Name: Shrinky丁克挂滴:一个简单的方法，形式和文化胚体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学习使用Shrinky Dink模具和PDMS微孔技术快速加载预定数量细胞，形成类胚体。该方法比传统悬滴法更简便高效，可精确控制细胞数量，减少人工操作，提高干细胞分化实验的可重复性。

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我们感谢CIRM对本工作的支持。该细胞系由加拿大多伦多安大略省西奈山医院的Dr. Andras Nagy慷慨捐赠。

1. 制作 Shrinky-Dink 模具
<ol>
<li>使用高分辨率打印机将所需图案打印在缩水片（shrinky-dink sheet）上。</li>
<li>在 163°C 下烘烤缩水片约 10 分钟，或直至其完全收缩并形成规则形状。</li>
<li>待缩水模具冷却后，将其浸入异丙醇浴中，直至整个表面刚好被覆盖。</li>
<li>小心地向模具表面喷洒少量丙酮，并轻轻摇晃容器数次。加入更多异丙醇以洗去多余的丙酮，并重复此步骤数次，直至缩水模具表面看起来洁净。</li>
<li>将模具浸入蒸馏水中 10 分钟，以去除任何残留的有机溶剂。</li>
<li>用空气吹干缩水模具。再于 163°C 下加热约 5 分钟，以固化油墨并蒸发任何残留溶剂。</li>
</ol>
2. 制备PDMS微孔
<ol>
<li>制备10:1的PDMS/固化剂混合物，并剧烈搅拌几分钟。</li>
<li>将Shrinky-Dink模具放入一个小培养皿中。倒入PDMS混合物，使其覆盖模具表面约1/2 cm。</li>
<li>将培养皿置于真空钟罩下，以去除PDMS混合物中的所有气泡。</li>
<li>将培养皿放入70°C烘箱中，过夜固化。</li>
<li>将固化的PDMS从模具上剥离，并通过施加压力将其键合到玻璃载玻片上。</li>
<li>弃去第一个微孔芯片，因其PDMS之间残留有油墨。</li>
<li>重复此步骤制备第二个芯片，确保无油墨残留且形状更清晰。</li>
<li>使用70%乙醇溶液清洗微孔芯片。将其置于紫外光源下照射10分钟以灭菌。</li>
</ol>
3. 在微孔中捕获细胞
<ol>
<li>计数细胞，并用培养基将其稀释至所需浓度（根据希望每孔中初始细胞数量而定）。例如，若希望每孔约有10–15个细胞（平均值 = 11，标准差 = 5.4，上样率 = 93%），我们使用了8×104 个细胞/mL的浓度。当细胞浓度为17×104 个细胞/mL时，可稳定获得每孔25–35个细胞（平均值 = 27.17857，标准差 = 7.7，上样率 = 100%）。</li>
<li>小心将微孔芯片放入含有固化PDMS基底的50 mL离心管中。</li>
<li>加入约2JDP mL细胞悬液。</li>
<li>在4°C条件下，以760 rpm离心5分钟。</li>
<li>用移液器吸除多余液体，并用1× PBS溶液小心清洗微孔芯片。</li>
<li>将微孔芯片转移至小型培养皿中，从离心管中取出芯片时需格外小心。</li>
<li>使用1× PBS溶液洗去多余的细胞。</li>
<li>将微孔芯片置于倒置显微镜下，以确认每孔中的细胞数量是否符合预期。</li>
<li>将含有细胞的微孔芯片置于标准条件下孵育。 <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="细胞显微图像；细胞分布与结构分析。" width="350" height="183" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure-01"></li>
</ol>
4. 细胞孵育
<ol>
<li>按照实验室常规 EB 方案操作。</li>
<li>从培养 chamber 的侧边缓慢更换培养基；避免扰动微孔中的细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

