Name: 使用气液界面培养系统生成人诱导多能干细胞来源的平面生毛皮肤类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 学习利用气液界面培养系统，从人诱导多能干细胞生成功能性平面生毛皮肤类器官。该方法可重现人类皮肤结构及毛囊等皮肤附属器，为研究着色性干皮病等皮肤疾病提供重要体外模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢莱顿大学医学中心hiPSC Hotel的同事们提供了hiPSC细胞系。本研究由丹麦诺和诺德基金会资助的诺和诺德基金会干细胞医学中心支持（资助编号NNF21CC0073729），资助对象为K.R.。K.R.为法国国家健康与医学研究院（INSERM）研究员。

图1 介绍了利用气液界面（ALI）培养系统生成平面脑类器官（planar SOs）的工作流程。第一部分概述了基于Karl R. Koehler首创的方法，由人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成囊状脑类器官（cystic SOs）的过程。11，略有修改（图2）。第二部分详细描述了如前所述利用气液界面（ALI）培养系统将囊状SO进一步发育为平面SO的操作步骤。12，加以修改（图3）。所有化学品和材料均列于材料表中。本研究使用了三个先前已描述的人诱导多能干细胞系（LUMCi001-A、LUMCi004-A 和 WT2）用于生成类器官（https://hpscreg.eu/）13.
1. 囊状SO的生成
图2展示了关键步骤中的预期形态与异常形态。
<ol>
	<li>细胞聚集（第 -2 天）
	<ol>
		<li>在标准的 6 孔板中培养 hiPSCs，直至细胞汇合度达到 70–80%。</li>
		<li>用 1 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞。加入 1 mL 细胞解离试剂（CDR），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育约 6 分钟，使 hiPSCs 松动但不从基质上完全脱离（避免过度消化）。</li>
		<li>吸除 CDR，加入含 10 µM ROCK 抑制剂的 hiPSC 维持培养基（hiMM）。使用 P1000 移液器轻轻吹打，使细胞脱离并制备成浓度为 3.5 × 103 个细胞/mL 的细胞悬液。</li>
		<li>使用多通道移液器将 100 µL 细胞悬液加入 96 孔 U 型底超低吸附板的每个孔中。在室温下以 110 × g 离心 6 分钟，随后置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ROCK 抑制剂稀释（第 -1 天）
	<ol>
		<li>制备含抗生素-抗真菌补充剂（AAS）100 µg/mL 的 hiMM。</li>
		<li>每孔加入 100 µL，置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表皮外胚层诱导（第 0 天）
	<ol>
		<li>在进行下一步操作前，将适量的基底膜基质置于冰上解冻。在冰上制备补充了基底膜基质（2%）、BMP4（2.5 ng/mL）、SB431542（10 µM）和 bFGF（4 ng/mL）的 hiPSC 最小培养基（hiMinM）（称为 hiMinM+SFB）。 
		注意：BMP4 的浓度可能需要根据所用细胞系进行调整（见讨论部分）。</li>
		<li>使用宽口 P200 移液器吸头将细胞聚集体收集至 2 mL 圆底离心管中。 
		注意：使用市售的宽口吸头。选择内径至少为 2 mm 的吸头以尽量减少对聚集体的损伤。或者，可用红外接种环灭菌器加热手术刀片，用于改造普通移液器吸头以形成宽口。</li>
		<li>让聚集体在管底自然沉降。小心吸除培养基，并加入 2 mL hiMinM 洗涤聚集体。重复洗涤，共洗涤 3 次。</li>
		<li>使用宽口 P1000 移液器吸头，将细胞聚集体转移至预冷的 6 孔板中的冷 hiMinM+SFB 中。然后，使用宽口 P200 移液器吸头将每个聚集体转移至 96 孔 U 型底超低吸附板的孔中，每孔含 100 µL hiMinM+SFB。将板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中。 
		注意：此步骤应在超净台内的体视显微镜下操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非上皮细胞群体诱导（第 3 天）
	<ol>
		<li>制备含 LDN193189（1 µM）、bFGF（250 ng/mL）和 AAS（100 µg/mL）的 hiMinM。使用多通道移液器每孔加入 25 µL。</li>
		<li>轻轻振荡培养板，确保培养基均匀分布。将板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>营养供给（第 6 天）
	<ol>
		<li>制备含 AAS（100 µg/mL）的 hiMinM。使用多通道移液器每孔加入 75 µL。</li>
		<li>轻轻振荡培养板，确保培养基均匀分布。将板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基更换（第 8 天和第 10 天）
	<ol>
		<li>制备含 AAS（100 µg/mL）的 hiMinM。使用多通道移液器小心从每孔中吸除 100 µL 培养基。&#160;再使用多通道移液器向每孔中加入&#160;100 µL 新鲜培养基。</li>
		<li>轻轻振荡培养板，确保培养基均匀分布。将板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转移至低吸附 24 孔板（第 12 天）
	<ol>
		<li>在进行下一步操作前，将适量的基底膜基质置于冰上解冻。使用高级培养基（49% v/v）、神经基础培养基（49% v/v）、谷氨酰胺补充剂（1x）、不含维生素 A 的 B-27 补充剂（0.5x）、N2 补充剂（0.5x）、2-巯基乙醇（0.1 mM）和 AAS（100 µg/mL）制备类器官成熟培养基（OMM）。制备适量含 1% 基底膜基质的冷 OMM（称为 OMM1%M），并保持在冰上。 
		注意：操作 2-巯基乙醇时应佩戴个人防护装备，并在通风良好的区域进行。</li>
		<li>使用宽口 P1000 移液器吸头将细胞聚集体收集至 2 mL 圆底离心管中。</li>
		<li>让聚集体在管底自然沉降。小心吸除培养基。加入 1.5 mL 高级培养基洗涤聚集体。重复洗涤，共洗涤 3 次。</li>
		<li>使用宽口 P1000 移液器吸头，将细胞聚集体转移至预冷的 6 孔板中的冷 OMM1%M 中。然后，使用宽口 P1000 移液器吸头将每个聚集体转移至 24 孔低吸附板中，每孔含 500 µL OMM1%M。将板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中。 
		注意：此步骤应在超净台内的体视显微镜下操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基更换（第 15 天）
	<ol>
		<li>在进行下一步操作前，将适量的基底膜基质置于冰上解冻。制备适量的冷 OMM1%M，并保持在冰上。</li>
