Name: 使用 SegElegans 自动分析 秀丽隐杆线虫 荧光图像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T14:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 了解SegElegans深度学习系统如何自动分割秀丽隐杆线虫显微图像。该方法将分割时间从245秒缩短至60秒以内，准确率达93%以上，为遗传学和细胞生物学研究提供高效工具。

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作者所在实验室的工作由总秘书处资助 
希腊发展部的研究与创新项目， 
欧盟 - 下一代欧盟（项目编号：TAEDR-0535850，简称： 
BrainPrecision) 作为行动框架的一部分 &#34;旗舰行动 
具有特殊关联性的跨学科科学领域 
到生产性织物，&#34; 在国家复苏与韧性框架下 
方案 &#34;希腊 2.0&#34;，欧盟委员会研究执行署 
卓越中心 &#34;改变&#34; （GA-101087071）和希腊基金会 
希腊研究与创新基金会（H.F.R.I.） &#34;首次呼叫 H.F.R.I. 
支持教职员工和研究人员的研究项目 
高成本科研设备的采购&#34; （项目编号： 
HFRI-FM17C3-0869，NeuroMitophagy

以下部分包含如何有效使用 SegElegans 的详细说明（图2）。内容包括图像采集的准备工作（第1节）、在线运行模型（第2节）或离线运行模型（第3–5节），以及将感兴趣区域（ROI）导入 ImageJ 或其他工具的方法（第6节）。由于通过该模型对图像进行评估需要配备至少6 GB（理想情况下更高）显存（VRAM）的、支持 CUDA 的图形处理器（GPU）的计算机，因此大多数用户（若可访问谷歌服务）建议使用基于云计算的在线版本，该版本能够满足并超越上述硬件要求（第1节 &gt; 第2节 &gt; 第6节）。 alternatively，对于具备足够性能硬件且具备命令行/终端基础操作知识的用户（或无法访问上述云服务的用户），本地运行模型可能更为便捷（第1节 &gt; 第3节 &gt; 第4或第5节 &gt; 第6节）。
1. 样本和引导图像的获取
<ol>
	<li>使用 SegElegans 获取任意线虫品系成虫的分割结果，无论其是否表达荧光报告基因。如果感兴趣表型/数据需在明场图像中测量，请使用宽场显微镜及配套软件，配合 4 倍或类似物镜正常采集图像。 
	注意：SegElegans 可分析亮度和对比度范围较广的图像，但应避免出现过曝的亮像素或暗像素。在图像尺寸方面，系统训练所用图像为 1328 × 1048，但应可适用于任何不小于 512 × 512 的图像。</li>
	<li>如果感兴趣表型/数据需在暗场图像中测量（通常在使用一种或多种转基因荧光报告基因或染料时），请同时采集明场图像作为引导图像（如步骤 1.1 所述）。确保引导图像在空间上与荧光通道的暗场图像完全匹配，并尽可能在时间上接近，理想情况下应使用显微镜操作软件提供的多通道采集功能实现。将引导图像与对应的暗场数据图像分别保存在不同文件夹中，并使用相同的文件名。</li>
</ol>
2. 运行 SegElegans 的在线版本
<ol>
	<li>在网页浏览器中登录 Google 账号。建议为此目的创建一个全新的专用实验室账号。</li>
	<li>进入 Google 云端硬盘（https://drive.google.com），上传包含明场图像的文件夹（数据或引导图像）。如前所述，若使用引导图像为暗场图像生成感兴趣区域（ROI），请勿将相应的暗场数据图像包含在此文件夹中。</li>
	<li>访问 https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0，点击 SegElegans Body Prediction Interface.ipynb 文件，然后点击文件打开后顶部的 Open in Colab 按钮。SegElegans 的 Jupyter 笔记本/界面将在 Google Colab 中打开。</li>
	<li>通过点击标题下方的播放（<img alt="用于播放或启动功能的黑色右指三角符号。" src="/files/ftp_upload/69094/69094eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式 1">）按钮执行代码块 1。授予运行时权限以运行代码，并在执行完成后查看输出结果（播放按钮旁会出现绿色对勾）。Colab 应自动运行正确且与 CUDA 兼容的运行时，并显示 NVIDIA-SMI 输出表格。否则，请通过 运行时 &gt; 更改运行时类型 菜单强制使用 T4 GPU 运行时。</li>
	<li>执行代码块 2，将 Google 云端硬盘的内容加载到运行时中。接受所有确认对话框并授予所有请求的权限。</li>
	<li>依次执行代码块 3 和代码块 4。代码块 3 需要几分钟才能完成，请确保绿色对勾出现后再继续执行代码块 4。</li>
	<li>点击 Colab 界面左侧的文件夹图标，将显示已加载到运行时中的文件，包括以 /content/drive/MyDrive 形式导入的云端硬盘内容。右键点击图像所在的文件夹，复制路径，并将其粘贴到代码块 5 的 test_images 输入框中。确保路径格式如下：/content/drive/MyDrive/Imagefolder。同样地，在代码块 5 中指定分析结果的输出路径（例如：/content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output）。请注意，此环境中的路径使用正斜杠分隔文件夹（/）。</li>
	<li>执行代码块 5。</li>
	<li>在代码块 6 提供的输入框中，准确指定模型要分析的图像文件扩展名。对于此输入，“.tif”、“.TIF”和“.tiff”被视为不同的扩展名。</li>
	<li>如果系统在默认的 T4 GPU 运行时下运行（该运行时每天为所有用户提供有限的免费使用时长，具体取决于使用情况），请勿调整代码块 6 中的 batch_crop_img 输入。如果运行时出现内存不足问题，则应减小该值。</li>
	<li>执行代码块 6。此过程需要一定时间，请确保绿色对勾出现后再继续下一步。</li>
	<li>执行代码块 7。对于默认的 T4 运行时，请勿调整其输入参数；但如果出现内存不足问题，可减少子进程数量或完全禁用并行处理。此步骤也将耗时较长。</li>
	<li>在另一个浏览器窗口或标签页中访问 Google 云端硬盘，并导航至第 2.7 步指定的输出文件夹。 
