保留形态和RNA的钙化动脉组织制备与处理用于数字空间分析

空间转录组学相较于单细胞RNA测序和批量RNA测序具有优势，因其能够保留组织内的空间信息。通过使用RNAscope、计算去卷积方法以及公开可用的单细胞数据集等工具，可以将细胞行为与其所处微环境及基因表达谱进行关联，从而构建出组织生物学的整合视图。该技术正在迅速发展。

2025年5月的两篇《自然》论文聚焦于空间转录组学研究。如果我们查看PubMed的数据，增长曲线更为陡峭：2023年约有150篇空间转录组学相关论文，2024年接近300篇，预计2025年将超过500篇。空间转录组学已经重塑了多个重要研究领域，如癌症生物学、神经科学、免疫学和发育生物学。

然而，血管生物学研究仍相对滞后。动脉和静脉的高度异质性及其独特的几何结构，使其在组织附着和RNA保存方面具有挑战性。此外，晚期血管病变常伴有钙化和血栓形成，这进一步降低了组织的完整性。

本方案专为血管样结构设计。我们还提供了降低检测RNA、钙沉积及目标细胞所需染色过程成本的方法。鉴于目前专注于血管的空间转录组学研究相较于其他领域仍十分有限，本方案设计得具有成本效益且易于初学者操作，为血管研究领域的科研人员提供可及的工具，以在其研究中应用空间转录组学技术。

本方案对于临床实验中的大样本队列也具有潜在应用价值。在本方案中，我们详细描述了涵盖钙化动脉组织的谨慎处理、旨在保持RNA质量和组织形态的组织钙化方法、用于在选定感兴趣区域（ROI）过程中进行验证和引导的染色技术，以及在制备好的切片上进行最终形态学标志物染色的完整流程，确保样本可直接用于数字空间分析仪的处理。人胫动脉（包括胫前动脉、胫后动脉和阴部动脉）取自患者的截肢标本，并保存于含有1% HEPES和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。

将每根动脉连同培养基转移至100毫米的培养皿中。使用无菌剪刀和镊子去除多余的血管周围结缔组织，仅保留动脉壁。将修整后的动脉转移至新的培养皿中。

在培养皿内准备一个无菌的切板。使用手术刀将动脉切成一厘米长的节段。每条动脉取两个节段，立即放入液氮中的冻存管内速冻，用于后续蛋白质或RNA实验的冷冻保存与储存。

将剩余的组织段放入含有10%中性缓冲福尔马林的15毫升离心管中，在4摄氏度条件下固定24至48小时。配制含10% EDTA的脱钙溶液于RNA稳定溶液中，并将工作液的pH值调节至5.2。将固定的组织转移至含有PBS的新培养皿中，对组织进行短暂洗涤。

将每个样本转移至含有脱钙液的15毫升离心管中，在4摄氏度下振荡处理72小时。脱钙完成后，使用PBS轻轻振荡洗涤样本两次，每次5分钟。将组织转移至包埋盒中。

将包埋盒放入组织处理机中。用福尔马林处理至少四小时。处理时间可根据样本基质进行调整。

每个包埋块中放置多个动脉节段。将包埋块填充石蜡并使其完全冷却。通过在载玻片背面标记受限组织区域来制备切片。

确认所有组织片段均位于 GeoMx DSP 仪器要求的限定区域内。修去组织块上多余的石蜡，随后使用低剖面刀片将组织块切片至 5 µm 厚度。

将组织条带置于标记区域内。在DSP实验中，每个组织块至少切取连续四张切片用于不同的染色。将载玻片存放于4°C直至使用。

接下来，对连续切片进行RNAscope原位杂交以及组织学染色。此外，另一组切片使用形态学标记物进行染色，例如用于免疫细胞的CD45和用于平滑肌细胞的alpha-SMA。RNAscope原位杂交实验流程主要包括四个主要步骤：切片烘烤预处理、标准脱蜡和再水化、靶点修复、探针杂交结合信号放大及染料染色以实现RNA的可视化。

为了进行组织学验证，同时进行苏木精-伊红（H&E）染色和茜素红S染色，以精确定位钙盐沉积的位置。最后，采用标准免疫组织化学染色方法对形态学标志物进行染色，以识别目标细胞，指导感兴趣区域（ROI）的选择。本研究比较了两种基于EDTA的处理方案：第一种为仅使用10% EDTA处理72小时，第二种为使用10% EDTA与RNA稳定溶液联合处理相同时间。

通过RNAscope原位杂交评估形态学和RNA质量。两种方法均能保留血管结构，但经EDTA与RNA稳定溶液混合处理的切片显示出明显更强的RNA信号（如右侧面板所示），表明RNA稳定溶液可保护转录本，而EDTA则通过螯合结晶型磷酸钙，在不激活RNase的情况下逐步软化样本。在优化RNA保存策略并确认其质量后，我们展示了使用苏木精-伊红（H&E）和茜素红S（Alizarin Red S）进行钙沉积组织学染色的步骤。茜素红可选择性结合离子型钙盐，颜色从橙色变为砖红色，能够灵敏地显示微钙化和大钙化灶，但其在细胞和细胞外基质细节方面的显示效果不如H&E染色。

同时使用两种染色方法可最大化获取结构和组成信息。在完成形态学标记染色后，将玻片置于 GeoMx 平台进行扫描。抗体 CD45 标记免疫细胞，而 α-平滑肌肌动蛋白则标记中膜中丰富的血管平滑肌细胞。

所选的 ROI 包含约 100 至 150 个细胞核，RNA 产量充足。将 ROI 置于钙化区域附近及远离钙化区域的位置，以比较与胫动脉中膜钙化相关的空间基因表达模式。尽管在数小时的处理步骤中存在部分组织损失，但在每条动脉切片中仍鉴定了多个合适的 ROI。

综上所述，本工作流程涵盖了钙化动脉组织的处理和脱钙，以及通过验证性染色和感兴趣区域（ROI）选择进行空间转录组学研究的全过程。特别是，将苏木精-伊红（H&E）染色与钙特异性茜素红染色相结合，可精确定位血管钙化区域，并最大限度地获取结构和组分信息以优化ROI的选取。RNAscope分析表明，经过脱钙处理的动脉切片结构基本保持完整，且RNA含量充足。