗体孵育实验，结果显示存在一个具有表面可及性蛋白酶体的神经元亚群，而未加一抗的对照样品则未显示表面标记信号。流式细胞术根据荧光强度鉴定出两类不同的背根神经节神经元群体，利用对照样本设定明确的分选门控区域，将NMP阳性细胞与NMP阴性细胞区分开来。流式分选群体的定量结果显示，约4%的背根神经节神经元呈NMP阳性，而其余大多数为NMP阴性。分选后的NMP阳性和NMP阴性神经元均保持活力，并表达细胞类型特异性标志物NFH、IB4和CGRP，证实该实验流程适用于后续的分子分析。

cell-subtype-specific-analysis-neuronal-membrane-proteasome

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

体感神经元神经元膜蛋白酶体细胞亚型特异性分析

本文介绍了一种从小鼠脑皮层制备具有翻译活性且结构完整的突触体（SNs）的方法。该方法采用不连续的Percoll-蔗糖密度梯度，可快速制备出具有活性的突触体。...

利用不连续Percoll-蔗糖密度梯度制备小鼠皮层突触体神经元组分

我们描述了一种利用特异性多克隆抗体标记活神经元表面蛋白的方法，该抗体针对细胞外表位。通过内吞作用被抗体结合并在细胞表面内化的蛋白，可与在孵育期间仍停留在表面或转运至表面的蛋白区分开来。...

活体培养神经元抗体孵育后细胞表面与内化蛋白的差异标记

本文详细介绍了通过在不连续蔗糖梯度中进行超速离心来富集与突触质膜相关的蛋白质。同时描述了突触后密度蛋白的后续制备方法。所获得的蛋白质样品适用于蛋白质印迹（Western blotting）或双向差异凝胶电泳（2D...

使用不连续蔗糖梯度制备突触浆膜和突触后密度蛋白

结合生化检测的光学显微技术揭示了SNARE介导的胞吐作用在netrin依赖性轴突分支中的参与。该技术组合可用于鉴定调控轴突分支和细胞形态变化的分子机制。...

利用联合方法学定义质膜运输在轴突分支和神经元形态发生中的作用

本文介绍一种脑膜分级分离方案，该方案是一种可靠的分离方法，可用于提取属于不同突触区室的蛋白质。...

脑膜组分分离：一种 离体 评估突触下蛋白定位的方法

本方案描述了在膜片钳记录后进行单细胞多重逆转录聚合酶链式反应所需的关键步骤和注意事项。该技术是一种简单而有效的方法，可用于分析通过膜片钳记录所鉴定的单个细胞中预设基因集的表达谱。...

膜片钳后单细胞多重逆转录聚合酶链式反应

本方案旨在高效定量啮齿类动物脑组织不同细胞区室中泛素-蛋白酶体系统（UPS）的活性。使用者可在同一只动物中检测核、胞质和突触组分内的UPS功能，从而减少进行此类复杂分析所需的时间和动物数量。...

量化啮齿类动物大脑中亚细胞水平的泛素-蛋白酶体活性

冷冻切片显微切割技术可对小鼠大脑中最大的神经发生微环境进行新鲜冷冻制备，用于深度定量蛋白质组学分析。该方法精确、高效，且对组织扰动极小，因此非常适用于研究该微环境以及其他器官、区域和物种的分子微环境。...

成年小鼠室管膜下区冷冻切片显微解剖用于精确深度定量蛋白质组分析

本文描述了一种神经元溶酶体邻近标记蛋白质组学方案，用于表征人诱导多能干细胞来源神经元中动态的溶酶体微环境。该方法可在活体人神经元中以优异的细胞内空间分辨率，准确量化溶酶体膜蛋白以及与溶酶体稳定或 transiently...

利用邻近标记蛋白质组学表征神经元溶酶体相互作用组

本方案提供了一种可靠且详细的方法，用于从小鼠脑组织中获取高纯度的突触体、突触小泡及其他突触组分。该方法可实现对突触过程的评估，包括在区室分辨率下对蛋白质定位和功能进行生物化学分析。...

从小鼠脑组织中分离突触组分的亚细胞分级分离法

了解神经元膜蛋白酶体在体感神经元中的细胞亚型特异性分析方法。本方案利用流式细胞术和免疫荧光技术分离NMP阳性神经元，为研究触觉、痛觉和瘙痒感知的分子机制提供可靠工具。

体感神经元中神经元膜蛋白酶体的细胞亚型特异性分析

探索更多视频