	注意：此时，SegElegans 已完成分割结果的初步评估和后处理，并创建了多个包含输出结果的子文件夹。0_summary results 包含每张图像输出结果的汇总图表，每条线虫被分配一个索引编号。1_complete_mask 包含算法判定可用于分析的所有分割结果的经筛选二值掩膜。1_edge_small_mask 包含因线虫过小或部分位于图像边缘而被算法拒绝的所有分割结果的二值掩膜。1_overlap_mask 包含存在真实重叠的线虫分割结果的二值掩膜，默认情况下这些结果不会被加入筛选后的输出。1_all_rois_results 包含所有 3 类分割结果（无论是否经过筛选）的 ImageJ 格式文件（含 ROI 的压缩包）。</li>
	<li>此时，请选择以下三种选项之一：
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中使用 1_all_rois_results 提供的 ROI，并在导入后手动剔除不需要的 ROI（参见第 6 节操作流程）。</li>
		<li>接受经筛选的高质量掩膜，不进行任何手动校正（且不包含重叠线虫）（跳至第 2.16 步）。</li>
		<li>通过手动选择要包含在输出中的线虫（包括重叠的线虫）来调整筛选结果（继续至第 2.15 步）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若需手动调整筛选结果，请使用代码块 8。检查 0_summary results 文件夹中汇总图表的初步筛选结果。对于每张需要校正的图像，在“name_image_change”输入框中填写原始输入图像的完整文件名（含扩展名），并在“index_images”输入框中填写需要保留的掩膜编号（来自汇总图表），编号之间用英文逗号分隔。执行代码块 8。对其他需要校正的图像重复此步骤。</li>
	<li>完成校正后，或用户选择接受初始筛选结果而不做任何修改（且不包含重叠线虫），执行代码块 9。将在 Google 云端硬盘的输出文件夹中创建一个名为 2_curated_rois_results 的新子文件夹。该文件夹包含所有最终经筛选的分割结果，格式为 ImageJ 格式（含 ROI 的压缩包）。</li>
	<li>若需对另一图像文件夹重新执行该流程，请通过菜单 运行时 &gt; 重启会话 重置运行时，然后从头开始。</li>
</ol>
3. 首次使用前准备 SegElegans 的离线版本
<ol>
	<li>作为在 Colab 上在线运行 SegElegans 的替代方案，我们为无法或不愿使用 Google 云计算服务的用户提供了一个离线版本的 SegElegans。该版本需要一台配备支持 CUDA 的 GPU（https://developer.nvidia.com/cuda-gpus）的 PC（Windows 或 Linux），且 GPU 显存至少为 6 GB（如果条件允许且预算充足，建议使用 16 GB）。 
	注意：以下第 3 至第 5 节的说明主要针对 Windows 系统，但该软件也可在基于 Linux 的系统上运行，仅需对所用命令进行少量修改。</li>
	<li>从 https://developer.nvidia.com/cuda-downloads 下载 CUDA 工具包安装程序，并根据说明选择适用于所用设备的版本。 
	注意：SegElegans 已在 Windows 系统下使用工具包版本 12.9 和 13.0 以及 CUDA 版本 11 进行测试，预计未来版本将保持向后兼容性。
	<ol>
		<li>按照安装程序自身的说明安装该工具包。无需安装 Visual Studio。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 https://www.python.org/downloads/ 下载适用于设备的 Python 安装程序版本。按照安装程序自身的说明安装 Python，并确保将 python.exe 添加到 PATH 环境变量中。 
	注意：SegElegans 基于 Python 3.13 构建和测试，但预计未来版本将保持向后兼容性。</li>
	<li>前往 https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1，点击源代码（zip）链接，下载包含在本地设置和运行 SegElegans 所需文件的软件包。</li>
	<li>解压 zip 文件，并将其放置在较高层级甚至顶层目录中，例如 C:\SegElegans。压缩包内的内容已包含在一个名为 SegElegansOffline-1 的子文件夹中。</li>
	<li>打开 Windows 命令提示符（cmd.exe），输入命令 python -m venv "fullsegeleganspath"，其中 "fullsegeleganspath" 是指向 SegElegansOffline-1 子文件夹的完整路径，需用引号括起。 
	注意：例如，若 zip 文件被解压至 C:\SegElegans，则完整路径为 C:\SegElegans\SegElegansOffline-1，对应命令为 python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1"。请注意，此环境中的路径使用反斜杠分隔文件夹（"\"）。</li>
	<li>在命令提示符中，使用标准命令进入 SegElegansOffline-1 文件夹，然后执行命令 Scripts\activate。此时下一条提示符前应出现 (SegElegansOffline-1) 标签，表示 Python 虚拟环境已激活。</li>
	<li>在已激活的 (SegElegansOffline-1) 环境中，运行命令 pip install -r requirements.txt。此过程将耗时若干分钟。</li>
	<li>输入并执行命令 python assemblenetworks.py。 
	注意：SegElegans 现已准备就绪，可开始运行。提供两种运行方式：一种是快速脚本，可自动输出所有分割结果为 ImageJ 的 ROI 文件，但不支持手动修正标注（见第 4 节）；另一种是本地 Jupyter 笔记本，支持查看和修正标注结果（见第 5 节）。推荐大多数用户采用后者。</li>
</ol>
4. 使用快速脚本运行 SegElegans 的离线版本
<ol>
	<li>打开 Windows 命令提示符（cmd.exe）。如步骤 3.7 所述，导航至 SegElegans 环境文件夹并激活该环境。</li>
	<li>为了使用快速脚本，在命令提示符中激活 (SegElegansOffline-1) 环境后，输入并执行命令 python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x &lt;fileextension&gt;，其中 "pathtoinputfolder" 是包含明场图像文件夹的完整路径（需用引号括起，例如 "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"），而 &lt;fileextension&gt; 是用户希望分析的图像文件的精确扩展名（例如 ".TIF"）。输入命令 python SegElegansBodyQuickEval.py -h 可查看其他可选参数说明，这些参数可根据设备性能进行调整以加快脚本处理速度。 
