Name: 体外 利用上皮类器官-T细胞共培养系统进行驻留记忆CD8 T细胞分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 了解利用上皮类器官-T细胞共培养系统研究CD8驻留记忆T细胞分化的方法。该技术可在体外环境中高效分析T细胞应答，为女性生殖道免疫研究提供重要工具。

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本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目R01AI177704-01A1、R21AI183017-01、布朗大学种子基金（资助L.K.B.）以及F31AI186444（资助Y.L.）的支持。我们感谢美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS，NIH）的Dorian B. McGavern博士提供了表达黄色荧光蛋白（YFP）的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。我们感谢Sanghyun Lee博士及其实验室在Cytation-5成像方面的协助，以及布朗大学流式细胞术核心设施在基于流式的检测实验中提供的支持。

所有涉及动物的实验程序均经布朗大学机构动物护理和使用委员会审查并批准（方案编号 22-10-0001）。
1. 活化板的基本设置与准备
<ol>
	<li>实验开始前一天，准备一个未经处理的组织培养板，用于接种初始CD8 T细胞。用无菌dPBS配制激活抗体溶液，抗CD3ε（2C11）终浓度为1 µg/mL，B7-1 Fc终浓度为0.167 µg/mL。对于24孔板，每孔加入600 µL该溶液。4 °C孵育过夜，直至使用。</li>
	<li>通过向无菌dPBS中加入2%活性炭处理的胎牛血清（FBS）和1 mM EDTA，配制淋巴细胞富集缓冲液。4 °C保存，直至使用。</li>
	<li>通过向ddH2O中加入10 mM碳酸氢钾、155 mM氯化铵和0.1 mM EDTA，配制氯化铵-氯化钾红细胞裂解缓冲液（ACK RBC裂解液）。过滤除菌后，室温保存。</li>
	<li>通过向RPMI培养基中加入5%活性炭处理的FBS，配制适量收获培养基。4 °C保存，直至使用。每只待收获小鼠建议使用50 mL收获培养基。 
	注意：青霉素/链霉素和两性霉素B为可选添加物，但如果在组织分离过程中存在污染风险，添加终浓度为100单位/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和0.2 µg/mL两性霉素B可能有助于防止T细胞培养中的细菌和真菌污染。</li>
	<li>通过向RPMI培养基中加入10%活性炭处理的FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、1×非必需氨基酸和1 mM丙酮酸钠，配制T细胞培养基。对于24孔板，每孔使用2 mL T细胞培养基，整板共需50 mL。4 °C保存，直至使用。</li>
	<li>通过在灭菌袋中高压灭菌或浸泡于70%乙醇中，对解剖工具（0.4 mm显微解剖剪和0.8 mm精细弯头带齿显微镊）进行灭菌处理。</li>
</ol>
2. 成年小鼠次级淋巴器官的收获与解离
<ol>
	<li>将离心机快速预冷至 4 °C，并配备适合固定 15 mL 锥形管的转子适配器。</li>
	<li>准备冰块，用于在组织收获和孵育期间运输组织和淋巴细胞。</li>
	<li>为每只需要解剖的小鼠准备一个无菌的 15 mL 锥形管，管内加入至少 5 mL 收获培养基。</li>
	<li>根据机构规程，在超净工作台中对一只成年 CD8 T 细胞转基因小鼠（约 8 周龄）进行麻醉和安乐死。</li>
	<li>使用任意规格的针头将小鼠四肢固定在洁净的聚苯乙烯泡沫板上，并用 70% 乙醇喷洒躯干，以防止毛发阻碍切口并粘附工具。</li>
	<li>使用洁净的显微解剖剪和镊子，沿腹部垂直切开皮肤，并将皮肤与下方薄层结缔组织分离。用任意规格的针头将皮肤固定在聚苯乙烯泡沫板上，剪开残留的结缔组织，暴露体腔内的器官。</li>
	<li>小心定位并取出脾脏，用弯头镊子去除多余脂肪，将脾脏转移至含有收获培养基的 15 mL 锥形管中。将脾脏置于冰上，并尽可能多地分离淋巴结（例如髂淋巴结和腹股沟淋巴结），一并放入同一冰上的锥形管中。 
	注：髂淋巴结位于下腹部消化道下方、尾腔静脉两侧；腹股沟淋巴结位于躯干下腹部皮肤两侧浅表腹壁静脉分叉处附近。分离更多淋巴结可提高后续富集所得 CD8 T 细胞的产量；然而，仅分离脾脏通常已足以获得数百万个 CD8 T 细胞。</li>
