Name: 研究与自闭症相关的神经元兴奋性受损的动态钳位方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习动态钳位电生理技术，研究小鼠小脑浦肯野神经元中离子通道功能障碍与神经元放电缺陷之间的因果关系，并通过添加模拟钠电导恢复Tsc1缺失神经元的重复放电能力。

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我们感谢 Sutter Instrument 公司的 Telly Galiatsatos 和 Josh Stanford 在技术咨询方面提供的帮助。同时，我们感谢 Jan Dolzer 在启动 dPatch 动态钳制研究方面给予的支持。

作者声明不存在利益冲突。

小脑环路参与本体感觉和运动控制37,38，但也对社交互动和情绪处理等复杂行为至关重要39,40,41。小脑结构与功能的病理改变常与自闭症谱系障碍（ASD）相关42,43,44,45,46。小脑环路结构简单47，且其在ASD病理中的作用明确，因此成为研究ASD行为缺陷的分子与细胞驱动机制以及潜在治疗策略的理想脑区。动态钳制电生理技术为这些研究提供了重要工具，使研究者能够直接检验与ASD相关的离子通道特性或离子电导改变与小脑神经元放电之间的因果关系。尽管动态钳制方法特别适用于研究ASD相关的神经元兴奋性变化，但该技术也适用于探究影响可兴奋膜细胞的多种病理机制。此外，动态钳制仍是解析神经元和肌肉细胞调控并维持适当动作电位发放的复杂过程的优秀工具。
精确执行动态钳实验需要对技术参数进行严格控制。具体而言，实验人员应了解并理解电压采样与电流注入之间延迟的潜在变异性（通常称为抖动29）所带来的影响，同时还需考虑电极的被动特性、空间钳制限制以及被研究实验体系的生理保真度。Bettencourt 等人（2008）48 和 Butera 等人（2001）29 此前已表明，实现至少 50 kHz 的高采样率对于准确捕捉快速离子电导至关重要，反馈延迟应理想地保持在采样间隔的 25% 以下（≤ 5 µs）。商业系统（尤其是基于 Windows 的平台）所报告的标称采样率可能具有误导性；因此，通常需要独立验证系统性能，Milescu 等人（2008）25 和 Clausen 等人（2012）49 对此进行了更详细的讨论。空间钳制的限制也必须加以考虑，特别是在处理具有复杂形态和非等电位膜特性的完整神经元时。例如，若通过远离整合部位（如轴突起始段 AIS）的电极施加（或减去）电导，将导致所施加电导效应的表征不准确。电极电阻过高（不良）、电容补偿不足，和/或未校正液结电位误差，也可能导致电压测量值（输入信号）失真，从而错误地应用模型化的离子电导50,51。
数千个马尔可夫模型和霍奇金-赫胥黎（HH）模型可免费供研究人员使用，这些模型存储于在线数据库中，例如由人类脑计划支持的 ModelDB52 和由神经微环路实验室支持的 Channelpedia53。这些数据库包含突触电导、离子通道电导以及基于电导的神经元模型，这些模型主要用 NEURON、MATLAB 或 Python 编写。数据库文件通常提供必要的模型方程，以及有关建模所依据的细胞类型和实验的各类信息。
Markov 模型和 HH 电导模型均包含导通状态（模拟通道开放/激活）和非导通状态（模拟通道关闭）的门控状态/变量。然而，这两类模型在每个采样电压下计算电导值的方式上存在差异：Markov 模型需要更高的计算资源，但能更详细地描述模拟通道的门控特性。例如，在 HH 模型中，导通与非导通状态是相互独立的变量，各自由相应状态的电压输入和门控动力学决定54,55。相比之下，HH 模型并不模拟或限制门控状态之间的转换过程，例如在电压门控钠电导模型中，无法模拟通道从激活/开放动力学状态直接进入快失活动力学状态的转变过程25。这使得 HH 模型的计算复杂度较低54,55，并允许研究者同时引入多个快速电导的 HH 模型，同时保持较高的采样率和更新速率。
马尔可夫动力学状态模型由离散的动力学状态组成，这些状态可能是导通的或非导通的，并且这些状态以固定的拓扑结构相互连接。在马尔可夫模型模拟中，通过计算在每个采样电压下处于导通动力学状态的模拟通道比例，来确定电导值。各动力学状态中模拟通道所占比例（随时间变化）由速率常数决定，速率常数是控制状态占据从一个动力学状态向另一个动力学状态转变速率的参数。速率常数的单位为秒的倒数（s-1），表示单位时间内发生状态转换的概率。根据模型的不同，速率常数的数值可能依赖于电压或温度等动态因素。
在马尔可夫模型中，常微分方程用于描述每个动力学状态随时间变化的占据情况。这些方程描述了基于转移速率常数，系统处于各状态的概率如何随时间演化。这由一个速率矩阵 Q 表示：<img alt="量子态动力学的微分方程，公式表示，用于教学。" src="/files/ftp_upload/69155/69155eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 1">56。如上所述，决定状态之间转换的转移速率常数（r）可能受到输入电压（V）以及参数 α 和 β 的影响，后者反映了电导在不同电压下的动力学特性。这些方程可表示为：<img alt="反应速率公式 \(r_x = a_x \times \exp(V/\beta_x)\)；动力学分析方程。" src="/files/ftp_upload/69155/69155eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 2">，并且可以通过图形直观表示，图中包含连接各个动力学状态的边（即转移速率常数），展示进入和离开每个状态的转换关系56,57,58。关于马尔可夫模型的构建及其拓扑结构的详细讨论，可参见 Schoening 和 Silva（2024）的研究56。
自从动态钳技术发展为当前形式以来，非线性离子电导得以建模，并通过电流注入电极实时施加于活细胞19,59，该技术的方法与资源不断演进，且由于基于微控制器的低成本系统60以及免费开源软件23,25,26等创新，正变得越来越易于获取且成本低廉。商用系统，如Sutter Instrument公司的dPatch或Cytocybernetics公司的Cybercyte，通过集成化的硬件与软件解决方案，进一步推动了动态钳实验的快速实施27,61。
动态钳技术的多功能性使其具有广泛的应用，包括构建虚拟的化学和电突触、将真实神经元嵌入人工神经网络（或反之），以及添加虚拟离子通道62。重要的是，所施加电导的电压依赖性、动力学特性和幅值均可快速调节，使研究者能够直接检验一个或多个参数的变化如何影响动作电位的发放和膜兴奋性31。当前的系统具备高采样率，能够精确施加快速瞬变的电导，并且可轻松与传统的电生理设备集成60,63，这使得动态钳成为深入理解神经元功能及其功能障碍的理想方法。