	注意：在此情况下，输出文件夹将自动创建于输入文件夹内部（以上例而言，即 "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"）。该输出文件夹内包含一系列子文件夹：0_summary results 包含对每幅图像结果的汇总图，每条线虫均被分配一个索引编号；1_complete_mask 包含算法判定可用于分析的所有非重叠分割的经筛选二值化掩膜；1_edge_small_mask 包含算法因线虫个体过小或部分位于图像边缘而被排除的所有分割的二值化掩膜；1_overlap_mask 包含所有存在真实重叠的线虫分割的二值化掩膜；1_all_rois_results 包含全部 3 类分割结果（无论是否经过筛选），以 ImageJ 格式存储（含 ROI 的压缩文件）；由于此处无法手动修正筛选结果，2_curated_rois_results 默认包含算法判定为合格的所有分割结果以及所有重叠分割结果，均以 ImageJ 格式存储（含 ROI 的压缩文件）。</li>
</ol>
5. 使用 Jupyter Notebook 运行 SegElegans 的离线版本
<ol>
	<li>打开 Windows 命令提示符（cmd.exe）。如步骤 3.7 所述，导航至 SegElegans 环境文件夹并激活该环境。</li>
	<li>为了使用 Jupyter 界面，在命令提示符中处于激活的 (SegElegansOffline-1) 环境时，输入并执行命令 jupyter notebook。这将打开一个浏览器窗口/标签页，显示本地托管的网站。在初始界面中，选择文件 SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb。</li>
	<li>通过选中代码块 1（点击代码左侧区域）并点击工具栏上方的播放按钮（<img alt="用于播放或启动功能的黑色右指三角符号。" src="/files/ftp_upload/69094/69094eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式 1">）来执行代码。代码执行完成后，代码块下方将显示确认信息。</li>
	<li>执行代码块 2。这将在代码块下方的输出区域生成一些输入表单。在生成的表单中填写输入文件夹的路径（包含明场图像，例如："D:\Data\Experiment12365\Condition 1"）、分析结果的输出路径（例如："D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"），以及待分析图像的精确文件扩展名（例如 ".TIF"）。如果设备性能足够，可调整其他提供的设置（将每批次的子裁剪数量增加至 9 或 16，并运行多个并行的后处理进程）。</li>
	<li>执行代码块 3。</li>
	<li>执行代码块 4。此过程需要一定时间，请确保执行完成后再继续下一步。</li>
	<li>执行代码块 5。此过程同样需要一定时间。完成后，请导航至上述指定的输出文件夹。 
	注意：此时 SegElegans 已完成对分割结果的初步评估和后处理，并创建了多个包含输出内容的子文件夹。0_summary results 包含每张图像输出结果的汇总图，每条线虫被分配一个索引编号。1_complete_mask 包含算法判定可用于分析的所有分割结果的经筛选二值掩膜。1_edge_small_mask 包含因线虫过小或部分位于图像边缘而被算法拒绝的所有分割结果的二值掩膜。1_overlap_mask 包含存在真实重叠的线虫分割结果的二值掩膜，默认情况下这些结果不会被加入筛选后的输出。1_all_rois_results 包含所有 3 类分割结果（无论是否经过筛选）的 ImageJ 格式文件（含 ROI 的压缩包）。</li>
	<li>与 SegElegans 在线版本类似，可使用以下三种选项中的任意一种：
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中使用 1_all_rois_results 提供的 ROI，并在导入后手动剔除不需要的 ROI（参见第 6 节实验方案）。</li>
		<li>直接接受算法自动筛选出的有效掩膜，不进行任何手动校正（且不包含重叠线虫）（跳至步骤 5.11）。</li>
		<li>手动调整筛选结果，选择要包含在输出中的线虫（包括重叠的线虫）（继续至步骤 5.9）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若需手动调整筛选结果，请使用代码块 6 和 7。首先执行代码块 6，这将在代码块下方的输出区域生成输入表单。</li>
	<li>检查 0_summary results 子文件夹中汇总图所显示的初步筛选结果。对于每张需要修正的图像，在 Image to correct 表单中输入输入图像的完整文件名（含扩展名），并在 Masks to keep 表单中输入需要保留的掩膜编号（来自汇总图中的编号，多个编号以逗号分隔）。执行代码块 7 并确保执行完成。对其他需要修正的图像重复此步骤。</li>
	<li>完成筛选修正后，或用户选择接受初始筛选结果而不做任何修正（且不包含重叠线虫），执行代码块 8。在指定的输出文件夹中将创建一个名为 2_curated_rois_results 的新子文件夹，其中包含所有最终筛选后的分割结果（ImageJ 格式，含 ROI 的压缩包）。</li>
	<li>若需对另一图像文件夹重新执行该流程，请通过菜单 Kernel &gt; Restart Kernel and Clear Outputs of all Cells 重置运行环境，然后从头开始。</li>
</ol>
6. 将分割结果导入 ImageJ（或其他替代软件）
<ol>
	<li>在 ImageJ 中打开一张实际数据图像。</li>
	<li>打开与该图像对应的包含 ROI 的压缩文件。这会将选区加载到 ImageJ 的 ROI 管理器中。如果这些 ROI 来自 2_curated_rois_results 输出结果，则可直接使用常规方法进行分析（建议结合宏以进一步实现自动化并加快分析流程）。</li>
	<li>如果这些 ROI 来自 1_all_rois_results 的输出结果，需从 ROI 管理器中移除不需要的分割区域。选中这些区域后，点击管理器窗口中的 Delete 按钮。请勿按下键盘上的 Delete 键，因为这会删除图像中选区的内容，而非管理器中的条目。</li>
	<li>若分析需使用 ImageJ 以外的软件，则 ROI 格式很可能不兼容。此时，应以通用的二值化掩膜格式导入分割结果，相关文件位于 1_complete_mask 和 1_overlap_mask 文件夹中。请参考目标软件的使用说明，了解如何执行此类导入操作。</li>
</ol>