	<li>将脾脏和淋巴结转移至刻痕的 60 mm 培养皿中，使用 3 mL 注射器活塞的平端通过研磨方式机械解离脾脏和淋巴结组织，直至无大块组织残留。</li>
	<li>将细胞悬液通过无菌 70 µm 细胞滤网过滤至新的无菌 15 mL 锥形管中。用 5 mL 收获培养基冲洗 60 mm 培养皿，确保所有解离细胞完全转移，并将冲洗液同样过滤至该 15 mL 锥形管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 584 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，将离心管底部快速有力地在离心管架网格上磕碰数次，以松动沉淀。</li>
	<li>加入 2 mL ACK 红细胞裂解缓冲液重悬松动的沉淀，涡旋混匀后室温孵育 2 分钟，以裂解红细胞。</li>
	<li>孵育 2 分钟后，加入 2 mL 收获培养基中和裂解反应。用 5 mL 移液管吸取悬液，再次通过无菌 70 µm 滤膜过滤回同一 15 mL 锥形管中。 
	注：此过滤步骤至关重要，可确保彻底去除所有细胞团块。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 584 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 950 µL 淋巴细胞富集缓冲液中。</li>
</ol>
3. CD8 T细胞富集与激活
<ol>
	<li>使用 commercially available isolation kit 从淋巴细胞中富集初始 CD8 T 细胞。遵循生产商提供的操作说明。</li>
	<li>CD8 T 细胞富集完成后，将富集后的细胞悬液转移至新的无菌 15 mL 圆底离心管中，并用收获培养基补足体积至 10 mL。</li>
	<li>使用血细胞计数板进行细胞计数。 
	注意：从小鼠成年个体中可分离获得至少 500 万至 1000 万个初始 CD8 T 细胞，纯度可达 &gt;95%。</li>
	<li>将至少 50 万个细胞接种于 24 孔板的每个孔中，每孔加入 2 mL T 细胞培养基。接种前充分混匀 T 细胞，以确保形成均一的单细胞悬液。在 T 细胞培养基中添加终浓度为 100 单位/mL 的 IL-2、2.5 ng/mL 的 IL-12 和 55 µM 的 β-巯基乙醇。</li>
	<li>从 4 °C 取出预先包被抗体的组织培养板，小心吸除包被液，避免接触孔底。</li>
	<li>立即接种 T 细胞，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 2 天。</li>
</ol>
4. 去除活化信号并使活化的CD8 T细胞静息
<ol>
	<li>在光学显微镜下观察活化的孔板。激活2天后，观察各孔中是否存在小的T细胞簇。较大的细胞簇表明活化程度更高。若无或仅有少量细胞簇，可将培养板在37 °C、5% CO2条件下继续孵育1天后再进行静息处理。</li>
	<li>准备冰块，用于在孵育期间及不使用时储存T细胞悬液。</li>
	<li>使用P1000移液器，在每个孔的四个角反复吹打数次，重悬T细胞。待T细胞完全脱离孔底后，将孔内液体转移至无菌的50 mL锥形管中并进行细胞计数。 
	注意：用1 mL dPBS洗涤每个孔是可选步骤，但将dPBS洗涤液与T细胞悬液合并可能提高T细胞回收率。</li>
	<li>将T细胞以与步骤3.4相同的浓度重新接种，即每孔2 mL，细胞密度为250,000个细胞/mL。准备适量的T细胞培养基，其中添加100单位/mL IL-2和55 µM β-巯基乙醇。</li>
	<li>将细胞悬液在4 °C下以584 ×g离心5分钟，弃上清液，将沉淀重悬于前一步骤中配制的适量T细胞培养基中，用于后续接种的孔数。充分混匀，确保形成均一的单细胞悬液。</li>
	<li>在新的未经处理且未包被抗体的组织培养板中，每孔加入2 mL T细胞悬液（每孔500,000个细胞）。在37 °C、5% CO2条件下孵育2天。</li>
</ol>
5. 用病毒感染已形成的鼠阴道上皮类器官
注意：我们已使用单纯疱疹病毒2型（Herpes Simplex virus-2, HSV-2）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）对类器官进行病毒感染。这两种病毒均属于生物安全二级（BSL-2）病原体。所有涉及感染性病原体的操作均须在经认证的BSL-2生物安全柜内进行。使用前后均需用70%乙醇清洁工作区域，并根据机构的生物安全指南丢弃所有材料。在本方案中，我们如前所述10，从小鼠C57BL/6雌鼠阴道上皮组织中分离阴道上皮细胞，建立阴道上皮类器官（VEOs）。