先前关于自闭症谱系障碍（ASD）分子与细胞驱动机制的研究，通常强调突触功能障碍在其病理生理过程中的核心作用1,2大量研究表明，兴奋性突触密度增加2,3,4，突触修剪功能受损5以及突触后密度蛋白的改变6,7 在自闭症谱系障碍（ASD）模型中，突触功能障碍被认为是主要的病理机制。然而，近期研究表明，神经元内在兴奋性的改变同样是驱动ASD病理的重要因素。例如，ASD转基因小鼠模型及患者来源的细胞系研究发现，小脑浦肯野细胞的动作电位生成能力受损8,9,10 皮层锥体神经元11以及皮层锥体神经元亚类中树突兴奋性和突触整合能力的减弱12通道病涉及功能丧失性突变 SCN2A，编码电压门控钠（Nav）通道Nav1.2的孔形成α亚基 亚基，现已被公认为自闭症谱系障碍（ASD）的一种单基因致病原因13，并已被证明会导致多种中枢神经元固有兴奋性的缺陷14,15,16,17随着这类研究的深入，建立离子电导的病理性改变与这些改变对神经元及神经环路功能影响之间的因果关系显得尤为重要。动态钳电生理技术为此提供了一种有效的研究方法。Sharp 等（1992 和 1993）18,19，以及Robinson和Kawai（1993）20 最初描述了动态钳技术，其中将模拟的非线性离子电导（无论是否具有电压依赖特性）注入活体神经元，使研究者能够实时评估电压门控离子电导的特性或假定变化对神经元放电活动的影响21,22.
动态钳实验的实施得益于多个可免费获取的软件系统，例如 RTXI23QuB24,25和 StdpC26；然而，近期的技术进步已通过商用即插即用系统简化了动态钳制的实施，这些系统可在单台计算机和单一软件包内实现模型电导的建立、修改和应用。本文提供了使用 Sutter dPatch 系统进行动态钳制的实验方案27 并提供一个示例研究，用于检测结节性硬化症1（tuberous sclerosis 1, TSC1）靶向缺失如何影响Tsc1)9，这是自闭症谱系障碍（ASD）突变的常见位点28，由于电压门控钠电导表达的改变，影响了小脑浦肯野神经元的固有放电活动8.