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<li>Castro, P. E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SegElegans%3A+Instance+segmentation+using+dual+convolutional+recurrent+neural+network+decoder+in+Caenorhabditis+elegans+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">SegElegans: Instance segmentation using dual convolutional recurrent neural network decoder in Caenorhabditis elegans microscopic images.</a> Comput Biol Med. 190, 110012(2025).</li>
<li>Trebing, K., Stańczyk, T., Mehrkanoon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmaAt-UNet%3A+Precipitation+nowcasting+using+a+small+attention-UNet+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognit+Lett%22%5BJournal%5D)">SmaAt-UNet: Precipitation nowcasting using a small attention-UNet architecture.</a> Pattern Recognit Lett. 145, 178-186 (2021).</li>
<li>Woo, S., Park, J., Lee, J. Y., Kweon, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBAM%3A+Convolutional+block+attention+module%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">CBAM: Convolutional block attention module.</a> arXiv. , (2018).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convolutional+LSTM+network%3A+A+machine+learning+approach+for+precipitation+nowcasting%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Convolutional LSTM network: A machine learning approach for precipitation nowcasting.</a> arXiv. , (2015).</li>
<li>Stuhr, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lipid+quantification+in+Caenorhabditis+elegans+by+Oil+Red+O+and+Nile+Red+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid lipid quantification in Caenorhabditis elegans by Oil Red O and Nile Red staining.</a> Bio Protoc. 12 (5), e4340(2022).</li>
<li>Kuzmic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+visualization+of+carbonylation+and+its+co-localization+with+proteins%2C+lipids%2C+DNA+and+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">In situ visualization of carbonylation and its co-localization with proteins, lipids, DNA and RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radic Biol Med. 101, 465-474 (2016).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells%2C+C.+elegans%2C+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. elegans, and mice.</a> J Vis Exp. (129), e56301(2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所介绍的方法可使用户在显著缩短的时间内分析 C. elegans 显微成像实验数据，且不会损失任何准确性。由于该方法从明场引导图像中提取分割结果，而无需依赖实际的荧光信号（如方案第1节所述），因此可适用于任何品系，以及任何需要对单条线虫进行表型测量的应用场景。这些应用场景包括单通道应用，例如疾病模型中异常蛋白质聚集体形成的定量分析10（如图2所示示例）、转录报告基因活性的检测26，或脂滴的大小与数量分析44；也可包括多通道检测，例如利用比率型传感器测量过氧化氢水平27、细胞器与蛋白质共定位的评估11、大分子修饰的检测45，以及多种类型自噬过程的定量分析8,46</sup...