<ol>
	<li>在感染前7-10天，将VEO以每孔10,000个细胞的密度接种于24孔板中，每孔加入20 µL基底膜提取物（BME）。</li>
	<li>共培养前一天，预留一孔VEO用于胰酶消化和计数，以获得准确的感染复数（MOI）。将0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C水浴中预热5分钟。 
	注意：0.25%胰蛋白酶-EDTA不会在感染过程中使用，仅用于MOI计算时解离VEO。此步骤中可选择使用含2.5% BSA的dPBS对塑料器皿（如移液枪头、离心管）进行包被，以减少类器官和细胞损失，从而提高计数准确性。</li>
	<li>吸除指定孔中的细胞培养基，并用dPBS洗涤。</li>
	<li>向孔中加入600 µL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，使用BSA包被的P1000移液枪充分重悬，以机械方式破坏BME。将孔内液体转移至经BSA包被的无菌15 mL离心管中。</li>
	<li>在37 °C水浴中孵育5分钟。5分钟后，加入10 mL含10% FBS的RPMI培养基以终止胰酶消化。</li>
	<li>在4 °C条件下以500 ×g离心5分钟。弃去上清液，并使用BSA包被的移液枪头在100–300 µL T细胞-类器官培养基或普通DMEM/F12培养基中重悬沉淀。 
	注意：重悬体积取决于沉淀大小。若沉淀几乎不可见，则使用较小体积进行重悬。</li>
	<li>使用血细胞计数板进行细胞计数。根据已知病毒滴度及每孔VEO的细胞密度，按照以下公式计算实现0.1 MOI所需的病毒量： 
	<img alt="总病毒体积计算；病毒滴定公式；方程；实验病毒学研究" src="/files/ftp_upload/69120/69120eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>吸除待感染VEO孔中的细胞培养基，并用500 µL预热（37 °C）的dPBS洗涤。将孔在37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>5分钟后，弃去dPBS，每孔加入含足量病毒颗粒的500 µL类器官培养基，使MOI达到0.1。在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时，每隔20–30分钟轻轻手动晃动培养板。</li>
	<li>1小时孵育结束后，吸除含病毒的类器官培养基，用500 µL预热（37 °C）的dPBS洗涤。吸除dPBS后，更换为新鲜类器官培养基。</li>
</ol>
6. 将CD8 T细胞与病毒感染的预制小鼠阴道上皮类器官共培养
<ol>
	<li>共培养前（理想情况下提前 4–24 小时），将 BME 从 -80 °C 转移至 4 °C 解冻。根据共培养实验设计预估所需解冻的 BME 量：计划每孔 96 孔板接种 8 μL BME，每孔 24 孔板接种 20 μL BME。 
	注意：BME 黏稠，4 °C 下更长的解冻时间可降低其黏度，提高操作便利性。</li>
	<li>在 dPBS 中配制 2.5% BSA 并过滤除菌。使用该 BSA 溶液涂覆所有与 VEOs 接触的塑料表面（即移液枪头、锥形管）。 
	注意：该涂层可防止 VEOs 黏附塑料表面，避免操作过程中损失。</li>
	<li>在光学显微镜下检查 VEOs 的大小和整体健康状况。确认 VEOs 培养时间为培养后 7–10 天，平均直径约为 100 微米。健康的 VEOs 应极少或无单个细胞，形态均匀且呈圆形。 
	注意：若在 24 孔板中培养并重新接种至 24 孔板进行共培养，则以 1:1 比例传代 VEOs（即一孔 VEOs 重新接种一孔 T 细胞-类器官共培养孔）。若从 24 孔板传代至 96 孔板，则以 1:2 比例传代 VEOs（即一孔 VEOs 重新接种两孔 T 细胞-类器官共培养孔）。</li>
	<li>将用于共培养的适量无菌 96 孔或 24 孔组织培养板放入 37 °C 培养箱中预热。 
	注意：预热的培养板可加快 BME 的黏附和凝固。</li>
	<li>在 DMEM/F12 中配制 T 细胞-类器官培养基，添加 2% B-27 补充剂、2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、1× 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠和 0.2 µg/mL 两性霉素 B。配制后储存于 4 °C，待用。</li>
