Name: 利用质谱法对石板的空间分子成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解利用质谱成像技术对肝脏组织中的糖原和N-连接糖链进行空间分子成像的方法。该方案通过双酶喷雾和MALDI-MSI技术实现高灵敏度检测，为糖生物学研究提供可靠的空间分布数据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Vander Kooi、Sun和Gentry实验室成员富有成效的讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）生物样本获取项目资助 &amp;#38; 肯塔基大学马基癌症中心转化病理学共享资源中心，P30CA177558（资助D.B.A.），R01AG066653、R01CA266004、R01AG078702、R01CA288696、RM1NS133593（资助R.C.S.），R35NS116824（资助M.S.G.），R01DC019054（资助C.W.V.K.），以及佛罗里达大学医学院。

<ol><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+Localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).</li>
<li>Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%3A+A+review+of+emerging+advancements+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights.</a> Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+MALDI-TOF+mass+spectrometry+is+an+accurate+and+rapid+method+to+analyze+different+modes+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation.</a> J Vis Exp. 82, e50926(2013).</li>
<li>Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+human+brain+organoids+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry.</a> J Vis Exp. 211, e66997(2024).</li>
<li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+glycogen+serves+as+a+critical+glucosamine+cache+required+for+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation.</a> Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).</li>
<li>Aichler, M., Walch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldi+imaging+mass+spectrometry%3A+Current+frontiers+and+perspectives+in+pathology+research+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice.</a> Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).</li>
<li>Conroy, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensionality+reduction+clustering+of+complex+carbohydrates+to+study+lung+cancer+metabolic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity.</a> Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li>Powers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+imaging+mass+spectrometry+workflow+for+spatial+profiling+analysis+of+N-linked+glycan+expression+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues.</a> Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).</li>
<li>Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+imaging+of+N-glycans+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry+of+fresh+or+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).</li>
<li>Stanback, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+n-glycan+and+lipid+analysis+from+tissues+using+MALDI-MS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).</li>
<li>Hawkinson, T. R., Sun, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging+of+glycogen+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ.</a> Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).</li>
<li>Young, L. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mass+spectrometry+imaging+reveals+heterogeneous+glycogen+stores+in+human+normal+and+cancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues.</a> EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).</li>
<li>Conroy, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+metabolomics+reveals+glycogen+as+an+actionable+target+for+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis.</a> Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).</li>
<li>Clarke, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+drives+tumor+initiation+and+progression+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma.</a> Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).</li>
<li>Wallace, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+N-glycome+tissue+atlas+of+15+human+normal+and+cancer+tissue+types+determined+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Sci Rep. 14 (1), 489(2024).</li>
<li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> J Vis Exp. 166, e62008(2020).</li>
<li>Mcdowell, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+and+lectin+analysis+of+N-linked+glycans+in+carbohydrate+antigen-defined+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).</li>
<li>Palmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDR-controlled+metabolite+annotation+for+high-resolution+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry.</a> Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).</li>
<li>Colpaert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+glycogen+storage+diseases+and+emerging+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics.</a> Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).</li>
<li>Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+mass+spectrometry+at+the+single+cell%3A+Recent+innovations+in+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).</li>
<li>Chan, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+mass+spectrometry+imaging+enables+sub-micrometer+spatial+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics.</a> Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).</li>
<li>Lim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldi+Hiplex-IC%3A+Multiomic+and+multimodal+imaging+of+targeted+intact+proteins+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues.</a> Front Chem. 11, 1182404(2023).</li>
<li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).</li>
<li>Rappez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spacem+reveals+metabolic+states+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spacem reveals metabolic states of single cells.</a> Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).</li>
<li>Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldi+MSI+protocol+for+spatial+bottom-up+proteomics+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution.</a> J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).</li>
<li>Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomic+MALDI-MSI+analysis+of+lipids+and+N-glycans+through+affinity+array+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture.</a> Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).</li>
<li>Clarke, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+the+brain+metabolome%2C+lipidome%2C+and+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome.</a> Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).</li>
<li>Juras, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+microwave+fixation+provides+an+instantaneous+snapshot+of+the+brain+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome.</a> Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).</li>
<li>Cantrell, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+high-power%2C+brain-focused+microwave+fixation+to+define+rodent+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism.</a> STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AI-driven+framework+to+map+the+brain+metabolome+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions.</a> Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).</li>
</ol>