秀丽隐杆线虫 是一种在细胞生物学和分子生物学领域广泛应用的真核模式生物1,2,3它是一种小型土壤线虫（野生型成虫约1毫米），具有快速的生活周期（约三周）和大量后代（通常与自体受精的雌雄同体亲本基因相同）。尽管结构相对简单，该生物仍是一种复杂的多细胞生物，具有明确且分化的组织和器官，因其体型小且身体透明，这些特征可被深入研究 体内 无需固定或其他侵入性处理4. 蠕虫的这种能力 在体 通过使用荧光报告分子，显微镜研究可得到进一步增强，这些报告分子能够轻松区分单个细胞，甚至可直接可视化线粒体、脂滴或蛋白质聚集体等亚细胞器/组分，以及信号转导、基因表达、囊泡融合、自噬、神经元和肌肉动作电位等过程。5,6,7,8,9,10,11此外，该线虫还非常易于通过诱变进行遗传操作。12，通过显微注射或微粒轰击进行的转基因13，CRISPR 编辑14，以及最重要的一点，在进行简便且经济的遗传筛选时，RNAi15这种操作不仅能够对基因及其在线虫自身中的作用进行广泛研究，同时由于线虫与人类之间存在显著的遗传同源性， 秀丽隐杆线虫 与其他模式生物具有共通性，从而做出从基础到人类均具重要意义的开创性发现16,17最后，这种同源性/保守性也使得线虫成为药物和化学试剂的理想的初步测试平台，有助于阐明药物作用机制，鉴定可能影响药物活性的遗传变异，并发现潜在的不良相互作用和脱靶效应18,19,20.
上述所有优点使得 秀丽隐杆线虫 细胞和分子生物学研究的优选模型，尤其适合对以下领域感兴趣的研究人员 体内 并通过显微镜实现对过程的实时监测。此类研究通常需要借助特殊软件进行大量的图像分析，其中使用最广泛的软件是 ImageJ。21,22,23通过此类软件进行分析的一个共同特征是，用户/研究人员需要使用选择工具指定用于分析的感兴趣区域（ROIs）。通常情况下，图像中的每条单个线虫都会被选为独立的ROI，目的是获取关于其简单形态特征（如体长、体宽等）或更复杂的 &#34;高级&#34; 实验读出指标包括基因表达水平（通过荧光报告基因检测）、比率型报告基因的读数、脂滴的数量和大小、蛋白质聚集体的形成、单个细胞器及其网络的形态等。5,8,10,24,25,26,27这些单条线虫的选择通常需手动完成，因为基于标准图像处理算法的自动选择方法通常难以准确区分线虫的形态和特征，尤其是在暗场图像中线虫轮廓不清晰，或明场图像中存在大量相互接触和重叠的个体时。然而，手动操作过程较为缓慢（每条线虫耗时约20秒至1分钟，具体取决于所需精度和操作者的经验），费力，且容易受到操作者主观偏差和误判的影响。
一种替代且功能强大得多的方法是利用深度学习/神经网络技术，自动完成单个秀丽隐杆线虫（C. elegans）感兴趣区域（ROI）的生成（该任务在计算机视觉领域通常称为分割）。基于Mask R-CNN28和U-net架构29的卷积神经网络已在多种生物模型系统的分割任务中取得了较好的效果30,31,32，包括在C. elegans33,34,35,36,37,38,39中的应用。然而，这些方法均未能令人满意地解决在高分辨率图像中对大量相互接触甚至完全重叠的线虫进行个体区分（即实例分割）并生成完整身体分割的难题。为满足这一需求，我们开发了SegElegans——一种专为此任务设计并优化的深度学习模型40。
SegElegans 包含两个主要部分（图1）。第一部分是一种双头U-net变体的卷积神经网络，由一个编码器模块和两个解码器模块组成。编码器模块基于SmaAt AT模型41，每一层均采用双卷积模块，并连接至卷积块注意力模块（Convolutional Block Attention Module, CBAM）42。两个解码器模块基于卷积长短期记忆（convolutional long short-term memory, LSTM）网络43。其中一个解码器负责将图像中每个像素分类为线虫主身体部分、线虫边缘部分、背景部分，或线虫重叠区域部分（这通常称为语义分割）。另一个解码器负责沿每条线虫的长度方向绘制一条线性&#34;骨架&#34;。第二部分是一种后处理算法，用于整合两个解码器的输出，并据此生成精确的实例分割结果。该算法首先通过比较语义分割输出与骨架输出，识别出真实的重叠区域；随后，对于无重叠的线虫直接输出实例分割结果，而对于重叠的线虫则通过组合各片段生成最终分割结果40。这些分割结果以二值掩膜形式保存，同时也保存为与ImageJ兼容的感兴趣区域（ROIs）。