<table><tbody><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-500&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>毛细玻璃管，硼硅酸盐标准壁，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长度 10 cm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0793</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>CleanBench</td><td>TMC</td><td>63-9090E</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>Compresstome VF-500-Z 振动切片机&amp;nbsp;</td><td>Prescisionary Instruments</td><td>https://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>Dell OptiPlex 7080</td><td>戴尔</td><td>https://www.dell.com/zh-cn/shop/%E5%8F%B0%E5%BC%8F%E8%AE%A1%E7%AE%97%E6%9C%BA/optiplex-7080-%E5%A1%94%E5%BC%8F%E6%9C%BA%E5%9E%8B%E5%92%8C%E5%B0%8F%E5%9E%8B%E6%9C%BA%E7%AE%B1/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffus</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>dPatch 放大器系统</td><td>Sutter Instrument</td><td>FG-DPATCH</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>EMD Millipore</td><td>324626-25GM</td><td>试剂</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Chemical</td><td>7365-45-9</td><td>试剂</td></tr><tr><td>在线加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P330-500&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>德克拉动物保健产品</td><td>193.40620.3&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>K-葡萄糖酸盐</td><td>TCI Chemicals</td><td>G0040</td><td>试剂</td></tr><tr><td>LinLab 软件</td><td>Scientifica</td><td>https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>LSE 6L 水浴锅</td><td>康宁</td><td>6783</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74804-12-9</td><td>试剂</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>012288.A9</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Model P-1000 程序控温拉针仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>FG-P1000</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>MP Biomedicals</td><td>56001-37-7</td><td>试剂</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>02-004-220&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-500&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>眼科软件</td><td>Digital Optics Limited</td><td>https://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-software</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Personna</td><td>60-0139-CTN</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>切片拨片器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>SliceScope Pro 3000</td><td>Scientifica</td><td>https://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Loctite</td><td>8040-00-142-9193</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>SutterPatch 软件</td><td>Sutter Instrument</td><td>https://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatch</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td>仪器设备</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td>试剂</td></tr></tbody></table>

动态钳技术用于研究与自闭症相关的神经元兴奋性损伤

Dynamic Clamp Methods to Investigate Impaired Neuronal Excitability Associated with Autism

自闭症谱系障碍（ASD）由多种遗传和环境因素引起。尽管大量与ASD相关的突变会破坏突触的发育或可塑性，但越来越多的研究表明，这些突变还会改变电压门控离子通道的表达和功能，从而导致神经元固有兴奋性的缺陷。全细胞电压钳记录可用于表征ASD相关突变如何影响离子通道功能。然而，这些实验无法直接评估离子电导的改变如何影响神经元动作电位的发放。动态钳电生理技术通过将用户定义的离子电导实时注入活体神经元，弥补了这一空白。该方法可对离子通道特性变化如何影响特定细胞类型电活动进行因果性检验。在本方法学文章中，我们描述了如何在急性制备的小脑脑片中、于生理条件下记录成年小鼠浦肯野神经元时，实施动态钳电生理技术。浦肯野神经元是本研究特别相关的模型，因其具有自发产生重复性、高频（20–100 Hz）动作电位的固有能力，且在ASD相关的小脑环路功能障碍中始终被涉及。我们聚焦于Tsc1基因，其功能缺失突变是ASD最常见的单基因病因之一。在小鼠浦肯野神经元中，Tsc1的缺失也与电压门控钠（Nav）通道表达减少相关。我们采用马尔可夫动力学状态模型来模拟并重现浦肯野神经元Nav电导特性，并进一步利用动态钳技术直接评估Nav电导变化对完整小脑浦肯野神经元固有放电活动的影响。我们提供了修改和调优离子电导模型的操作指南与资源。通过整合离子电导建模、动态钳技术以及传统的膜片钳技术，该方法为将遗传扰动与ASD相关神经元的生理结果相联系，提供了一个强大且灵活的研究框架。