		<li>使用 P1000 吸头，小心从每孔中吸除 250 µL 培养基，然后向每孔中加入 250 µL OMM1%M。将培养板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中，并置于转速为 65 rpm 的轨道摇床上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第 18 天至第 45 天期间，每周一、周三和周五使用 OMM 进行半量培养基更换（250 µL）。</li>
	<li>在第 45 天至第 90 天期间，每周一和周三使用 OMM 进行半量培养基更换（250 µL），周五进行全量培养基更换。</li>
</ol>
2. 从囊状SOs向平面SOs的转变
注意：囊状皮肤类器官（SO）表现出倒置的形态，表皮朝向类器官中心内侧，而真皮则与外部环境接触。在第70天至第90天之间，根据细胞系和分化效率的不同，表皮的早期浅基底层分化已显著进展，并形成毛发钉状结构。此阶段将囊状SO转移至气液界面（ALI）培养系统，以获得更接近天然人类皮肤的组织。
<ol>
	<li>在第70天至第90天之间选择囊状皮肤类器官（SOs）以转化为平面状SOs
	<ol>
		<li>选择直径至少为5 mm且副产物含量最少的囊状SOs（副产物为在囊的一极聚集的间充质细胞，可能还含有软骨）。以毛囊板/毛乳头结构的存在作为皮肤类器官发育质量的指标（图1A 和 图2B）。 
		注意：根据囊状SOs的大小，从每个囊状SO中制备2–4个平面状SO。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶原蛋白包被的插入式培养插件（12孔板规格）的准备
	<ol>
		<li>通过将适量NaOH颗粒溶解于蒸馏水中，配制1 M的NaOH溶液。使用孔径为0.2 µm的膜滤器对NaOH溶液进行过滤除菌。 
		注意：操作1 M NaOH溶液时应佩戴个人防护装备，并在通风良好的区域中进行。</li>
		<li>在冰上，使用10倍浓度的磷酸盐缓冲液（10x PBS）将其稀释至终浓度为1x，加入NaOH（终浓度5&#8239;mM）和蒸馏水，将I型胶原蛋白溶液调整至终浓度为2&#8239;mg/mL。将150 µL胶原溶液加入标准12孔板中的每个插入式插件中。将培养板置于37 °C孵育30分钟，使胶原凝胶聚合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊状SO的展平（图3） 
	注意：此步骤应在层流罩（LAF）下的体视显微镜下进行。
	<ol>
		<li>使用宽口P1000移液器将选定的囊状SO连同少量培养基转移至10 cm培养皿的皿盖上。使用无菌手术刀小心切除类器官的副产物。在切除过程中，使用无菌镊子夹住类器官的对侧以稳定其位置（图3A）。 
		注意：在此阶段，囊状SO类似于一个放气的气球，其皮肤组织呈上下两层堆叠结构。</li>
		<li>使用手术刀在初次切口附近的类器官两端各切除约1 mm（图3B、F）。使用无菌镊子轻轻展开上层皮肤组织（图3C、G）。</li>
		<li>根据组织大小将其切割为2–4块。使用无菌镊子小心转移每一块组织，将其表皮面朝上放置于胶原蛋白包被的插入式插件中（图3D、H）。 
		注意：在体视显微镜下观察毛乳头结构，以确认表皮方向正确。</li>
		<li>将插件放回含有600 µL OMM培养基的标准12孔板中。将培养板放回37 °C、5% CO2 的培养箱中（图3E）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>长期气液界面培养维持
	<ol>
		<li>展平后第1天至第21天期间，于每周一、三、五进行完全换液（600 µL）使用OMM培养基。将培养板放回37 °C、5% CO2、相对湿度95%的培养箱中。</li>
		<li>展平后第21天至第27天期间，将培养板置于37 °C、5% CO2但无湿度的培养箱中，以增强皮肤屏障功能。每日进行完全换液（800 µL）使用OMM培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Nurses+Assoc%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the skin.</a> J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).</li>
<li>Karimkhani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+skin+disease+morbidity+and+mortality%3A+An+update+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Global skin disease morbidity and mortality: An update from the Global Burden of Disease Study 2013.</a> JAMA Dermatol. 153 (5), 406(2017).</li>
<li>Seth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+skin+disease%3A+Inequities+and+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Dermatol+Rep%22%5BJournal%5D)">Global burden of skin disease: Inequities and innovations.</a> Curr Dermatol Rep. 6 (3), 204-210 (2017).</li>
<li>Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+Animal+models+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: Animal models of wound healing.</a> J Invest Dermatol. 138 (10), 2095-2105.e1 (2018).</li>
<li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wound+healing+in+humans+and+mice%3A+Challenges+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Sci%22%5BJournal%5D)">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).</li>
<li>Vig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+skin+regeneration+using+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in skin regeneration using tissue engineering.</a> Int J Mol Sci. 18 (4), 789(2017).</li>
<li>Chu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+strategies+of+hair+follicles%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration strategies of hair follicles: Advances and challenges.</a> Stem Cell Res Ther. 16 (1), 77(2025).</li>