<table><tbody><tr><td>配备互联网接入的计算机（示例：Dell Vostro 台式机）</td><td>多家厂商（例如 Dell）</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>这将允许通过云计算在线运行 SegElegans（推荐方式），并使用 ImageJ 等图像分析软件。</td></tr><tr><td>支持 CUDA 的图形处理器，至少具备 6 GB 显存（示例：MSI GeForce RTX&amp;nbsp;RTX3050 Ventus 2X 6GB）（可选）</td><td>NVIDIA 及多家制造商（例如微星国际 Micro Star International）</td><td>https://developer.nvidia.com/cuda-gpus</td><td>这将允许在本地计算机上离线运行 SegElegans。&lt;br/&gt; 支持 CUDA 的 GPU 芯片组信息可在此处查询：&lt;br/&gt; https://developer.nvidia.com/cuda-gpus&lt;br/&gt; 显存容量取决于制造商对芯片组的实际 GPU 实现。&lt;br/&gt; 警告：若要达到云计算版本的性能水平，您需要远超最低要求的昂贵且高性能的 CUDA 显卡（至少 16 GB 以上显存）。</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜（Invitrogen EVOS FL Auto 2）</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>例如 AMAFD2000</td><td>我们建议使用能够几乎同时自动获取明场和一个或多个荧光通道图像的系统。</td></tr><tr><td>ImageJ（可选）</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td>我们推荐使用 Fiji 发行版，下载地址如下：&lt;br/&gt; https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>支持 NVIDIA GPU 的个人计算机（示例：Dell Vostro 台式机）（可选）&amp;nbsp;</td><td>多家厂商（例如 Dell）</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>这是与 GPU 配合使用以在本地计算机上离线运行 SegElegans 所必需的。&lt;br/&gt; 安装 GPU 需要主板具备兼容 Windows 的硬件、适当的 PCI 插槽、足够的安装空间以及足够功率的电源供应。</td></tr><tr><td>SegElegans</td><td>-</td><td>https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0&amp;nbsp;</td><td>完整操作说明请参见论文原文。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

