体外 利用上皮类器官-T细胞共培养系统进行驻留记忆CD8 T细胞分化
2026年2月3日
为了在 体外研究CD8 T细胞的分化和功能，可以从小鼠中分离出CD8 T细胞，与预先形成的感染小鼠阴道上皮类器官长期共培养。本文描述该过程，并评估共培养后常驻记忆T细胞标记的获得情况。
我们的研究探讨了女性生殖道中CD8常驻记忆T细胞，探讨感染和疾病如何影响其居住、功能、维持及治疗潜力。现有方法限制了驻留记忆T细胞的存活率和表型稳定性。该方案通过类器官T细胞培养培养诱导组织驻留，实现了可扩展的体外研究。
首先，在24孔板的每孔中，以20微升基底膜提取物密度10,000个细胞进行阴道上皮类器官（VEO）的板状板。将培养皿放入培养箱，并在37摄氏度下保持培养物7到10天。共培养前一天，从指定孔中抽取细胞培养基，并用DPBS清洗孔。
抽取DPBS，然后向井中注入600微升预热的0.25%胰蛋白酶EDTA。使用BSA涂层的P1000移液器，彻底重新悬浮，机械破坏基底膜提取物，并将井内内容物转移到涂有BSA涂层的无菌15毫升锥形管中。现在将锥形管放入37摄氏度的水浴中。
五分钟后，在RPMI中加入10毫升10%FBS以抑制胰蛋白酶化。然后将管子放入离心机，以4摄氏度以500克旋转五分钟，丢弃上清液。使用涂有BSA涂层的移液器尖端，将沉淀重新悬浮于100至300微升的T细胞类器官培养基或普通DMEMF 12中。
用血细胞计数细胞。利用总细胞数和已知病毒滴度计算达到0.1感染倍数所需的病毒体积。从选择感染的VEO孔中抽取细胞培养基。
用500微升预热的DPBS清洗每个井，并将盘子放入37摄氏度的孵化器中，浸泡五分钟。五分钟后，丢弃DPBS。添加500微升含有足够病毒颗粒的类器官培养基，以实现0.1的感染倍数。
将盘子放入37摄氏度的保温箱中，加以5%二氧化碳，每隔20到30分钟轻轻旋转盘子一小时。将适合镀层所需的基底膜提取物从零下80摄氏度的储存转移到4摄氏度，并解冻八小时。用光学显微镜检查VEOs，以评估体型和整体健康状况。
确认VEO直径约为100微米，形态均匀圆形，单细胞数量极少。从VEO孔中抽取细胞培养基，并用500微升冷无菌DPBS清洗，保持在2至8摄氏度。去除DPBS后，向每个井加入200至500微升冷类器官采集液，确保体积至少为基底膜提取物液滴的10倍。
然后使用涂有BSA涂层的P200移液器，机械破坏基底膜提取物。现在将板放置在一个轨道震动器上，设定为每分钟约100转、四摄氏度，持续20分钟。培养后，使用BSA涂层移液器尖端混合并转移每个孔中的内容物，进入BSA涂层的无菌15毫升锥形管中。
将管子放入离心机，以500克、四摄氏度旋转五分钟。然后丢弃上清液。用5到10毫升冷的DPBS清洗VEO颗粒，然后以500克离心机，在4摄氏度下离心五分钟。
先抽取DPBS，然后使用P1000移液器尖端，将沉淀重新悬浮于一毫升T细胞类器官培养基中，并将VEO悬浮液冰敷，直到T细胞准备好共培养。采集T细胞时，用光学显微镜检查静止T细胞，以评估大小和整体健康状况。确认T细胞表现出一定的聚集、形态增大，且无可见的细胞碎片或碎片。
使用P1000移液器，在孔的每个角落上下移液多次，将T细胞重新悬浮。采集锥形管，计数活体CD8 T细胞的总数。接着，将T细胞悬浮液放入离心机，以584 G、四摄氏度旋转五分钟。
丢弃上清液，将T细胞沉淀重新悬浮在10毫升T细胞类器官培养基中。然后将适当数量的T细胞转移到含有预先制备VEO的锥形管中，以结合细胞。将合并的VEO和T细胞悬浮液放入离心机，以584 G、四摄氏度旋转五分钟。
丢弃上清液后，将VEOs和T细胞重新置于相应容量的基底膜提取物中。然后用另一支移液器尖端将悬浮液镀到预热的组织培养板上，每孔分配20微升，形成24孔板。现在将组织培养板倒置，放置在37摄氏度的培养箱中。
让基底膜提取物的完全粘附和固化需要30分钟。培养期结束后，小心地将补充的完整T细胞类器官培养基加入每个孔中。对于24孔板，每孔滴注500微升，96孔板则为每孔250微升，介质贴在井侧，以避免扰动基底膜提取物液滴。
在样本采集进行流式细胞术分析前，每两天更换培养基。感染淋巴细胞性绒毛膜脑膜炎病毒、表达黄色荧光蛋白的七天大鼠VEO在共培养后四小时内就表现出丰富的病毒复制，这在类器内的荧光信号中可见。在共培养的后期时间点，CD8 T细胞在感染类器官附近的积累变得明显。
CD8 T细胞的渐进聚集与感染类器官中黄色荧光蛋白信号在后期时间点明显减少相关。与感染VEOs共培养的CD8 T细胞随时间显示CD 69和CD 103表达增加，表明已获得组织常驻记忆表型。抗原刺激的CD69阳性、CD103阳性、CD8 T细胞的细胞内干扰素γ和白介素2产生显著增加，较未刺激对照组显著增加。