<li>Motter Catarino, C., Cigaran Schuck, D., Dechiario, L., Karande, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+hair+follicles+in+3D+bioprinted+models+of+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin.</a> Sci Adv. 9 (41), eadg0297(2023).</li>
<li>Kageyama, T., Miyata, H., Seo, J., Nanmo, A., Fukuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+hair+follicle+growth+model+for+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro hair follicle growth model for drug testing.</a> Sci Rep. 13 (1), 4847(2023).</li>
<li>Abaci, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+human+hair+follicles+using+a+biomimetic+developmental+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach.</a> Nat Commun. 9 (1), 5301(2018).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-bearing+human+skin+generated+entirely+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells.</a> Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-activating+human+skin+organoid+model+of+atopic+dermatitis+induced+by+Staphylococcus+aureus+and+its+protective+effects+by+Cutibacterium+acnes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes.</a> iScience. 25 (10), 105150(2022).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recessive+cardiac+phenotypes+in+induced+pluripotent+stem+cell+models+of+Jervell+and+Lange-Nielsen+syndrome%3A+Disease+mechanisms+and+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recessive cardiac phenotypes in induced pluripotent stem cell models of Jervell and Lange-Nielsen syndrome: Disease mechanisms and pharmacological rescue.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (5), E5383-E5392 (2014).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+hair-bearing+skin+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of hair-bearing skin organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 17 (5), 1266-1305 (2022).</li>
<li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Embryonic skin development and repair.</a> Organogenesis. 14 (1), 46-63 (2018).</li>
<li>Li, K. N., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+stem+cells+as+a+skin-organizing+signaling+center+during+adult+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Hair follicle stem cells as a skin-organizing signaling center during adult homeostasis.</a> EMBO J. 40 (11), e107135(2021).</li>
<li>Biggs, L. C., Kim, C. S., Miroshnikova, Y. A., Wickström, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+in+the+skin%3A+Roles+in+tissue+architecture%2C+stability%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces in the skin: Roles in tissue architecture, stability, and function.</a> J Invest Dermatol. 140 (2), 284-290 (2020).</li>
<li>Gopee, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prenatal+skin+atlas+reveals+immune+regulation+of+human+skin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A prenatal skin atlas reveals immune regulation of human skin morphogenesis.</a> Nature. 635 (8039), 679-689 (2024).</li>