在本实验中，我们采用动态钳技术，将模拟的电压门控钠（Nav）电导施加于急性分离的成年（6-7周龄）小鼠小脑旁矢状切片中的浦肯野神经元。研究在野生型（对照）小鼠和转基因小鼠上进行，后者通过Cre-loxP重组技术选择性地从小脑浦肯野神经元中删除结节性硬化症1基因（Tsc1）。结节性硬化症复合体（TSC）是一种多系统疾病，由TSC1或TSC2基因的功能丧失性突变引起32,28,33。TSC患者常被诊断患有癫痫、认知障碍和自闭症谱系障碍34,35。浦肯野神经元特异性Tsc1基因敲除的小鼠（本文中称为Tsc1mut/mut）表现出多种与自闭症谱系障碍相关的表型，包括运动功能障碍、社交互动行为异常、发声异常以及重复行为显著增强9,36。Tsc1mut/mut浦肯野神经元的动作电位发放能力减弱（图2A、B），这与Nav电流幅度显著降低（图2C）以及Tsc1mut/mut浦肯野神经元轴突起始段Nav通道表达减少有关8。Tsc1mut/mut浦肯野神经元中的Nav电流在动力学特性和电压依赖性方面与野生型浦肯野神经元相似8。在该转基因Tsc1mut/mut小鼠模型中，我们利用动态钳技术检测向Tsc1mut/mut浦肯野神经元添加Nav电导是否能够恢复其重复放电能力。随后我们进一步检测在野生型浦肯野神经元中减去内源性Nav电导是否会导致与Tsc1mut/mut浦肯野神经元中观察到的类似的放电减弱现象（图2B）。为了减去内源性表达的Nav电导，我们仍通过动态钳施加Nav电导，但将其电导极性反转。
用于模拟浦肯野神经元Nav电导的马尔可夫动力学状态模型（图1A）包含九个动力学状态，其中八个为非导通状态，分别标记为闭合态（C1、C2和C3）、失活-闭合态（IC1和IC2）、快失活态（IF1和IF2）以及慢失活态（IS）。此外还有一个开放/导通态（O）动力学状态30,31。各标记动力学状态之间的转换速率常数（见图1A）决定了模拟通道/电导在各个动力学状态中所占的比例。膜电压影响该模型中所有速率常数。在模拟的电压钳实验中，该模型产生的模拟Nav电流（in silico）以红色显示，位于急性分离的浦肯野神经元实测Nav电流（黑色）的右侧（图1A，下图）。引发这些模拟电流（红色）和浦肯野神经元Nav电流（黑色）的电压指令以黑色显示在电流迹线的上方。注意，在电压指令中，初始去极化步骤（至0 mV）引发快速瞬时的内向钠电流；在模拟迹线中，这反映了通道从非导通的闭合态进入开放动力学状态，产生短暂的内向电流，随后开放态通道进入快失活态（IF1和IF2）并累积。该去极化电压步持续时间较短（5 ms），随后膜电位跳变至-45 mV的中间复极化电压，并在此电位维持80 ms（图1A，下图）。在此复极化电压步期间，可观察到内向钠电流的再次增强，这一电流成分被称为“复苏性钠电流”（INaR）。在-45 mV持续80 ms的过程中，INaR表现出较INaT缓慢的幅度衰减，最终达到一个稳定的内向电流水平，即持续性Nav电流成分（INaP）。在膜复极化过程中，模型中INaR的激活（图1A，下图，红色）反映了模拟通道从快失活态（IF1 + IF2）恢复至开放/导通态。随着时间推移（在-45 mV维持期间），部分处于开放态的模拟通道逐渐累积进入一个吸收型的慢失活态（IS），这表现为INaR的衰减；而另一部分通道则持续停留在开放/导通态，表现为稳态的INaP电流成分30,31。
在代表性实验/结果中，将钠通道Markov电导模型（图1A）添加至急性分离的小脑切片中的成年浦肯野神经元。该实验装置的示意图如图3A所示。为了通过动态钳技术注入电流来施加建模的钠通道电导，我们使用了dPatch放大器系统（见图3B），该系统集成了完整的模数（A/D）和数模（D/A）转换功能。该系统还通过集成的ARM核心处理器（位于PC外部）处理信号转换，并配有集成的FPGA（现场可编程门阵列）电路，能够近乎实时地处理输入信号并反馈输出信号至电流注入电极27。本实验中采用动态钳技术施加了一个复杂的Markov电导模型，我们实现了最高达500 kHz的电流注入更新速率。
在无间隙电流钳记录期间，向 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元中加入模拟的钠通道电导（400 nS），导致细胞重复放电频率明显升高（图3C1，D1），表明在这些细胞中添加钠通道电导可能足以挽救 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元兴奋性的缺陷，尽管我们并未检验 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元兴奋性中报道的全部缺陷表型8。从 图3C2（上）所示的代表性轨迹可以看出，野生型普肯耶神经元具有以高频内在产生重复动作电位的能力。利用动态钳技术，我们通过施加反向（负极性）的模拟钠通道电导（-400 nS），从野生型普肯耶神经元中减去该模拟电导。减去模拟钠通道电导后，重复放电立即出现明显降低（图3C2，下），这一结果也支持以下假设：在 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元中测得的钠电流减少，有助于解释这些细胞中观察到的放电特性减弱8。在多个 Tsc1mut/mut 或野生型普肯耶神经元中进行的动态钳实验表明，分别添加或减去钠通道电导对放电频率均产生了稳定一致的影响。添加钠通道电导显著提高了 Tsc1mut/mut 普肯耶神经元的放电频率（P = 0.029）（图3D1），而在野生型普肯耶神经元中，减去钠通道电导则显著降低了放电频率（P = 0.031）（图3D2）（配对样本t检验）。
<img alt="Dynamic clamp method; conductance model; transition rate matrix; electrophysiology diagram; software setup." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69155/69155fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 1"> 