	<li>吸除 VEOs 孔中的细胞培养基，并用 500 µL 冷（2–8 °C）无菌 dPBS 洗涤每孔。</li>
	<li>吸除 dPBS，加入 200–500 µL 冷（2–8 °C）类器官收获液（体积至少为类器官 BME 液滴的 10 倍）。使用经 BSA 涂覆的 P200 移液枪头反复吹打，机械破坏 BME。</li>
	<li>将培养板置于 4 °C 轨道摇床上，以轻柔振荡（约 100 rpm）孵育 20 分钟。若无冷藏轨道摇床，可将培养板置于冰上，每 5 分钟手动摇动一次。若 20 分钟后 BME 仍未解聚，可根据需要延长孵育时间。</li>
	<li>使用经 BSA 涂覆的移液枪头，将孔内液体转移至置于冰上的经 BSA 涂覆的无菌 15 mL 或 50 mL 锥形管中。在 4 °C 下以 500 ×g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 5–10 mL 冷（2–8 °C）dPBS 洗涤 VEOs（体积至少为所有类器官 BME 液滴总体积的 10 倍）。在 4 °C 下以 500 ×g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去 dPBS，使用经 BSA 涂覆的 P1000 移液枪头将沉淀重悬于 1 mL T 细胞-类器官培养基中。将 VEOs 悬液置于冰上，直至 T 细胞准备就绪进行共培养。</li>
	<li>开始收集用于共培养的 T 细胞。在光学显微镜下检查静息 T 细胞的大小和整体健康状况。在无激活信号的情况下，T 细胞增殖减缓，但仍应形成部分细胞簇。确认无细胞碎片或碎片残留，T 细胞呈增大形态。使用 P1000 移液枪头在孔的每个角落反复吹打数次以重悬 T 细胞，并计数活 CD8 T 细胞总数。 
	注意：每孔 96 孔板的共培养体系中接种 100,000 个 T 细胞，置于 8 µL BME 中；每孔 24 孔板的共培养体系中接种 200,000 个 T 细胞，置于 20 µL BME 中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 584 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 10 mL T 细胞-类器官培养基中。根据接种孔数，将适量 T 细胞转移至含有 VEOs 的锥形管中，实现 T 细胞与 VEOs 的混合。</li>
	<li>在 4 °C 下以 584 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，将 VEOs 和 T 细胞重悬于适量 BME 中。使用经 BSA 涂覆的移液枪头充分混匀，接种至预热的组织培养板中，每孔 24 孔板加 20 µL，每孔 96 孔板加 8 µL。 
	注意：接种过程中保持 BME 置于冰上或 4 °C 冷却块中。接种前将移液枪头在 4 °C 冰箱中放置 30 分钟，有助于防止 BME 过早凝固。</li>
	<li>将培养板倒置于 37 °C 培养箱中，静置 30 分钟，使 BME 完全黏附并凝固。</li>
	<li>在该孵育期间，向预先配制的 T 细胞-类器官培养基中添加 100 ng/mL 小鼠 EGF、55 µM β-巯基乙醇和 10 单位/mL 小鼠 IL-2，制备完全 T 细胞-类器官培养基。</li>
	<li>孵育结束后，小心向每孔 24 孔板加入 500 µL 完全 T 细胞-类器官培养基，或向每孔 96 孔板加入 250 µL 完全 T 细胞-类器官培养基。加液时沿孔壁缓慢加入，避免破坏 BME 液滴。每 2 天更换一次培养基，直至收获用于分析。</li>
</ol>
7. 收集共培养的CD8 T细胞用于流式细胞术分析
<ol>
	<li>共培养物培养至少达到第7天后，即可收获用于分析。如果T细胞在第7天的共培养中尚未表达组织驻留记忆T细胞（TRM）样标志物，可根据表型获取情况以及VEO和T细胞的存活率，在第7至14天之间优化收获时间。</li>
	<li>通过向dPBS中添加0.2% w/v牛血清白蛋白和0.1% w/v叠氮化钠，制备用于流式细胞术染色和分析的荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。 
	注意：叠氮化钠为急性毒性化学品。操作和处理所有废弃物时，请遵循机构建议，并符合机构生物安全规定。</li>
	<li>根据所需分析的标志物，用FACS缓冲液配制用于表面染色的荧光抗体混合液。每孔至少准备50 µL抗体混合液。</li>
	<li>用dPBS配制荧光活率染料。每孔至少准备50 µL活率染料。</li>