<li>Tokuyama, E., Nagai, Y., Takahashi, K., Kimata, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+on+human+skin+equivalents+increases+the+epidermal+thickness+and+develops+the+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch on human skin equivalents increases the epidermal thickness and develops the basement membrane.</a> PLoS One. 10 (11), e0141989(2015).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+research%3A+Theory%2C+technology%2C+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Organoid+Res%22%5BJournal%5D)">Organoid research: Theory, technology, and therapeutics.</a> Organoid Res. 1 (1), 025040007(2025).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+research+breakthroughs+in+2024%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Organoid+Res%22%5BJournal%5D)">Organoid research breakthroughs in 2024: A review.</a> Organoid Res. 1 (2), 025040005(2025).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpox+virus+infection+and+drug+treatment+modelled+in+human+skin+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mpox virus infection and drug treatment modelled in human skin organoids.</a> Nat Microbiol. 8 (11), 2067-2079 (2023).</li>
<li>Kim, M. J., Ahn, H. J., Kong, D., Lee, S., Kim, D. H., Kang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+solar+UV-induced+photodamage+on+the+hair+follicles+in+human+skin+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Modeling of solar UV-induced photodamage on the hair follicles in human skin organoids.</a> J Tissue Eng. 15, 20417314241248753(2024).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本文所述方案通过组织压平以及将表皮顶端暴露于空气中，恢复了囊性SO系统的天然组织方向和微环境，从而克服了该系统的一个关键局限性。该方法能够保持类器官固有的细胞和结构复杂性，促进符合生理特征的组织结构形成，并可直接接触多层表皮表面，便于开展实验操作。
要获得高质量的平面SOs，该方案中有多个步骤至关重要，首先需要生成高质量的囊状SOs。此前已有文献详细描述了关键的质量控制检查点以及可能的方案优化环节12。简而言之，起始材料应为维持良好的未分化hiPSC细胞系，细胞融合度在70-80%，形态上表现为细胞排列紧密，核质比高。囊状SOs的生成需要在表面外胚层诱导过程中精确调控BMP4信号通路12。由于不同hiPSC细胞系对BMP4的敏感性可能存在差异，因此可能需要进行剂量滴定以获得最佳效果。建议测试2.5至15 ng/mL范围内的BMP4浓度，因该范围之外尚未见成功报道。试剂来源的一致性也十分重要，因此应使用同一供应商的试剂制备批量库存，并在推荐条件下储存，在有效期内使用，以确保其完全的生物学活性并减少实验间变异。
选择具有适当形态和大小的囊状皮肤类器官（SO）对于成功实现SO展平至关重要。囊状SO的成熟以及随之而来的乳头状突起和毛囊板的形成可能因不同的人诱导多能干细胞（hiPSC）系而异，因此展平操作的时间可能在第70天至第90天之间变化。在囊状SO形成的第3天添加CHIR99021（一种GSK3抑制剂和WNT信号通路激动剂）可能有助于促进类器官增大并减少软骨形成，其机制为促进细胞增殖并抑制神经嵴细胞迁移12。尽管该方法具有前景，但在我们的培养体系中，该改良方案尚未表现出一致的效果。
扁平化过程需要熟练的操作技巧以及对组织的熟悉。值得注意的是，在将皮肤片段转移至包被的插入物上时，必须注意确保组织方向正确。建议在体视显微镜下使用精细镊子检查方向，并轻轻调整组织，直至其顶面朝上。当位置正确时，乳头突起/毛乳头应朝下。在将平面皮肤类器官转移至气液界面培养后，毛囊通常在数天内开始出现明显的生长及毛干色素沉着。
所述模型的主要局限性在于所需时间较长、维护水平要求高以及模型的不成熟性。具有毛乳头结构的囊状皮肤类器官的发育需要70至90天，随后还需进行4周的气液界面（ALI）培养。这一较长的培养周期，加上繁琐的展平操作，使得该体系相较于市面上可获得的人类皮肤替代物，更不适合高通量应用。尽管通过微小的优化可能略微缩短培养时间，但大幅缩短的可能性较低。皮肤所具有的高度细胞多样性和结构复杂性依赖于一系列复杂的上皮-间充质相互作用及机械信号调控，这些过程可能无法通过添加外源因子而显著加速。 体外15,16,17,18囊状视泡类器官的形成及其向平面形态的发育需要高度的维护。除了囊状培养的前18天外，最耗费操作的阶段出现在平面视泡类器官在低湿度环境中维持培养期间，此时需要每日更换培养基。与其他人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的模型类似，视泡类器官保持一种类似胎儿的表型。 体外此外，皮肤类器官中几乎不存在汗腺和立毛肌。14，这可能是由于缺乏血管化、免疫细胞以及剪切应力、拉伸和摩擦等机械力，而这些因素对于正常的成熟过程至关重要15,16,17,18,19。通过提高模型的复杂性，可能解决其中部分局限性。与自体来源的hiPSC衍生巨噬细胞共培养17，灌流系统的整合9，或施加机械拉伸17 可能有助于促进模型的成熟20,21.
需要注意的是，Transwell 插入式培养装置在一定程度上限制了毛囊（HFs）在平面类器官（SOs）中的垂直向下生长。因此，毛囊倾向于横向扩展，可能暴露于空气中。由于毛囊在正常情况下由皮肤组织保护 体内在设计实验时应考虑这一点。通过应用较厚的水凝胶层来改变插入物的涂层，可能有助于缓解这一问题。此外，在该模型中，毛干很少突出于皮肤表面。我们的观察表明，平面类器官中的毛囊在气液界面培养的第27天之前始终处于生长期（anagen），即活跃生长期。鉴于人类毛囊生长期持续时间较长，这一现象并不完全出乎意料。尽管长期培养最终可能支持毛囊周期的阶段转换，但在缺乏系统性信号的情况下，这种情况不太可能发生。鉴定并补充毛囊周期所必需的分子信号，可能实现对退行期（catagen）和休止期（telogen）的人工诱导。
总之，生成平面型皮肤类器官（planar SOs）的方案能够实现多种在囊状皮肤类器官中不可行或不相关的实验方法。平面型皮肤类器官已被成功用于模拟细菌11和病毒感染22、紫外线辐射引起的组织损伤22以及相关的药物反应12,22,23。能够接触具有生理相关性的复杂皮肤等效物的顶面，代表了该领域的重大进展，并为皮肤研究中的多种新型应用开辟了道路。