R.C.S.、M.S.G. 和 C.W.V.K. 是佛罗里达大学先进空间生物分子研究中心（Center for Advanced Spatial Biomolecule Research, CASBR）的联合主任，同时也是 Sugar3 LLC 的联合创始人。R.C.S. 曾从 Maze Therapeutics 获得研究资助和/或咨询费。M.S.G. 曾从 Maze Therapeutics、Valerion Therapeutics、Ionis Pharmaceuticals、PTC Therapeutics 和 Aro Biotherapeutics 获得研究资助、研究化合物和/或咨询费。M.S.G. 还担任切尔西希望基金会（Chelsea's Hope）、葡萄糖转运蛋白1缺乏综合征基金会（Glut1-Deficiency Syndrome Foundation）以及成人聚糖原样小体疾病基金会（Adult Polyglucosan Body Disease Foundation）的科学顾问委员会成员。

MALDI-MSI 是糖组空间生物学研究中一种新兴的工具。重要的是，尽管本实验方案侧重于使用特定硬件进行数据采集，但它可轻松适配于多个厂商的 MALDI-MSI 平台13。在方法 4 之前，样品处理步骤完全相同，尽管某些厂商可能需要使用专用载玻片。通过采用针对特定 MALDI-MSI 平台的参数进行数据采集的调整，可实现本方案的快速适配。数据处理可使用厂商专用软件（详见步骤 5），或者 alternatively，也可采用适用于严格且可重复的 MALDI-MSI 数据处理的平台19。
基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）是一种特别有用的工具，可用于理解生物学，因为不同的器官、组织和细胞具有不同的糖组分布模式。肝脏非常适合进行糖组分析，因其含有高水平的糖原以及多种N-连接聚糖13。其他器官则具有更高水平和更多样性的N-连接聚糖，但糖原含量较低13。重要的是，糖组会因生物体的代谢状态和疾病状态不同而在不同器官中发生变化，因此糖组提供了丰富的生物学信息来源5,14,15,20。随着针对MALDI-MSI分析的独特碳水化合物活性酶的持续发展，有望将糖组分析扩展至糖组中其他正交的生物分子。
尽管MALDI-MSI具有诸多优势，但与空间生物学中使用的其他工具相比，其目前在分辨率上仍存在局限性。本方案采用50 µm分辨率进行数据采集。虽然该分辨率非常适合生理学分析，但单细胞分辨率的数据将显著推动该领域的发展21。特别是，在采用酶喷雾并随后在高湿条件下孵育的方法中，分子脱定位可能成为提高分辨率的重要障碍。近年来，在样品处理硬件、样品操作方法、数据采集设备、选择性标记技术以及数据处理方面的进展，正推动MALDI-MSI数据采集向细胞级分辨率逼近22,23。然而，在分辨率与信噪比之间存在权衡，且当前MALDI样品制备方法本身存在固有限制，这些因素均需加以考虑。已有极少数特定应用通过样品处理技术24和新型算法的创新，实现了单细胞分辨率的MALDI-MSI，表明针对这些问题的通用解决方案已近在咫尺25,26,27。
数据采集完成后，可对载玻片进行染色 通过 H&amp;#38;E 用于组织学注释。然而，MALDI-MSI 数据采集过程常伴随细胞和组织损伤，因此该策略限制了细胞注释的完整性。另一种方法是使用连续组织切片，分别用于 H&amp;#38;E。该策略可提供高质量数据，但需要对离散的样品切片进行比对和整合。
值得注意的是，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织非常适合通过基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）进行糖组分析，仅需对样本制备方案进行少量修改13。然而，FFPE组织无法有效用于代谢组学及其他类似分析，因此对于多组学研究，建议采用此处详述的新鲜冷冻样本28。样本制备是任何质谱成像（MSI）流程中针对不稳定生物分子的关键环节，需要采用特殊的样本采集与处理方法17,29,30。
随着硬件和软件的显著进步，扩展基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）方法的普适性和广泛应用的技术正在迅速发展19。此外，近期结合机器学习与人工智能的前沿多组学28和多模态21方法，在处理这些高度复杂的數據集方面尤其具有前景31。