	<li>小心吸除每孔中的培养基，并用预冷（2–8 °C）的FACS缓冲液充分重悬细胞，上下吹打10–20次以机械破坏基底膜提取物（BME）。将每孔内容物转移至已标记的96孔圆底板中。</li>
	<li>在4 °C下以859 ×g离心2分钟。此后所有离心步骤均应降低减速坡度，以防止沉淀重新悬浮导致样本损失。</li>
	<li>通过翻转平板并用力向下甩动一次的方式去除上清液。用50 µL抗体混合液重悬沉淀。使用多通道移液器上下吹打至少5次，确保细胞沉淀充分重悬。</li>
	<li>根据需要在4 °C或室温下避光孵育30分钟。孵育结束后，使用多通道移液器向每孔加入150 µL dPBS，并在4 °C下以859 ×g离心2分钟。</li>
	<li>将平板倒置，连续向下轻弹一次以倾去上清液。用50 µL活率染料重悬沉淀。使用多通道移液器上下吹打至少5次，确保细胞沉淀充分重悬。</li>
	<li>室温避光孵育15分钟。孵育结束后，使用多通道移液器向每孔加入150 µL FACS缓冲液，并在4 °C下以859 ×g离心2分钟。</li>
	<li>同前倾去上清液，若样本需立即上机检测，则用150 µL FACS缓冲液重悬；若需固定，则用150 µL 0.5%多聚甲醛重悬，并置于4 °C保存。使用多通道移液器上下吹打至少5次，确保细胞沉淀充分重悬。对固定后的样本进行过滤，以防堵塞仪器，并在12–36小时内上机检测，以避免荧光信号丢失。 
	注意：多聚甲醛被视为有害化学品。操作和处置时应遵循机构的生物安全规定。</li>
</ol>

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<li>Lin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+gastrointestinal+assembloids+to+study+the+interplay+between+epithelial+crypts+and+their+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche.</a> Nat Commun. 14, 3025(2023).</li>
<li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 364 (6444), 960-965 (2019).</li>
<li>Quintard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+integrating+functional+vascularized+organoids-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip.</a> Nat Commun. 15, 1452(2024).</li>
<li>Vincenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+CD8%2B+T+cells+cooperate+with+CD4%2B+T+cells+to+drive+compartmentalized+immunopathology+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory CD8+ T cells cooperate with CD4+ T cells to drive compartmentalized immunopathology in the CNS.</a> Sci Transl Med. 14 (640), eabl6058(2022).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

CD8 TRMs 依赖局部微环境信号进行分化和维持。这些信号赋予 CD8 TRMs 组织特异性的程序化特征，使其能够适应所处环境并按需执行免疫监视功能。然而，TRMs 未能存活下来 体外 一旦从组织中提取出来，这限制了对其的详细分析12,13在此方案中，我们提供了一种将CD8 T细胞与上皮细胞共培养的方法，使其发育为具有类似组织驻留记忆性T细胞（TRM）表型特征的细胞 体内 组织驻留记忆T细胞（TRMs）。该方法可用于长期研究TRMs，且易于调整以适用于其他组织、病毒及遗传修饰。
本方案最关键的要素与细胞健康有关。T细胞在共培养之前必须处于增殖状态且存活良好。若T细胞未得到充分激活，并缺乏持续的IL-2供给，则除非提供其他生存信号（包括IL-7和IL-15），否则仍无法长期存活；尽管我们已发现VEO本身可在一定程度上支持T细胞的存活10。若在共培养时T细胞的存活率未达到80%以上，则...