皮肤在生物体与其环境之间形成关键的保护屏障，同时调节体温、水分平衡和感觉输入。皮肤主要由三层构成：表皮，即具有角化表面的复层角质形成细胞上皮；真皮，富含细胞外基质、成纤维细胞、神经、血管和免疫细胞的结缔组织；以及皮下组织，主要由皮下脂肪细胞组成。人类皮肤的功能还依赖于一些特化的附属结构，如毛囊（HFs）、皮脂腺和汗腺1。
皮肤疾病是全球最常见的医学病症之一2，3。传统上，大多数针对皮肤的研究均采用动物模型4，以在系统性环境中模拟皮肤器官的生理复杂性。然而，由于存在显著的种间差异4，加之伦理问题日益受到关注，推动了具有生理相关性的人体皮肤模型的发展。
传统的人类皮肤模型可分为两类：重建的人表皮，由分层的角质形成细胞组成；以及重建的人类皮肤，其额外包含一个由嵌入胶原基质中的成纤维细胞构成的真皮层结构5。尽管这两类模型显著推动了我们对皮肤生理学的理解，但它们仍缺乏天然人类皮肤完整的结构保真度和细胞多样性。这些模型的一个主要局限在于缺少皮肤附属器，例如毛囊（HFs），因此不适用于与毛发生长和再生相关的皮肤疾病研究及药物测试6。虽然已有报道更先进的包含毛囊的系统，但这些系统要么未能完全重现毛囊结构及其微环境的复杂性，要么依赖于生物打印或微模塑等复杂技术7,8,9,10。
一种可解决上述多项挑战的新型皮肤模型是皮肤类器官（SO），该模型由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成11。通过模拟胚胎发育过程，可将hiPSCs定向诱导为颅部表面外胚层和颅神经嵴谱系，使其自组织形成囊状结构，其形态与人类皮肤高度相似。这些SO包含几乎所有非免疫性皮肤细胞类型，并组织成具有分层结构的表皮和富含细胞外基质的真皮。尤为重要的是，SO支持皮肤附属器的发育，包括毛囊（HFs）和皮脂腺。鉴于hiPSCs具有近乎无限的可扩展性，SO可用于复杂的基因工程操作以及新型功能工具的开发。因此，SO代表了该领域的一项重大进展，在发育生物学、疾病建模、药物筛选和再生医学等方面具有广阔的应用前景。
然而，仍存在一个显著的局限性：皮肤类器官（SOs）会形成倒置的囊状结构，其中表皮位于真皮囊内部，无法接触机械力，且浸没在水相培养基中。这种构型不仅在生理上不准确，而且无法建立气液界面（ALI）。因此，囊状SOs在涉及表皮屏障、机械力或直接对顶面进行处理的研究中应用受限。为解决这一问题，本文介绍了一种可重复的方法，通过机械方式将囊状SOs压平，并随后在气液界面（ALI）条件下培养为平面状皮肤。该方法最初由Jung等人报道，可重新组织组织结构，使表皮顶面暴露于空气中，从而促进进一步的分层和屏障功能的形成12。所获得的平面状、带毛发的类器官保留了人类皮肤的复杂结构，同时呈现出符合生理实际的组织方向，使实验人员能够直接接触顶面进行操作。尽管该过程耗时较长（约100天），且在将囊状SOs解剖为平面SOs的步骤中存在一定的技术难度，但对于已从事SOs或其他人类皮肤等效模型研究、并希望提高其模型系统生理相关性的研究人员而言，该方法可能具有特别的价值。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#12634010</td><td>在文中称为Advanced培养基。</td></tr><tr><td>ALK5，TGFβ I型受体抑制剂，SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>#1614</td><td>分装，于 -20 保存 &amp;deg;C 和&amp;nbsp; 保持在 4 &amp;deg;最多7天，温度为C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD104大鼠单克隆抗体克隆439-9B</td><td>BD 生物科学</td><td>#555719</td><td>NA</td></tr><tr><td>抗IV型胶原多克隆抗体</td><td>默克密理博</td><td>#Ab769</td><td>NA</td></tr><tr><td>兔抗细胞角蛋白10多克隆抗体</td><td>Biolegend</td><td>#905401</td><td>NA</td></tr><tr><td>兔抗丝聚蛋白抗体</td><td>Biolegend</td><td>#905101</td><td>NA</td></tr><tr><td>抗PMEL小鼠单克隆抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>#NBP2-29407&amp;nbsp;</td><td>NA</td></tr><tr><td>B-27 补充剂，不含维生素 A</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#12587010</td><td>分装，于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞培养小室</td><td>Greiner Bio-one</td><td>#665641</td><td>12孔，孔径0.4 &amp;micro;m；透明（48 个插件/盒）；https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html</td></tr><tr><td>I型胶原</td><td>康宁</td><td>#354249</td><td>将储备液保存在4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>一次性无菌手术刀 0507 型号 21</td><td>Swann Morton</td><td>#0507</td><td>NA</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#14190094</td><td>NA</td></tr><tr><td>Essential 6（E6）培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A1516401</td><td>称为人诱导多能干细胞基础培养基（hiMinM）&amp;nbsp; 在文中。</td></tr><tr><td>法舒地尔</td><td>LC Labs</td><td>#F-4660</td><td>分装1000倍浓度的储存液，并于-20℃保存 &amp;deg;C. 解冻后，置于4℃保存 &amp;deg;最多保存14天，温度为C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>温和细胞解离&amp;nbsp; 试剂</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#100-0485</td><td>NA</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#35050038</td><td>NA</td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子-2 预混级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>#130-093-842</td><td>分装，-80℃保存 &amp;deg;C 和&amp;nbsp; 保持在 4 &amp;deg;最多7天，温度为C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LDN 193189 二盐酸盐</td><td>Tocris</td><td>#6053</td><td>分装，避光，-20储存 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生长因子减少型基质胶基底膜基质</td><td>康宁</td><td>#354230</td><td>分装，于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C 和&amp;nbsp; 保持在4℃ &amp;deg;最多保存 7 天，温度为 C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#21985023</td><td>有害物质，有毒，腐蚀性，刺激性，危害健康和环境。</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>默克</td><td>#567530-250MG</td><td>有害物质，具有腐蚀性和刺激性。现用现配溶液。</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#21103049</td><td>称为神经基础培养基&amp;nbsp; 在文中。</td></tr><tr><td>Normocin 50 mg/ml</td><td>Invivogen</td><td>#ant-nr-1</td><td>称为抗生素-抗真菌素添加剂，在测试中使用。分装后，于 -20 保存 &amp;deg;C 和&amp;nbsp; 保持在 4 &amp;deg;最多保存14天，温度为C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96孔U型底微孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#174929</td><td>NA</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 174930 24孔多孔培养板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#174930</td><td>NA</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#17502048</td><td>分装，-20℃保存 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#88881102</td><td>NA</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#15070063</td><td>NA</td></tr><tr><td>重组人BMP4蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>#314-BP-010</td><td>分装，于 -80 保存 &amp;deg;C 和&amp;nbsp; 保持在 4 &amp;deg;最多保存7天，温度为C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>StemFlex (SF) 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A3349401</td><td>称为人诱导多能干细胞维持培养基（hiMM）&amp;nbsp; 在文中。</td></tr><tr><td>SteriMax smart&amp;nbsp;- 红外接种环灭菌器</td><td>WLD-TEC</td><td>#4.002.000&amp;nbsp;</td><td>可选</td></tr><tr><td>镊子</td><td>默克</td><td>#T4537-1EA</td><td>5号；细针尖，抗磁性不锈钢</td></tr><tr><td>玻璃粘连蛋白</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07180</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