空间生物学领域正在迅速扩展，为了解生物体动态的空间生物分子复杂性提供了关键见解。目前正采用多种方法在生物学背景下研究不同的生物分子。尽管其中一些是高度专业化的技术，但质谱法（MS）已发展成为一种重要的通用技术，可用于在细胞、组织或生物体背景下定量多种生物分子。
基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）是用于多组学空间生物分子成像的一种新兴通用技术。该技术最初建立用于组织切片中蛋白质和多肽的可视化1。此后，其应用已扩展至多种不同的生物样本和分子类型2。该技术可应用于细胞样本3、类器官4、模式动物5以及患者样本6,7。某些分子类别可直接通过基于质谱成像的方法进行检测，包括多种代谢物和脂质；而其他更复杂的生物分子类型，如蛋白质和聚糖，则需要经过酶解或化学处理后才能适用于基于质谱成像的检测2,8。
基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）已应用于N-连接聚糖和糖原的空间分析，其工作流程需通过酶处理产生适合质谱成像检测的聚糖片段9,10,11,12,13,14,15。N-聚糖通过PNGase F酶从蛋白质的天冬酰胺残基上切割下来，糖原的葡萄糖链则通过异淀粉酶进行切割。MALDI糖原分析的关键优势在于，它能够提供生物样本中糖原分布的空间定位信息、相对定量结果以及葡萄糖链分支结构的信息。由于N-聚糖和糖原分析的工作流程均需对样本进行酶处理才能开展质谱成像分析，因此二者已被整合为一个统一的糖组分析工作流程（图1A）。该流程需要对生物样本进行精细制备和特定处理，以实现糖组的质谱分析，随后进行数据采集与处理。尽管该流程包含一系列专业化步骤，但能够生成丰富、高质量且高度可重复的空间糖组数据，并可适用于多种不同类型的样本16。此外，该工作流程具有模块化特点，样本处理步骤可由独立的研究实验室完成，之后将样本送至专门机构进行MALDI-MSI的数据采集与分析。

<table><tbody><tr><td>吸水垫</td><td>Denville Scientific</td><td>B1623</td><td></td></tr><tr><td>乙腈（ACN）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851-4X4L</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15078292</td><td></td></tr><tr><td>柠康酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>125318</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（15 mL）</td><td>Alkali Scientific</td><td>CW5600</td><td></td></tr><tr><td>考普林瓶</td><td>DWK Life Sciences</td><td>900570</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机样品夹头</td><td>Leica</td><td>14041926491</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Bel Art</td><td>F424004131</td><td></td></tr><tr><td>透析杯</td><td>Thermo Fisher</td><td>88400</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>22032601</td><td></td></tr><tr><td>食品蒸锅</td><td>Rival&amp;nbsp;</td><td>CKRVSTLM21&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>玻璃内衬（70 mm）</td><td>Gel Company</td><td>LGI50</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8876</td><td>标准品</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8125</td><td>标准品</td></tr><tr><td>高效液相色谱用水（HPLC水）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4X4L</td><td></td></tr><tr><td>HTX 喷雾仪</td><td>HTX Technologies</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>异淀粉酶</td><td>Megazyme</td><td>E-ISAMY</td><td></td></tr><tr><td>Knauer 泵</td><td>Knauer</td><td>P 4.1 S</td><td></td></tr><tr><td>低剖面刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63059-01</td><td></td></tr><tr><td>M1 封片剂</td><td>Epredia</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>质谱仪</td><td>Bruker Daltonics</td><td>timsTOF fleX</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Alkali Scientific</td><td>CN3016</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林（NBF）</td><td>Millipore sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>Airgas</td><td>NIUHP300</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SH30256.FS</td><td></td></tr><tr><td>PCR管</td><td>MedSupply Partners</td><td>62-1091-1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F PRIME-LY ULTRA&amp;nbsp;</td><td>Bulldog Bio</td><td>NZPULT10LY</td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab</td><td>Bruker Daltonics</td><td>1889000</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882007</td><td></td></tr><tr><td>载玻片&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscope Sciences</td><td>71873-02</td><td></td></tr><tr><td>载玻片邮寄盒</td><td>RPI products</td><td>212620A</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪（Bioruptor Pico）</td><td>Diagenode</td><td>B01080010</td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td>DR Instruments</td><td>S08098</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀</td><td>WPI</td><td>WPI-500240</td><td></td></tr><tr><td>无菌剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>注射器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Grainger</td><td>19G342</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15-901-R</td><td></td></tr><tr><td>细毛笔</td><td>Anezus</td><td>#00</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-1L</td><td></td></tr><tr><td>调谐混合液，ESI低浓度</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>称量舟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS120882</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>15254</td><td></td></tr></tbody></table>