CD8 组织驻留记忆性 T 细胞（TRMs）是一类独特的记忆性 CD8 T 细胞亚群，可长期驻留于外周组织中，通常不进入血液循环或淋巴组织。这些 TRM 细胞战略性地定位于屏障器官，包括皮肤、肺、肠道和生殖道，在这些部位它们作为哨兵细胞抵御病原体和早期肿瘤1,2。当检测到病原体时，CD8 TRM 细胞迅速释放细胞毒性颗粒，直接清除被感染的细胞，同时分泌促炎性细胞因子，以激活周围组织细胞并募集循环中的免疫效应细胞，从而控制病原体的扩散3,4。CD8 TRM 细胞在抗病原体免疫以及癌症免疫治疗中的有效性已得到证实5,6。因此，在屏障黏膜组织中建立数量充足且功能健全的 CD8 TRM 细胞群，是当前疫苗开发和免疫治疗策略的关键目标。
外周器官中 CD8 TRM 的形成与维持在很大程度上依赖于局部组织特异性的程序化调控。这些局部微环境信号包括独特的组织来源的细胞因子和代谢因子，以及多种细胞间相互作用，共同确立了组织特异性的 TRM 表型7,8,9。此类组织程序化调控使 TRM 能够适应不同组织环境对其免疫监视功能的特异性需求。然而，由于缺乏能够真实模拟这些过程的可靠模型系统，目前对这些相互作用本质的理解仍不完整。尽管小型动物模型提供了重要信息，但其体内往往存在高度交织且复杂的相互作用网络，限制了高通量快速研究的开展。
此处，我们描述了一种 体外 一种可替代小鼠模型的方法，可用于研究上皮细胞来源信号在CD8 TRM分化过程中分子机制的细节。通过将预先形成的阴道上皮类器官（VEOs）与活化的CD8 T细胞共培养，我们成功诱导了CD8 TRM的生成 体外对CD8 T细胞活化及共培养过程的详细描述将有助于在多种组织中推广应用该技术，从而更深入地理解前沿组织中细胞相互作用对CD8 T细胞记忆形成的影响。

<table><tbody><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>24孔未处理聚苯乙烯组织培养板</td><td>VWR International</td><td>10861-558</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 无菌注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-457</td><td></td></tr><tr><td>5 mL&amp;nbsp;Snap Cap&amp;nbsp;无菌圆底聚苯乙烯试管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 无菌细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>96孔未处理聚苯乙烯圆底微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>96孔未处理聚苯乙烯细胞培养板</td><td>VWR International</td><td>10861-562</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白/第五组分</td><td>赛默飞世尔科技化学品</td><td>J6465518</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 培养基</td><td>Cytiva</td><td>SH30271.FS</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲盐溶液 1x</td><td>康宁</td><td>21031CV</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（0.5 M 溶液/pH 8.0）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>超精细显微解剖剪</td><td>Roboz 外科器械公司</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - 活性炭/葡聚糖处理</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>S11650</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10 软件</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FlowJo (RRID:SCR_008520)</td><td></td></tr><tr><td>格拉夫镊子</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 溶液</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>磁铁 5 mL</td><td>Biolegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CD8 Na&amp;iuml;ve T细胞分离试剂盒</td><td>Biolegend</td><td>480044</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 