自动化分析 秀丽隐杆线虫 使用 segelegans 进行荧光成像

Automated Analysis of C. elegans Fluorescence Images using SegElegans

显微镜技术，尤其是荧光显微镜，是秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中常用的工具。然而，显微镜实验数据的分析可能非常繁琐且耗时。因此，自动化分析是理想的选择。我们开发了SegElegans，这是一种基于双头U-Net的卷积神经网络系统，专门用于自动分割线虫个体，即使在图像中存在大量相互接触或重叠的个体时也能有效工作。SegElegans的第一部分包含一个编码器和两个解码器。该编码器基于SmaAt AT模型，采用双卷积层，并随后连接卷积块注意力模块（Convolutional Block Attention Module, CBAM）。两个解码器均使用卷积长短期记忆网络（convolutional LSTM）：其中一个对线虫图像进行语义分割（分为身体、边缘、背景或重叠区域），另一个则沿每条线虫提取线性骨架。第二部分是一个后处理算法，用于整合两个解码器的输出，并据此生成精确的实例分割结果。这些分割结果随后可导入ImageJ或其他合适的图像分析工具中进行进一步分析。本文提供了访问和运行该系统的详细说明。我们提供了一种基于云计算的在线实现方式，同时也提供了两种可在本地计算机上离线使用SegElegans模型的方法（前提是具备相应的硬件条件）。

通过遵循本方案，研究人员应能够提取高质量的线虫分割结果，即使在荧光图像中无法看到线虫边界的情况下也能进行分析。如方案第6节所述，这些分割结果可直接导入ImageJ，并用于快速测量相关参数，例如荧光报告分子的强度（常用于表达量的定量）或荧光标记区域的数量、大小和形态（常用于研究蛋白质聚集体或细胞器）。此外，由于SegElegans被设计为以不依赖荧光信号的方式从明场图像中获取分割结果，因此它也可辅助多通道分析，包括测量强度比值（例如用于量化特定细胞器的自噬降解）或共定位指标（例如在尝试识别细胞器之间相互作用时使用）。
SegElegans 的分割交并比（IoU，Intersection over Union）得分超过 93%（表 1），在发表时优于其他替代方法40。在实际应用中，这意味着在将所有图像运行完所述方案后，仍会有部分线虫被错误分割；根据用户的具体需求，这些样本应从分析中排除，或在认为有必要纳入时，使用手动绘制的选区重新选择。
我们的测试表...

本文提供了有效使用SegElegans的详细说明。SegElegans是我们开发的一种深度学习系统，可用于对宽场显微镜图像中的单个线虫进行自动分割，进而用于ImageJ等图像分析软件。我们提供了该系统的在线和离线使用方法。

自动化分析 秀丽隐杆线虫 使用 SegElegans 进行荧光成像

显微镜技术，尤其是荧光显微镜，是秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中常用的工具。显微镜实验数据的分析可能……