我们开发了一种简单、快速且可扩展的培养方法，可将预定义数量的细胞加载到微加工孔（由Shrinky-Dinks材料模制而成）中，并维持其进行类胚体发育。最终，这些细胞可方便地用于后续分析和实验。该方法适用于任何实验室，且无需专用设备，因为我们避免了对光刻技术的需求。我们可调节微孔的尺寸以及每孔细胞的浓度，从而改变类胚体的数量和大小。

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>材料名称</td><td>类型</td><td>公司</td><td>目录编号</td></tr><tr><td>Shrink-Dink 薄膜</td><td>材料</td><td>K&amp;B Innovations</td><td>D300-10A</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>材料</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P-4</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P-4</td></tr><tr><td>PBS</td><td>试剂</td><td>Sigma</td><td>P4417</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>试剂</td><td>R and D Systems</td><td>314-BP-010</td></tr><tr><td>Knock-Out DMEM（KO DMEM）</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物（KSR）</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Penn-Strep）</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇（BME）</td><td>试剂</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td></tr><tr><td>白血病抑制因子（LIF）{ESGRO 106 单位}</td><td>试剂</td><td>Chemicon</td><td>ESG1106</td></tr><tr><td>打印机</td><td>工具</td><td>HP</td><td>Laser Jet 2420d</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>工具</td><td>Yamato Scientific</td><td>DP-22</td></tr><tr><td>小鼠胚胎干细胞培养基（mESC 培养基，McCloskey 实验室方案）：（配制总体积：50 ml；100 ml）KO DMEM：40.8 ml；81.6 ml 15% KSR：7.5 ml；15 ml 1× 青霉素-链霉素：0.5 ml；1 ml 2 mM L-谷氨酰胺：0.5 ml；1 ml NEAA：0.5 ml；1 ml LIF：100 μl；200 μl BMP-4（10 ng/ml）：50 μl；100 μl 稀释后的 BME：50 μl；100 μl（将 35 μl 无菌过滤的 BME 加入 5 ml PBS 中，用注射器滤器再次过滤除菌。两周后弃用。溶液中最终浓度为 0.1 mM）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

shrinky-dink悬滴法：一种简单形成与培养类胚体的方法

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

类胚体（EB）是胚胎干细胞的聚集体。生成这些聚集体最常用的方法是悬滴法，即通过移液将任意数量的细胞滴加到孔板中，该方法操作繁琐。将干细胞强制性地置于紧密相邻的位置，可促进类胚体的形成。由于每个孔中的培养基都需每天手动更换，因此该方法需要大量人工操作。
此外，由于环境参数（包括细胞-细胞相互作用、细胞-可溶性因子相互作用、pH值和氧气供应）可能受类胚体（EB）大小的影响，即使在相同培养条件下，传统悬滴法获得的细胞群体也可能存在显著差异。近期研究确实表明，形成聚集体的初始细胞数量对干细胞分化具有重要影响。我们开发了一种简单、快速且可放大的培养方法，可将预定义数量的细胞加载至微加工微孔中，并维持其进行类胚体发育。最后，这些细胞易于获取，可用于进一步分析和实验。该方法适用于任何实验室，且无需专用设备。我们通过使用一种红色荧光小鼠细胞系（129S6B6-F1）生成类胚体来演示此方法。

