利用气液界面培养系统生成人诱导性多能干细胞来源的含毛囊平面皮肤类器官

我的研究目标是尝试建立一种由中波紫外线（UVB）诱导的损伤模型，以便研究一种罕见疾病——着色性干皮病（xeroderma pigmentosum）的致病机制，更准确地说，是XPA型着色性干皮病。这类体外模型面临的一个挑战是培养所需时间较长，大约需要四个月；同时由于该领域仍处于相对早期阶段，我们仍需对该模型进行更深入的表征。该模型的优势在于，由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的三维模型在气液界面培养条件下，能够重现人类皮肤的结构，并具有皮脂腺和毛囊等皮肤附属器。

首先，通过将氢氧化钠颗粒加入一个空的15毫升离心管中来配制1摩尔的溶液。向颗粒中加入蒸馏水，并涡旋振荡离心管以溶解颗粒。使用孔径为0.2微米的膜滤器对0.1摩尔的氢氧化钠溶液进行过滤除菌。

置于冰上，用10倍体积的PBS、5毫摩尔氢氧化钠和蒸馏水稀释I型胶原蛋白溶液，以调节至终体积。将150微升该胶原蛋白溶液加入每个插入式培养小室中，插入物置于标准的12孔板内。将培养板在37摄氏度孵育30分钟，使胶原凝胶聚合。

接下来，使用加热的解剖刀切割P1000枪头，以制备宽口枪头。然后，用宽孔枪头将选定的囊状结构连同少量培养基转移至直径10厘米的培养皿盖上。在用无菌镊子从对侧固定该结构的同时，使用无菌解剖刀小心切除其任何副产物。

使用手术刀，在囊性皮肤类器官靠近第一切口的两端各切除约一毫米。用无菌镊子轻轻展开皮肤的上层。根据组织大小，将其切成两到四块。

然后，使用无菌镊子将每块组织转移至经胶原蛋白包被的插入式培养小室中，确保表皮朝上。向标准的12孔板的每个孔中加入600 µL OMM。将插入式培养小室转移回含有OMM的12孔板中。

然后将培养板放入含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中。通过小心操作和离心处理，至第0天时形成一个包含大部分细胞的单一、致密的细胞聚集体。适当的表皮诱导使得在第3天时聚集体外层形成一层薄而透明的上皮。到第12天时，在囊泡的一极已积累了一层薄薄的间充质细胞。

毛囊胎基和毛芽在上皮与间充质相互诱导后的第50至80天变得可见。缺乏明显胎基的类器官表现出上皮层极薄，被排除在平面转化之外。仅选择直径至少五毫米且具有极性副产物的囊状结构用于平面皮肤类器官的生成。

毛囊在气液界面培养的27天内逐渐伸长。皮脂腺在平面构型中约第14天时开始可见。类器官中的色素沉着随时间推移逐渐增加。

苏木精和伊红染色显示了分层的上皮以及将其与真皮层分隔开的基底膜。免疫荧光染色证实了平面皮肤类器官中具有类似人类皮肤的结构。