图1在动态钳制软件中建立马尔可夫模型。 (A) 一个马尔可夫状态转移图展示了能够重现小鼠小脑浦肯野神经元中测得的Nav电导特性的模型30该模型包含九个动力学状态，其中8个为非导电状态：三个闭合状态（C）、两个失活-闭合状态（IC）、两个快失活状态（IF）和一个慢失活状态（IS）。模型包含一个开放状态（O），该状态具有导电性。相邻动力学状态之间的连接或随时间的状态占据转换由转换速率常数（标记为S0-S15）定义。注意，每个动力学状态均被赋予一个数值编号红色），使用户能够定义马尔可夫模型及其动力学状态拓扑结构 门控状态矩阵 （如面板所示） C，如下所述）. (B) 展示了用户在 SutterPatch 动态钳制编辑器中操作的面板/图形界面。需要注意的是，这些动态钳制编辑器面板的排列方式与动态钳制软件中的实际布局并不一致。此外，并未展示与动态钳制编辑器相关的所有面板。C（上图）显示了一个门控状态矩阵的示例，其中输入的变量对应于该图中所示状态转移图的拓扑结构 A. 红色方框标注了门控状态矩阵中的第7行和第7列，对应模型的开放（O）动力学状态。在第7列中列出了所有进入开放（O）动力学状态的转换速率常数，而在第7行中列出了所有从开放（O）动力学状态转出的转换速率常数。通过这种组织方式，门控状态矩阵描述了模型的动力学状态数目、速率常数变量以及模型的拓扑结构（动力学状态之间的相互连接关系）。如图所示（DSutterPatch 面板/用户界面用于加载动态钳制电导模型，以及创建电流钳制程序的相关界面。用户与这些模型的交互操作在实验方案步骤 2.17–2.20 中予以描述。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69155/69155fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="电生理分析示意图；神经元放电、电压钳、野生型与 Tsc1^mut/mut 比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69155/69155fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：Tsc1mut/mut 普肯耶神经元的膜兴奋性较野生型对照减弱。（A）全细胞电流钳记录显示，野生型（上方，黑色）和 Tsc1mut/mut（下方，蓝色）普肯耶神经元中，Tsc1 突变型细胞的放电活动减弱。（B）与野生型对照相比，Tsc1mut/mut 普肯耶神经元的放电频率降低，且在不同细胞间具有一致性。Tsc1mut/mut 普肯耶神经元的平均（±± SEM）自发放电频率显著低于野生型细胞（P &lt; 0.0001）（Welch 非配对 t 检验；对照组 N = 13，n = 32；Tsc1mut/mut N = 6，n = 21）。（C）成年普肯耶神经元中钠离子通道电流（Nav 电流）的电压钳测量结果显示，与野生型对照相比，Tsc1mut/mut 细胞的平均（±± SEM）快速瞬态钠电流（INaT）峰值显著降低（P = 0.007，重复测量双因素方差分析；野生型对照：N = 6，n = 22，黑色；Tsc1mut/mut：N = 6，n = 16，蓝色方块）。右侧插图展示了由 -35 mV 去极化脉冲诱发的 INaT 记录示例，位于图 C 右侧。数据先前发表于 Brown 等人8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69155/69155fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用Nav电导模型和放大器装置的神经元放电动态；图表显示放电频率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69155/69155fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：使用动态钳技术确定离子电导对浦肯野神经元兴奋性的影响。动态钳技术包括通过记录电极采样膜电位，并基于所采样的电压计算模型电导的电流输出，然后通过电流注入电极将计算得到的电流施加到生物细胞上。图（A）展示了该实验装置。如果电压采样的频率足够高，并且电压采样与施加计算电流之间延迟（潜伏期）极小，则该技术可用于评估添加或减去模拟电导对神经元放电和膜兴奋性的影响。（B）在代表性实验中，使用SutterPatch软件和dPatch放大器系统获取动态钳记录。 dPatch是一种膜片钳放大器，具有外部信号处理器和完全集成的数字化器，非常适合进行动态钳记录（见讨论部分）。（C）代表性电流钳记录显示了在使用动态钳添加或减去400 nS模拟Nav电导前后，浦肯野神经元自发放电的情况（该模型电导见图1A）。在C1（左图）中，记录来自一个放电减弱的Tsc1mut/mut浦肯野神经元。添加400 nS的Nav电导后，该细胞的放电频率明显增加。而在C2中，记录来自一个野生型浦肯野神经元。在此实验中，模拟Nav电导以相反极性（-400 nS）施加，相当于减去Nav电导，导致重复放电频率显著降低。动态钳电流注入记录（灰色）显示在动作电位放电（电压）记录（黑色）下方。（D）这些动态钳实验的结果显示，在向Tsc1mut/mut浦肯野神经元添加Nav电导后（D1，n = 3），或从野生型浦肯野神经元减去Nav电导后（D2，n = 3），自发放电频率均发生一致且显著的变化（配对Student t检验），分别在Tsc1mut/mut 细胞（P = 0.029）和野生型细胞（P = 0.031）中具有统计学意义。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69155/69155fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