利用气液界面培养系统生成人诱导性多能干细胞来源的含毛囊平面皮肤类器官

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Planar Hair-bearing Skin Organoids Using an Air-Liquid Interface Culture System

包含毛囊的人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源的皮肤类器官（SOs）为研究皮肤微环境中细胞间的相互作用提供了复杂的体外模型。最初以倒置囊状结构发育，其中真皮暴露于外界环境，而表皮朝向类器官中心；随后可将SOs转移至气液界面（ALI）培养系统中的平面结构，该结构更接近人类皮肤的生理状态。本文提供了一套完整的方案，用于生成和筛选可被解剖为平面皮肤类器官并在ALI培养系统中进一步发育的囊状SOs。该方案包括在类器官发育关键阶段进行宏观定性评估的明确定义节点，详细说明了将囊状SOs展平为平面皮肤所需的技术步骤，规定了ALI培养的最佳条件，并通过分子分析展示了实验结果。在第27天，使用谱系特异性标志物进行免疫荧光染色，结果显示形成了具有皮肤附属器（包括毛囊和类似皮脂腺结构）的多层色素化上皮。本方案提供了一种生成带附属器的平面SOs的可靠方法，构建了一个生理相关性高的体外模型。该系统支持多种皮肤研究应用，已成功用于模拟病原体感染、紫外线辐射引起的组织损伤以及药物反应。