利用质谱技术对糖组进行空间分子成像

Spatial Molecular Imaging of the Glycome Using Mass Spectrometry

组织内糖组的空间分布是生理功能分子基础的关键。复杂且动态变化的糖组对代谢、信号传导和黏附等基本细胞过程至关重要。空间生物学领域的创新为多种糖组类别的空间分子成像开辟了新途径。本文介绍了一种针对新鲜冷冻小鼠肝脏糖组进行空间生物分子成像的优化方案。该工作流程包括：（1）快速取材与冷冻，（2）在最佳厚度和位置下进行恒冷切片，（3）组织预处理及利用碳水化合物活性酶在组织上进行原位酶解，（4）基质喷涂及通过基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）获取数据，（5）数据处理与可视化，以将研究结果置于生物学背景下解读。采用该方法可获得N-连接聚糖和糖原的详细空间分布图谱，揭示关键的生理与细胞特征。这些数据有助于界定与肝脏功能及功能障碍相关的关键空间糖组异质性。该工作流程实现了小鼠肝脏高重复性、高灵敏度的空间糖组学分析。此外，该方法可轻松拓展至其他组织或物种，推动对健康与疾病状态下糖组生物学的空间机制研究。

对野生型小鼠肝脏进行精细处理，包括切割完整的横断面（图1A），从而通过基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）定义其糖组，检测到多种糖原衍生的寡糖和N-连接聚糖，覆盖广泛的质荷比范围（图1B）。糖原广泛分布于肝实质细胞中，而在门管区的血管和结缔组织中则缺乏，符合预期（图1C，D）。重要的是，MALDI-MSI数据不仅可测量糖原的空间分布，还可测定其链长分布，后者是正常代谢及疾病状态下糖原的关键特征（图1D）。此外，多种N-连接聚糖表现出不同的组织模式。其空间分布从在肝实质细胞中广泛存在（图1E），到呈现区域性聚集，与肝脏的窦状隙结构一致（图1F），再到特异性标记门管区结构成分（图1G–I）。
<img alt="质谱工作流程图、光谱数据和肝脏组织成像，显示聚糖分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69154/69154fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 1"> 
图 1：小鼠肝脏的 MALDI-MSI 糖组分析。（A）样品制备、数据采集和分析中关键方法的示意图。（B）由此方法获得的样品质谱图。红色箭头表示源自糖原的规则间隔的寡糖，其差异为一个葡萄糖单糖。蓝色箭头表示在质谱中广泛分布的 N-聚糖。在肝脏中，糖原峰通常更为显著，尤其是在较高的 m/z 值处。（C）肝脏中源自糖原的麦芽六糖（DP6）的空间分布。（D）肝脏中糖原链长度的分布。（E–G）肝脏中不同 N-连接聚糖种类的空间分布。（H）中心区域的苏木精和伊红（H&amp;E）染色，以及解剖学标注。（I）相应放大插图，显示额外的 N-连接聚糖（Hex5dHex1HexNAc5）在门管区结构中的空间定位。比例尺：500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69154/69154fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本方案详细阐述了利用质谱成像技术对糖原和N-连接聚糖进行严格且可重复测量的关键步骤。