动态钳电生理技术可用于建立神经元放电缺陷与离子通道功能障碍之间的因果关系。本文介绍了在小鼠小脑浦肯野神经元中应用动态钳的技术与实验方案，并指出了有用的资源和技术注意事项。在一个代表性研究中，我们向Tsc1-/-浦肯野神经元中引入模拟的钠电导，以恢复其重复放电能力。

自闭症谱系障碍（ASD）由多种遗传和环境因素引发。尽管大量与ASD相关的突变会破坏突触……

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Neuroscience

神经科学

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一种计算机辅助的多电极膜片钳系统

闭环协议在现代电生理学中正日益普及。我们介绍一种简单、通用且成本低廉的方法，用于在皮层锥体神经元中执行复杂的电生理学实验方案 体外使用台式计算机和数字采集板。...

实时电生理学：利用闭环协议探究神经元动态及其更广泛应用

本文描述了一种定制方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为特定的高纯度神经元群体，这些神经元具有功能性的突触并表现出网络活动特征。电生理学分析表明，在暴露于A至G型肉毒神经毒素及破伤风神经毒素后，突触传递功能丧失。...

利用干细胞来源的中枢神经系统神经元网络培养物对生物性神经毒素进行功能评估

本方案描述了进行全细胞膜片钳记录的基本操作步骤。该技术可用于研究 神经元的电学行为，且在脑切片中进行时，可评估仍相对完整地整合于保存较好的脑环路中的神经元的多种功能。...

脑片中的全细胞膜片钳记录

脑片膜片钳技术是分析学习诱导的兴奋性或抑制性突触内在特性和可塑性变化的有效方法。...

用于分析学习诱导可塑性的脑片膜片钳技术

本文所述方案利用小鼠levator auris...

Levator Auris Longus 标本制备用于电压钳条件下哺乳动物神经肌肉传递的检测

学习动态钳位电生理技术，研究小鼠小脑浦肯野神经元中离子通道功能障碍与神经元放电缺陷之间的因果关系，并通过添加模拟钠电导恢复Tsc1缺失神经元的重复放电能力。

动态钳技术用于研究与自闭症相关的神经元兴奋性损伤

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