该方案使CD8常驻记忆T细胞的体外研究成为可能，从而实现高效操作上皮细胞和T细胞，无需依赖动物模型。该方案中最重要的挑战是保持健康、可存活的T细胞和阴道上皮类器官，因为低存活率或感染会影响共培养的存活率和实验结果。我们专注于流式细胞术分析，但可以采集共培养样本进行染色、成像和测序。
安全介质启用下游ELISA功能。
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概述
本方案展示了一种利用类器官-T细胞共培养系统研究CD8驻留记忆T细胞分化的实验方法。该方法可在可控的体外环境中探究T细胞的免疫应答，对于理解女性生殖道中的免疫反应至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 感染生物学
- 细胞培养技术
背景
- CD8 T细胞在免疫应答中发挥关键作用。
- 组织驻留记忆T细胞对长期免疫至关重要。
- 现有研究这些细胞的方法存在局限性。
- 类器官模型提供了更接近生理条件的环境。
研究目的
- 建立一种可扩展的体外系统，用于研究 CD8 T 细胞分化。
- 评估感染对 T 细胞驻留特性及功能的影响。
- 评价组织驻留记忆 T 细胞标志物的获得情况。
使用的方法
- 从小鼠中分离CD8 T细胞。
- 将T细胞与感染的阴道上皮类器官共培养。
- 通过流式细胞术分析评估T细胞标志物。
- 随时间监测病毒复制和T细胞反应。
主要结果
- 类器官感染导致T细胞聚集。
- CD8 T细胞表现出记忆标志物表达增加。
- 刺激后的T细胞显著产生细胞因子。
- 该方法可用于在体外对T细胞行为进行详细研究。
结论
- 该方案可高效研究CD8驻留记忆T细胞。
- 它有助于深入了解T细胞在感染背景下的免疫应答。
- 该方法可能减少T细胞研究对动物模型的依赖。
常见问题
行业重要性概述
在生理相关的上皮类器官系统中模拟 CD8 T 细胞分化，填补了黏膜屏障组织中免疫靶点验证的关键空白。该体外共培养平台可对上皮细胞与T细胞相互作用的机制进行去风险化分析，从而提升早期免疫学发现和转化研究的可预测性。该方法可对组织驻留记忆T细胞（TRM）生物学进行可扩展的简化分析，直接为免疫治疗开发的项目决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可探究上皮细胞来源的信号对CD8 T细胞分化的驱动作用。
- 支持在可控且与疾病相关的系统中对免疫靶点进行功能验证。
- 通过分离影响组织驻留记忆T细胞（TRM）表型获得的变量，有助于实现机制层面的风险评估。
- 为保护性免疫机制的假设驱动型研究提供平台。
筛选与检测方法开发
- 为后续的表型和功能检测制备经过验证的类器官-T细胞共培养体系。
- 标准化定量流式细胞术和细胞因子检测方法，实现可重复的免疫谱型分析。
- 支持对影响T细胞驻留和功能的调节因子进行可扩展的筛选。
- 在生理相关背景下支持化合物评价的检测方法开发。
转化与临床前研究
- 将体外研究结果与疾病相关的黏膜组织生物学特性相结合，实现转化研究的连续性。
- 通过模拟感染驱动的T细胞应答，支持对免疫靶点进行风险评估后的推进。
- 通过定量分析组织驻留记忆T细胞（TRM）相关标志物和细胞因子，助力生物标志物的发现。
- 提供组织特异性免疫的机制性见解，促进临床前决策制定。
流程与工作流整合
这种共培养系统通过在可扩展的体外体系中进行假设验证、通路解析以及功能性免疫靶点确认，架起了早期发现与临床前研究之间的桥梁。
- 发现生物学：支持对上皮信号在组织驻留记忆T细胞（TRM）分化中作用的零假设检验。
- 筛选：提供可重复且定量的输出结果，用于免疫表型分析和细胞因子分析。
- 分析：提供适用于流式细胞术和ELISA的检测读数，用于不同条件间的比较分析。
- 转化研究：模拟屏障组织中由感染驱动的免疫应答，以实现临床前研究的对接。
- 企业级复用：提供可重复使用的平台，可适配多种上皮细胞和T细胞来源。
运营与企业影响
- 科学价值：提高免疫靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化共培养及分析流程，提升可重复性与可扩展性。
- 战略价值：通过实现免疫靶点的早期去风险化，改善决策判断并提高资金使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的免疫治疗候选物优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备类器官培养、T细胞分离及共培养技术方面的专业知识。
- 需要具备流式细胞术、成像和ELISA等定量分析所需的设备与基础设施。
- 需要跨团队对细胞活力和感染实验方案进行标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于其他上皮细胞和T细胞来源。
- 依赖于维持类器官和T细胞的高存活率，以获得可靠的结果。