EGF 重组蛋白</td><td>Gibco</td><td>315091MG</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液（100倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>MP Biomedicals</td><td>0215255780</td><td></td></tr><tr><td>纯化的抗小鼠 CD3 抗体&amp;epsilon; 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100360</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 B7.1 (CD80)-Fc 融合蛋白（无载体）</td><td>Biolegend</td><td>555406</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-12 (p70)（无载体）</td><td>Biolegend</td><td>577004</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-2（无载体）</td><td>Biolegend</td><td>575406</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型基底膜提取物</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BME001-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基</td><td>Cytiva</td><td>SH30027.LS</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>含0.25% 胰蛋白酶的蛋白酶（猪源胰蛋白酶）</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td></td></tr><tr><td>活力染料（红色 780）</td><td>Cytek 生物科学</td><td>13-0865-T100</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 使用上皮类器官-t细胞共培养系统诱导组织驻留记忆性cd8 t细胞分化

In Vitro Resident Memory CD8 T Cell Differentiation Using Epithelial Organoid-T Cell Co-culture System

屏障黏膜组织在定居T细胞的分化与功能中发挥重要作用。在这些组织的多种细胞群体中，上皮细胞是驱动T细胞分化的关键因素。然而，由于缺乏特异性工具以及现有模型系统的复杂性，我们对塑造黏膜环境中T细胞生物学特性的上皮来源信号仍知之甚少。本文介绍了一种小鼠阴道上皮类器官与CD8 T细胞共培养体系，用于模拟感染的上皮细胞与病毒特异性CD8 T细胞之间的动态相互作用。该方案可在生理相关的三维上皮微环境中实现对T细胞应答的表型和功能分析。利用该系统，我们证实了效应CD8 T细胞可分化为组织驻留记忆T细胞（TRM）。这一多功能的in vitro培养体系为深入研究上皮信号在CD8 T细胞分化中所起的分子机制提供了简化的研究平台，有助于阐明屏障器官中保护性免疫及免疫病理过程的调控机制。

CD8 T细胞感染类器官共培养的显微观察 
预先形成的鼠源VEO用LCMV感染，并与LCMV特异性的CD8 T细胞进行共培养。我们还使用HSV-2感染模型进行了类似的共培养实验，以验证本方案的通用性；但此处仅展示LCMV模型的显微图像数据，HSV-2模型的相关T细胞分化数据则在下文提供。LCMV表达黄色荧光蛋白（YFP），因此可通过常规落射荧光显微镜观察被感染的细胞。具体操作中，7日龄VEO在与CD8 T细胞共孵育前24小时接种LCMV-YFP（图1A）。另取LCMV特异性的转基因P14 CD8 T细胞，按照前述激活与静息方案进行活化处理。在共培养当天，将感染后的类器官从BME基质中释放出来，并与前述适当数量的活化CD8 T细胞混合。该混合群体被重悬于新的BME基质中，并接种至96孔板用于成像分析（图1B）。共培养后4小时即可观察到类器官中存在大量病毒复制，表现为绿色荧光信号。然而，CD8 T细胞在感染类器官周围的聚集现象则在较晚时间点才变得明显。我们还注意到，在后期时间点类器官...

研究CD8 T细胞的分化与功能 体外，可从 小鼠 中分离 CD8 T 细胞，并与已形成的感染性 小鼠 阴道上皮类器官进行长期共培养。本文描述了该过程，并评估共培养过程中组织驻留记忆 T 细胞标志物的获得情况。

体外 使用上皮类器官-T细胞共培养系统诱导组织驻留记忆性CD8 T细胞分化

屏障黏膜组织在定居T细胞的分化与功能中发挥重要作用。在这些组织的多种细胞群体中……

