一种用于检测虫媒病毒抗体反应的多重血清学检测方法

在我们的实验室中，我们通过检测针对传染病的免疫反应，以更好地了解这些疾病在人群中的传播方式。本领域最近的进展是多重检测技术，该技术能够在单次反应中使用最小体积的样本同时检测多种不同的抗体。首先，准备八个 96 孔深孔板。

通过添加加样槽、磷酸二氢钠、Triton 溶液、磺基-NHS、EDC 和抗原溶液，为每块板做好准备。在自动处理器上设置偶联循环时，先打开仪器电源，使用软件设定程序参数。将板放入仪器指定的插槽中，选择相应程序并启动循环；循环完成后，取出板并按照制造商说明关闭仪器。

目视检查八号板中是否含有可见为棕色沉淀的珠子。将八号板中的偶联珠子转移至各自的1.5毫升离心管中保存。将偶联珠子于4°C保存，直至使用。

为计数磁珠，需充分涡旋振荡偶联后的磁珠。取10微升转移至细胞计数板，然后按照制造商的说明读取每毫升的磁珠数量。通过细胞计数仪观察图像，检查磁珠的聚集情况。

设置板布局。在另一个非结合板中，用PBT缓冲液稀释样品和标准品。将偶联磁珠混合物充分涡旋振荡30秒，然后超声处理至少60秒。

现在，将适量的珠子抗原转移至离心管中，并用PBT缓冲液调整体积。充分混匀预混液。取50 µL预混液加入成像微孔板中，然后将50 µL稀释后的样品加入成像微孔板中的珠子中，并在板式振荡器上混匀。

将培养板置于磁力架上，室温静置60秒。紧握培养板，弃去上清液。用适量PBT缓冲液配制二抗的稀释液。

向成像板中已洗涤的磁珠加入 50 微升抗体。在室温下于摇床上孵育 15 分钟，并用 PBT 再洗涤三次。将板插入荧光读板仪后，设置并保存检测程序。

通过ORPAL标准混合样本在最佳浓度下检测选定的虫媒病毒抗原，证实了抗体反应的线性关系。在比较手动与三种自动偶联方法时，观察到抗体反应呈平行线性。每种抗原和对照在19块不同板上获得的中位荧光强度值均位于均值范围内。

使用ORPAL标准品池时，多重检测与单重检测获得的中位荧光强度值之间表现出高度相关性。在塞内加尔队列中，针对Chick VVLP的抗体反应呈现出明显的双峰分布，而DENV1 NS1和RVFV NP的抗体反应也可见细微的双峰尾部。我们已证明，本血清学检测方法可同时检测多种虫媒病毒的抗体。我们经过验证的多重反应检测方法将有助于深入理解这些病毒在非洲大陆的传播情况。

我们的实验方案在多重检测所需试剂的制备过程中可大幅节省时间，并具有高度可重复性。