组织内糖组的空间分布是生理功能分子基础的关键。复杂且动态变化的糖组……

我们正在利用激动人心的新型基于质谱的技术对生物样本中的生物分子进行空间生物学作图。当前的关键挑战包括源于样品制备的严谨性与可重复性，以及灵敏度和分辨率的局限性。首先，将一个或多个透析杯置于高效液相色谱（HPLC）用水中浸泡15分钟，以开始实验。使用500微升透析杯，在14.3毫升HPLC水（四摄氏度）中对200微升储备液异淀粉酶进行两小时透析，期间不搅拌。用移液器小心地将透析后的异淀粉酶从透析杯中取出，转移至1.5毫升微量离心管中。透析后，测定异淀粉酶溶液的总体积。根据每毫升 200 个单位的储备酶活性和最终体积，计算所需异淀粉酶三个单位的总体积。用移液器将含有三个单位异淀粉酶的等分试样加入薄壁 PCR 管中。在液氮中迅速冷冻试管，并于 -80 °C 保存。当组织处理完毕并准备就绪后，将一张浸有去离子水的纸巾置于金属架下方，以制备湿度孵育室。将孵育室放入37摄氏度的培养箱中进行平衡。然后向食物蒸锅的储水槽中加自来水至最高水位，并将计时器设定为60分钟以启动设备。将切片放置于切片盒中，组织面向内侧，以避免与盒壁接触，并确保有效的抗原修复。每个切片盒中加入新配制的衣康酸缓冲液。确认食品蒸锅正在产生蒸汽。将邮寄盒放入蒸锅中，孵育30分钟。然后将邮寄盒转移至去离子水浴中，持续5分钟。将每个邮寄盒中的半量衣康酸缓冲液替换为去离子水，并静置另外5分钟。除去所有溶剂，通过向每个载片盒中加入100%去离子水并随后移除来清洗载片。在每张载片背面，画一个圆圈和一个三角形以标记内标位置。在圆圈标记处加入一微升浓度为一毫克每毫升的辣根过氧化物酶，于三角形标记处加入一微升浓度为十毫克每毫升的兔肝糖原。将一管100微克冻干肽N-糖苷酶F和一管含三单位异淀粉酶的溶液解冻10分钟。将管子在约2000 G下离心5秒。向每管冻干的PNGase F中加入50微升去离子水。轻轻涡旋混匀后，将离心管在约2000 G条件下离心五秒钟。用移液器将所得50微升PNGase F溶液直接加入异淀粉酶管中，并加入HPLC级水使总体积达到1毫升。打开HTX M5喷雾器，并在连接的计算机上启动HTX M5软件。通过按下右前侧的停止按钮关闭Knauer泵，并使用后方面板上的开关启动外部注射泵。在HTX软件的“方法”选项卡下，选择适用于双酶喷雾的适当方法。进入“温度”选项卡，将喷嘴温度设置为45摄氏度。打开高纯氮气阀门，确保喷雾器压力设定为10磅每平方英寸。使用一支新的注射器和针头，吸取4毫升HPLC级水。去除气泡后，将2毫升水通过约6英寸长的喷雾管线注入废液杯中。将注射器连接至喷雾管路，启动系统，以每分钟95微升的流速运行注射泵，持续5分钟，使水流过注射器。在注射泵冲洗过程中，使用金属对准导板将制备好的载玻片固定在加热托盘的左下角。在“样品”选项卡下，设定喷雾区域的X和Y参数。五分钟后，暂停注射泵并断开注射器。将空气吸入注射器，然后推动空气通过喷雾管路，以清除残留的水分。随后，将配制好的双酶溶液装入新的注射器中，并牢固连接至注射泵。将装有双酶溶液的注射器连接至喷雾管路。当喷嘴温度达到45摄氏度时，在“循环”选项卡下点击“开始”。当提示开启Knauer泵时，点击“否”。随后启动注射泵以开始喷洒酶溶液。将一张空白载玻片置于喷嘴下方，以确认可见的酶沉积情况。当观察到酶喷雾分布均匀后，在软件上点击继续。接下来，将玻璃盖板放在喷雾器上，并监控喷雾的均匀性，确保载玻片表面润湿均匀。喷雾循环完成后，按压注射泵上的停止按钮。关闭氮气阀门，并在软件中点击“Valve Load Confirm”。将喷雾处理后的载玻片置于HTX湿化室中，在37摄氏度下孵育两小时，确保载玻片朝上放置。孵育完成后，将载玻片转移至干燥器中，干燥15分钟。利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术，在肝脏中广泛的一级电荷范围内检测到糖原衍生的寡糖和N-连接聚糖。糖原在肝细胞中广泛分布，而在门管区的血管和结缔组织中则未检测到。使用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）可同时测量糖原的空间分布及其链长分布。一种N-连接聚糖在肝细胞中广泛分布。另一种N-连接聚糖则呈现更明显的区域性分布模式，与肝窦结构相一致。一种独特且与门管区结构特异性相关的糖链。组织学染色证实了门管区的解剖结构，包括门静脉、胆管和结缔组织。我们利用空间分子成像技术揭示细胞生物学、生理学及疾病病理学的细胞、代谢和分子基础。这些发现将使得在多种生物来源和疾病状态下对糖组进行分子成像成为可能。未来的研究将能够检测不同类型的糖组，并将检测的灵敏度和分辨率提升至单细胞水平。