本研究探讨女性生殖道中的CD8驻留记忆T细胞，分析感染和疾病如何影响其驻留特性、功能、维持机制及治疗潜力。现有方法在维持驻留记忆T细胞的存活和表型稳定性方面存在局限。本实验方案通过类器官与T细胞共培养诱导组织驻留状态，实现驻留记忆T细胞的可扩展性体外研究。首先，在24孔板的每个孔中加入20微升基底膜提取物，接种密度为每孔10,000个细胞的阴道上皮类器官（VEOs）。将培养板放入培养箱中，在37摄氏度条件下培养7至10天。共培养前一天，吸除指定孔中的细胞培养基，并用DPBS清洗各孔。吸除 DPBS，然后加入 600 µL 预热的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液至孔中。使用经 BSA 包被的 P1000 移液器充分重悬，以机械方式破坏基底膜提取物，并将孔内液体转移至经 BSA 包被的无菌 15 mL 圆锥形离心管中。随后将该离心管置于 37 °C 水浴中。 五分钟后，加入10毫升含10% FBS的RPMI培养基以终止消化反应。随后将离心管放入离心机，在4°C条件下以500 × g离心五分钟，并弃去上清液。使用经BSA包被的移液枪头，将沉淀重悬于100至300微升T细胞类器官培养基或普通的DMEM/F12培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。根据总细胞数和已知的病毒滴度，计算实现感染复数为0.1所需的病毒体积。吸除选定用于感染的VEO孔中的细胞培养基。用500微升预热的DPBS洗涤每个孔，将培养板置于37摄氏度培养箱中孵育5分钟。5分钟后，弃去DPBS。加入500微升类器官培养基，其中含有足量病毒颗粒，以达到0.1的感染复数。将培养板放入含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育1小时，每20至30分钟轻轻手动摇晃培养板。将铺板所需量的基底膜提取物从-80摄氏度保存条件下转移至4摄氏度，使其解冻8小时。在光学显微镜下检查VEO，评估其大小和整体健康状况。确认VEO的直径约为100微米，形态均匀呈圆形，且单细胞数量极少。从VEO孔中吸除细胞培养基，每孔用500微升维持在2至8摄氏度的冷无菌DPBS洗涤一次。去除DPBS后，向每孔加入200至500微升冷类器官收获溶液，确保其体积至少为基底膜提取物液滴体积的10倍。然后使用经BSA包被的P200移液枪，机械性地破坏基底膜提取物。现在将培养板置于摇床中，于4摄氏度、约100转/分钟的条件下振荡20分钟。孵育结束后，用经BSA包被的移液枪头混匀并转移每孔中的内容物至经BSA包被的无菌15毫升锥形管中。将离心管放入离心机，在4°C条件下以500 ×g离心5分钟，然后弃去上清液。用5至10毫升冷的DPBS洗涤VEO沉淀，再在4°C条件下以500 ×g离心5分钟。吸去 DPBS，然后使用 P1000 移液器吸头将沉淀重悬于 1 毫升 T 细胞类器官培养基中，将 VEO 悬液置于冰上，直至 T 细胞准备好进行共培养。收集 T 细胞时，在光学显微镜下检查静息状态的 T 细胞，评估其大小和整体状态。确认 T 细胞出现一定程度的聚集成簇、形态增大，且无可见的细胞碎片或残骸。使用 P1000 移液器，通过在孔板的每个角落反复吹打数次，重悬 T 细胞。收集至离心管中，并计数活 CD8 T 细胞的总数。接着，将 T 细胞悬液放入离心机，在 4°C 条件下以 584 G 离心 5 分钟。弃去上清液，将T细胞沉淀重悬于10毫升T细胞类器官培养基中。然后将适量的T细胞转移至含有先前制备的VEO的锥形管中以混合细胞。将混合后的VEO与T细胞悬液放入离心机，在4摄氏度下以584 ×g离心5分钟。弃去上清液后，将VEO和T细胞重悬于适当体积的基底膜提取物中。然后使用另一枪头，将悬液接种至预热的组织培养板中，每孔加入20微升，用于24孔板。随后将组织培养板倒置，放入37摄氏度的培养箱中。 静置30分钟，以确保基底膜提取物完全黏附并凝固。孵育结束后，小心地向每孔加入添加了补充成分的完全T细胞类器官培养基。对于24孔板，每孔加入500微升；对于96孔板，每孔加入250微升，加样时应沿孔壁缓慢加入，避免扰动基底膜提取物液滴。每两天更换一次培养基，直至收获样本进行流式细胞术分析。感染了表达黄色荧光蛋白的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的7日龄小鼠VEO，在共培养后4小时即可观察到强烈的病毒复制，表现为类器官内的荧光信号。在共培养的后期时间点，CD8 T细胞在感染类器官周围聚集的现象变得显著。CD8 T细胞的进行性聚集与感染类器官在后期时间点黄色荧光蛋白信号的明显减弱相关。与感染的VEO共培养的CD8 T细胞随时间推移表现出CD69和CD103表达升高，提示获得了组织驻留记忆表型。与未刺激对照组相比，经抗原刺激的CD69阳性、CD103阳性CD8 T细胞内干扰素γ和白细胞介素2的产生显著增加。本方案可实现对CD8驻留记忆T细胞的体外研究，能够在不依赖动物模型的情况下高效操控上皮细胞和T细胞。该方案中最重要的挑战是维持T细胞和阴道上皮类器官的健康与活性，因为细胞活力低下或发生感染将影响共培养的存活率及实验结果。我们重点采用了流式细胞术分析，但共培养样本也可用于染色、成像和测序。安全的培养基可用于后续的ELISA实验。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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