秀丽隐杆线虫（C. elegans）的研究常规使用活体成像技术来监测生物学过程并解答细胞生物学相关问题。对成像数据的分析通常需要花费大量时间，在软件中通过手动选择来划定感兴趣的区域。目前可用的自动化生成单个线虫感兴趣区域（ROI）的方法在精确度方面仍存在不足。并且常常难以区分相互接触或重叠的线虫。首先，使用配备4倍物镜的宽场显微镜对成虫线虫进行成像。如果数据是在明场图像中采集的，则按常规方法获取图像。如果数据是在暗场荧光图像中采集的，请使用显微镜软件中的多通道采集选项，同时获取与之匹配的明场引导图像。确保将两组图像以相同的文件名保存，但存放在不同的文件夹中。要运行 SegElegans 的在线版本，首先需使用网络浏览器登录 Google 账户。进入 Google 云端硬盘并上传包含明场或引导图像的文件夹。打开 GitHub 页面，点击 SegElegans 身体预测界面 ipynb 文件。点击已打开文件顶部的“在 CoLab 中打开”按钮。确保 CoLab 正在运行支持 CUDA 的 GPU 运行时。点击播放按钮以执行第一个代码块，并授予运行时权限。接下来，执行代码块二以将 Google 云端硬盘加载到运行环境中。接受所有确认对话框，并授予所有请求的权限。然后按顺序执行代码块三和代码块四，确保代码块三完全执行完毕后再运行代码块四。在 CoLab 界面左侧打开文件夹标签图标，找到包含您的引导图像的文件夹。复制该路径，然后将其粘贴到代码块五的测试图像输入表单中。同时为分析结果指定一个独立的输出路径。执行第五个代码块。在第六个代码块中指定要分析的图像文件的确切扩展名。执行第六个代码块，并等待其完成。现在，无需更改输入即可执行第七个代码块，且较少出现内存问题。在单独的标签页或窗口中，访问 Google 云端硬盘并打开输出文件夹。选择以下三个选项之一。第一种选择是使用所有 ROI 结果中的 ROI，并在 Image J 中剔除不需要的 ROI。第二种选择是接受完整掩膜中经过筛选的良好掩膜，无需任何手动校正，但这种方法不会包含重叠线虫的分割结果。第三种也是推荐的选择是手动调整筛选结果。为此，请使用代码块八。通过零汇总结果文件夹中的汇总图表，检查初始人工校正的结果。对于每张需要修正的图像，在名称图像更改表单中输入原始输入图像的完整名称，并在索引图像表单中输入需保留的掩膜编号，编号之间用逗号分隔。现在，执行代码块八。完成或跳过人工校正后，执行代码块九以生成两个经过校正的感兴趣区域（ROI）结果文件夹。该文件夹包含以 Image J 格式保存的所有最终校正后的分割结果。要对一组新图像运行该流程，请通过导航到运行时（runtime），然后选择重新启动会话（restart session），从头开始重复整个过程。也可以在本地计算机上不依赖云计算运行 SegElegans，使用 Jupyter 或 Python 脚本即可实现。要导入分割结果，请在 ImageJ 中打开其中一个实际数据图像，然后打开包含该图像对应 ROI 的 zip 文件，以将选区加载至 ImageJ 的 ROI 管理器中。如果它们来自两个经过筛选的感兴趣区域（ROI）结果输出，则使用所需的方法继续进行分析，建议通过宏实现自动化。如果ROI来自一个包含所有ROI的结果输出，则需从ROI管理器中删除不需要的分割区域。在ROI管理器窗口中选择这些区域，然后按下删除按钮。然后正常进行分析。如果需要使用 Image J 以外的软件，则将分割结果作为二值掩膜导入。在验证和性能测试实验中，与手动分割相比，SegElegans 显著减少了每幅图像所需的平均处理时间。将处理时间从约245秒缩短至60秒以内。SegElegans的分割交并比得分超过93%，优于发表时所列的所有其他模型。SegElegans是一种深度学习系统，采用一种特殊架构，能够在图像中存在大量线虫的情况下，准确分割出单个线虫个体。SegElegans 是一种重要且多功能的工具，能够在不牺牲准确性的前提下帮助加快显微数据的分析速度。

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使用 SegElegans 自动分析 秀丽隐杆线虫 荧光图像

我们报道了一种用于多孔板中转基因斑马鱼胚胎自动成像与分析系统的开发。该系统展示了测量小分子BCI对成纤维细胞生长因子报告基因表达的剂量依赖性效应的能力，并为建立高通量斑马鱼化学筛选技术提供了支持。...

斑马鱼化学筛选的自动化成像与分析方法开发

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

我们开发了一种视频速率追踪显微镜系统，能够以高分辨率和高速度记录并量化秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 追踪与行为学测量

本视频介绍了使用视频和追踪软件在实验区域内记录线虫运动的方法。...

C. elegans 运动追踪：一种评估线虫运动能力的方法

本文介绍了一种高效且简便的基于计算机分析线虫在液体中游泳行为的方法。该方法对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CeleST 软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）游泳行为进行自动化分析

本文介绍了一个将大范围饮食限制与基因表达及寿命关联起来的研究框架。我们描述了实施大范围饮食限制的实验方案，以及在此条件下对基因表达进行定量成像的技术流程。此外，我们还概述了用于揭示参与食物感知的遗传回路中潜在信息处理特征的计算分析方法。...

在 C. elegans 中通过基因表达水平编码的信息量化：广泛范围饮食限制下寿命调控过程中的研究

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C.

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C.

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C.

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

Worm-align/Worm_CP 是一个简单的 FIJI/CellProfiler 工作流程，可用于拉直并排列Caenorhabditis elegans样本，并对全虫基于图像的检测进行评分，且无需预先训练步骤。我们已将 Worm-align/Worm_CP...

Worm-align 和 Worm_CP：两款用于对来自 Caenorhabditis elegans 的荧光图像数据进行拉直和定量分析的开源流程

了解SegElegans深度学习系统如何自动分割秀丽隐杆线虫显微图像。该方法将分割时间从245秒缩短至60秒以内，准确率达93%以上，为遗传学和细胞生物学研究提供高效工具。

自动化分析秀丽隐杆线虫使用 SegElegans 进行荧光成像

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