spatial-molecular-imaging-of-the-glycome-using-mass-spectrometry

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

利用质谱法对石板的空间分子成像

本文描述了一种快速了解细胞外基质中多糖结构的方法。该方法利用了糖基水解酶的特异性和质谱技术的高灵敏度，可分析极微量的样品。此技术可直接应用于组织本身。...

细胞外多糖的寡糖质谱分析（OLIMP）

本文介绍了一种特异且灵敏的方法，用于深入了解免疫器官和细胞中糖鞘脂抗原的表达谱。该方法利用离子阱质谱技术，通过逐步裂解糖鞘脂分子，并与化学合成的标准品进行比较，实现对分子结构的分析。...

糖鞘脂抗原的质谱分析

本文介绍了一种改进的自下而上糖组学技术，该技术通过将未分级生物流体中的糖链化学降解为其具有连接特异性的单糖组分，并利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行检测，从而分析糖链的总体组成谱型。该方法的潜在应用包括癌症及其他糖链相关疾病的早期诊断。...

聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

本文描述了一种用于制备心血管组织样本以进行质谱分析的方法，该方法能够实现：（1）分析细胞外基质（ECM）蛋白质组成；（2）鉴定糖基化位点；（3）对糖链形式进行组成表征。该方法经少量修改后，亦可应用于其他组织中细胞外基质的研究。...

细胞外基质的糖蛋白质组学：一种利用质谱进行完整糖肽分析的方法

开发了一种新的样品制备方法，用于实现细胞与组织的共培养，以通过成像质谱技术检测小分子交换。...

利用成像质谱技术捕捉组织与细胞间的小分子通讯

本方案详细介绍了糖组学指导的糖蛋白质组学方法，这是一种整合组学技术，可全面揭示复杂肿瘤微环境中异质性糖蛋白组的特征，有助于深入理解癌症的糖生物学。...

糖组学指导的糖蛋白质组学促进复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的全面分析

本文介绍了一种从黏蛋白中释放...

使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析全甲基化黏蛋白 O-糖链

建立了一种从小胶质细胞中制备纯化线粒体、分离线粒体蛋白以释放N-聚糖，并利用红外基质辅助激光解吸电喷雾电离联用高分辨准确质量分析仪质谱技术快速检测亚细胞线粒体聚糖的实验方案。...

小胶质细胞线粒体提取用于糖链分析

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

了解利用质谱成像技术对肝脏组织中的糖原和N-连接糖链进行空间分子成像的方法。该方案通过双酶喷雾和MALDI-MSI技术实现高灵敏度检测，为糖生物学研究提供可靠的空间分布数据。

利用质谱技术对糖组进行空间分子成像

探索更多视频