囊状类器官生成过程中的优化步骤和关键检测点已有详尽描述14。因此，本文方法重点介绍在囊状类器官发育过程中需评估的关键检测点（图2A），适合转化为平面类器官的囊状类器官的筛选标准（图2B），以及用于评估所得平面类器官质量的评判标准（图1B-D 和 图4）。
囊状皮肤器官（SO）发育的首个关键步骤是在第0天形成一个致密的单细胞聚集体，该聚集体包含了培养孔中大部分的细胞（图2A）。这一过程通过精细且快速地处理hiPSCs，并结合高效的离心操作实现，从而使细胞在培养孔中央均匀分布（图2A，第-2天）。正确诱导表皮外胚层后，到第3天时，细胞聚集体最外层将形成一层薄而透明的上皮层（图2A）；随后在间充质细胞诱导作用下，到第8天时发展为含有深色间充质细胞核心的透明囊状结构。在第12至20天之间，上皮性囊壁逐渐被一层薄薄的间充质细胞覆盖，这些细胞聚集在囊的一极（图2A，第12天）。上皮细胞与间充质细胞的成功共诱导最终形成分层的上皮结构，从而促进毛囊板和毛乳头样结构的形成，这些结构通常在第50至80天之间变得可见（图2A、B）。通过依据上述发育阶段的关键节点筛选合适的SOs，可在向平面型SOs转换时最大程度地减少形态和大小的变异性。
毛囊板或毛囊柱的存在是选择囊状皮肤类器官（SO）以进一步发育为平面皮肤类器官（SO）的主要纳入标准。若无可见的毛囊板，通常是由于表皮分层缺陷所致，此时表皮显得极薄（图2B，第50天，中间图）。用于展平操作的囊状结构仅选用体积较大（直径至少5 mm）、副产物集中于一极且总体副产物较少的样本，而副产物分布非极化的样本则被排除（图2B）。
在平面构型下，类皮肤器官（SOs）的主要质量评估依赖于在体视显微镜下宏观监测毛囊（HF）的生长情况。在气液界面（ALI）培养的27天过程中，毛囊逐步伸长，皮脂腺大约在第14天时变得可见，色素沉积也随时间逐渐增强（图1B，C）。由于插入膜紧贴于薄胶原凝胶下方，造成空间限制，只有位于平面类皮肤器官边缘区域的毛囊才能充分生长，并且其生长方向与插入膜平行（图1C）。值得注意的是，毛干很少突出于皮肤表面。为进一步评估所形成的平面类皮肤器官的质量，可将其包埋于石蜡或OCT包埋剂中，切片并染色以检查其组成与形态结构。苏木精-伊红（H&E）染色显示，其结构与人类皮肤高度相似（图4A），具有完全分层的上皮和由基底膜分隔的真皮层。利用针对不同表皮层、皮脂腺及黑素细胞的特异性标记物进行免疫荧光染色，进一步证实了平面类皮肤器官具有类似人类皮肤的组织架构（图1D 和 图4B）。
<img alt="耳蜗类器官生长阶段，囊状与平面状；胶原培养，显微镜观察，第1-27天分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：利用气液界面培养系统由人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成含毛囊（HFs）的平面状皮肤类器官（SOs）的工作流程。 示意图及代表性图像展示了关键步骤。(A) 囊状SOs的生成，基本按照先前所述方法10进行，直至约第80天可见毛发板/毛芽结构形成。(B) 将囊状SOs切开并展平，表皮侧朝上，置于I型胶原包被的细胞培养插件上。在加湿条件下维持气液界面（ALI）培养21天，随后在干燥条件下培养6天。(C) B图所示区域的高倍放大视图，显示毛囊生长、类似皮脂腺结构的发育（箭头），以及随时间推移逐渐出现的色素沉着。(D) 展平后第27天的平面状SO切片共聚焦图像，使用抗IV型胶原抗体标记，并与尼罗红（标记类似皮脂腺的结构）或抗PMEL抗体（染色黑色素细胞）共同染色。细胞核用DAPI复染。比例尺：(A) 200 µm；(B,C) 500 µm；(D) 50 µm。缩写：SOs = 皮肤类器官；HFs = 毛囊；hiPSCs = 人诱导多能干细胞；ALI = 气液界面；Col IV = IV型胶原；PMEL = 前黑色素体蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="干细胞分化阶段；显微镜图像；细胞在80天内的演变过程；器官发生过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：皮肤类器官（SO）生成过程中关键步骤的细胞聚集体形态代表性图像。（A） 不同阶段具有适当（左图）和不适当（中图和右图）形态的囊状SO的代表性图像。在第-2天，细胞聚集体应呈现均匀分布（左图），而离心后操作培养板不当可能破坏细胞分布（右图）。在第0天，形态良好的聚集体表现为致密紧凑的细胞簇（左图），而细胞活力低下则导致广泛细胞死亡并丧失紧凑的三维结构（右图）。在第3天，清晰的外层上皮层变得可见（左图），其缺失可能提示BMP4浓度需要优化（右图）。在第12天，间充质细胞在一极聚集并迁移以包裹上皮囊（左图），而上皮（中图）或间充质（右图）过度分化会阻碍正常的上皮分层。在第50天，SO呈现双极形态，一侧为囊状皮肤，另一侧为副产物（主要为软骨）（左图）。上皮（中图）或间充质（右图）过度分化会阻碍皮肤的正常发育。（B） 约第80天出现可见毛芽结构的囊状SO的代表性图像。注意副产物（虚线左侧）相对于皮肤的比例存在差异。最左侧三个图中的样本可用于生成2–4个平面SO，而最右侧图显示的是质量不足以进行压平处理的SO。比例尺：第-2天、第50天和第80天为500 µm；第0天、第3天和第12天为200 µm。缩写：SO = 皮肤类器官。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="皮肤类器官培养过程；显微镜示意图，37°C 培养装置，结构结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 3"> 
图 3：平面皮肤类器官（SO）制备技术步骤的示意图。 在体视显微镜下于层流洁净台内对囊状皮肤类器官进行展平操作。（A） 使用无菌手术刀切除囊状皮肤类器官上积累副产物的一极。（B） 修剪皮肤类器官的上下两端，以利于组织展开。（C） 将展平的组织切成 2–4 块。使用无菌镊子将每一块组织表皮面朝上转移并展平至胶原蛋白包被的培养插件上。（D） 将含有展平组织的培养插件放入标准的 12 孔板中，每孔加入 600 μL 培养基。（E） 将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。（F） 图（B）所示皮肤类器官的示意图横截面。（G） 图（C）所示皮肤类器官的示意图横截面。（H） 一个平面皮肤类器官放置于 I 型胶原凝胶上的图像，该凝胶浇注在置于 12 孔板内的细胞培养插件上，孔中含 600 μL 培养基。缩写：SO = 皮肤类器官；LAF = 层流洁净空气。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示27天内表皮层变化的组织学和免疫荧光图像；角蛋白和兜甲蛋白标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4：hiPSC来源的平面皮肤类器官的表征。（A）平面皮肤类器官在压平后第1天和第27天的代表性H&amp;E染色明场图像。至第27天，平面皮肤类器官显示出皮肤成熟特征，具有多层表皮以及包含类似皮脂腺结构（箭头）的毛囊（HFs）。（B）平面皮肤类器官切片的共聚焦图像，使用抗β4整合素抗体与抗角蛋白10抗体或抗兜甲蛋白抗体进行染色，显示第1天存在早期上基底层分化（KRT10+细胞），第27天出现晚期分化（LOR+层）。细胞核用DAPI复染。比例尺：（A） 50 µm；（B） 100 µm。缩写：SO = 皮肤类器官；hiPSC = 人诱导性多能干细胞；H&amp;E = 苏木精和伊红；β4 = b4整合素；KRT10 = 角蛋白10；LOR = 兜甲蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案概述了一种利用平面化、符合生理条件的气液界面培养系统，从人类诱导多能干细胞生成包含毛囊的皮肤类器官的方法，以模拟皮肤的结构与功能。