我们展示了一种简单且快速的方法，可将预定义数量的细胞加载到微加工孔中，并维持其进行胚状体发育。

Shrinky-Dink悬滴法：一种简单形成与培养类胚体的方法

类胚体（EB）是胚胎干细胞的聚集体。制备这类聚集体最常用的方法是悬滴法，一种费时费力的方法……

胚胎体是由胚胎干细胞聚集形成的细胞团。生成这些细胞团最常用的方法是悬滴法，即通过移液将任意数量的细胞加入孔板中，该方法较为耗时费力。该过程需要大量人工操作，因为每天必须手动更换培养基和每一块培养板。此外，最近的研究表明，形成聚集体的初始细胞数量可能会影响干细胞的分化。然而，使用该方法无法预先确定细胞数量。在本视频中，我们展示了一种简单且快速的方法，用于将不同数量的细胞加载到微加工孔中，以培养类胚胎体。大家好，我是来自加州大学默塞德分校工程学院Michelle K实验室的Jonathan Pagan，这位是同样来自K实验室的Jesus Luna。今天我们将向您展示一种通过离心机制备类胚胎体和微加工孔的方法。该流程包括以下步骤：制备微型装置、加载干细胞以及培养干细胞。现在我们开始。本流程的第一步是使用高分辨率打印机制造Shrinky Dinks模具。在缩水片材上打印所需图案。接着，将缩水片材在160摄氏度下烘烤约10分钟，直至其完全收缩并形成规整的形状。待收缩后的印模冷却两分钟，至手感不烫时即可。将其浸入异丙醇浴中，直至整个表面刚好被覆盖。在收缩油墨模具浸入异丙醇后，小心地向模具上喷洒一些丙酮，并轻轻摇晃容器数次。然后加入更多异丙醇以洗去多余的丙酮，重复此步骤数次，直至收缩油墨模具看起来洁净为止。接下来，将模具浸入蒸馏水中10分钟，以洗去任何残留的有机溶剂。水洗后，使用压缩空气吹干收缩膜油墨模具，然后在160摄氏度下重新加热约五分钟。此步骤可使油墨致密化，并蒸发任何残留的溶剂。现在我们可以开始制备PDMS微孔。接下来将制备PDMS微孔，用于干细胞培养以促进胚状体发育。准备10:1的PDMS与固化剂混合物，并剧烈搅拌几分钟。接下来，将PDMS混合物倒入小培养皿中的缩水片模具上，直至覆盖模具表面约0.5厘米。倒入PDMS后，模具表面常会出现气泡，需将其去除。将培养皿置于真空钟罩下20分钟，以彻底消除PDMS混合物中的所有气泡。确保所有气泡均已去除后，将培养皿置于7°C的烘箱中孵育20分钟。孵育结束后，用剃刀片将固化的PDMS从模具上切下，用胶带清洁，并将其带有孔穴的一面朝上固定在玻璃载片上。只需对边缘施加压力即可完成。接下来，使用70%乙醇溶液进行清洁，并置于紫外光源下照射10分钟以达到灭菌目的。首次操作时，需丢弃聚二甲基硅氧烷（PDMS）。这有助于去除模具上残留的多余墨迹。此后即可直接使用该模具。重复模具制作步骤一次，以制备第二个无墨且形状更清晰的芯片。在开始操作前，务必先放电20秒，以形成亲水性表面，便于后续加载。制备好PMS微孔后，即可用于Enid小体的研究。接下来，我们开始操作。首先，需要将细胞计数，并用细胞培养基稀释至所需浓度，具体浓度取决于每个孔中希望接种的初始细胞数量。我们发现，当细胞浓度为每毫升1.5 × 10⁴个时，每个孔加样后可获得约14个细胞。将两毫升细胞溶液加入含有固化PDMS基底的50毫升离心管中。将微孔芯片小心放入离心管内，在760 RPM条件下离心五分钟。随后用移液器吸出培养基，并将微孔芯片置于小型培养皿中。从离心管中取出芯片时请注意避免洒出。接下来将微孔芯片置于倒置显微镜下，检查每个孔是否均已加样。将芯片放入支架中，并在标准条件下孵育含有细胞的微孔，孵育时间为24小时。为了维持细胞状态，可在24小时后从培养 chamber 的侧面缓慢更换培养基。注意避免扰动微孔中的细胞，此操作可每天进行一次。优点在于只需使用移液器一次即可完成所有培养基的更换，而无需像传统悬滴法那样逐个更换每个孔中的培养基。我们刚刚向您展示了如何利用收缩片模具培养细胞并生成拟胚体。该方法极为有用，因为它操作简单、快速，且比悬滴法更省力。该方法无需光刻技术。此外，我们还可以控制用于构建绣球体的起始细胞数量。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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