由人诱导性多能干细胞（hiPSC）衍生的含毛囊皮肤类器官（SOs）为……提供了一种复杂的体外模型

我的研究目标是尝试建立一种由中波紫外线（UVB）诱导的损伤模型，以便研究一种罕见疾病——着色性干皮病（xeroderma pigmentosum）的致病机制，更准确地说，是XPA型着色性干皮病。这类体外模型面临的一个挑战是培养所需时间较长，大约需要四个月；同时由于该领域仍处于相对早期阶段，我们仍需对该模型进行更深入的表征。该模型的优势在于，由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的三维模型在气液界面培养条件下，能够重现人类皮肤的结构，并具有皮脂腺和毛囊等皮肤附属器。首先，通过将氢氧化钠颗粒加入一个空的15毫升离心管中来配制1摩尔的溶液。向颗粒中加入蒸馏水，并涡旋振荡离心管以溶解颗粒。使用孔径为0.2微米的膜滤器对0.1摩尔的氢氧化钠溶液进行过滤除菌。置于冰上，用10倍体积的PBS、5毫摩尔氢氧化钠和蒸馏水稀释I型胶原蛋白溶液，以调节至终体积。将150微升该胶原蛋白溶液加入每个插入式培养小室中，插入物置于标准的12孔板内。将培养板在37摄氏度孵育30分钟，使胶原凝胶聚合。接下来，使用加热的解剖刀切割P1000枪头，以制备宽口枪头。然后，用宽孔枪头将选定的囊状结构连同少量培养基转移至直径10厘米的培养皿盖上。在用无菌镊子从对侧固定该结构的同时，使用无菌解剖刀小心切除其任何副产物。使用手术刀，在囊性皮肤类器官靠近第一切口的两端各切除约一毫米。用无菌镊子轻轻展开皮肤的上层。根据组织大小，将其切成两到四块。然后，使用无菌镊子将每块组织转移至经胶原蛋白包被的插入式培养小室中，确保表皮朝上。向标准的12孔板的每个孔中加入600 µL OMM。将插入式培养小室转移回含有OMM的12孔板中。然后将培养板放入含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中。通过小心操作和离心处理，至第0天时形成一个包含大部分细胞的单一、致密的细胞聚集体。适当的表皮诱导使得在第3天时聚集体外层形成一层薄而透明的上皮。到第12天时，在囊泡的一极已积累了一层薄薄的间充质细胞。毛囊胎基和毛芽在上皮与间充质相互诱导后的第50至80天变得可见。缺乏明显胎基的类器官表现出上皮层极薄，被排除在平面转化之外。仅选择直径至少五毫米且具有极性副产物的囊状结构用于平面皮肤类器官的生成。毛囊在气液界面培养的27天内逐渐伸长。皮脂腺在平面构型中约第14天时开始可见。类器官中的色素沉着随时间推移逐渐增加。苏木精和伊红染色显示了分层的上皮以及将其与真皮层分隔开的基底膜。免疫荧光染色证实了平面皮肤类器官中具有类似人类皮肤的结构。

generation-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-planar-hair

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用气液界面培养系统生成人诱导多能干细胞来源的平面生毛皮肤类器官

本视频详细介绍了生成 体外 用于研究黑色素瘤进展的三维类器官皮肤重建模型。该皮肤模型可模拟器官的结构及多细胞复杂性 体内.

类器官全层皮肤重建的生成：利用人皮肤样本建立三维皮肤模型的操作流程

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。...

生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。...

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

我们提出了一种实验方案，用于诱导多能干细胞来源的角质形成细胞和成纤维细胞的分化，并利用这些角质形成细胞和成纤维细胞构建三维皮肤类器官。该方案包含建立人源化小鼠模型的额外步骤。本文所介绍的技术将有助于推动皮肤科领域的研究进展。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞生成三维皮肤类器官

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。...

生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。...

利用自制微型生物反应器由诱导性多能干细胞生成脑类器官

本方案描述了人诱导性多能干细胞衍生的类似2型肺泡上皮细胞（iAT2s）。这些细胞可在三维培养条件下以自我更新的球体形式进行培养，或适应于气液界面（ALI）培养条件。...

生成人诱导性多能干细胞来源的2型肺泡上皮细胞的三维球体及二维气液界面培养模型

近年来，人类诱导性多能干细胞分化技术的进步使得能够逐步获得特定器官的细胞类型。本文详细介绍了由诱导性多能干细胞衍生的气道基底细胞的维持与扩增步骤，以及在气液界面培养条件下将其分化为黏液纤毛上皮细胞的具体方法。...

由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

本方案描述了从人类多能干细胞和诱导性多能干细胞生成自组织血管的方法。这些血管网络表现出广泛且相互连接的内皮细胞网络，周围分布着周细胞、平滑肌肌动蛋白以及连续的基底膜。...

从多能干细胞生成人血管类器官

本方案介绍了一种利用人多能干细胞生成血管类器官的方法。...

由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

学习利用气液界面培养系统，从人诱导多能干细胞生成功能性平面生毛皮肤类器官。该方法可重现人类皮肤结构及毛囊等皮肤附属器，为研究着色性干皮病等皮肤疾病提供重要体外模型。

利用气液界面培养系统生成人诱导性多能干细胞来源的含毛囊平面皮肤类器官

探索更多视频