Name: 肾近端肾小管细胞线粒体裂变/融合动力学的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 学习利用共聚焦显微镜和ImageJ软件，通过Dendra2光转换荧光技术评估肾近端肾小管细胞中线粒体裂变与融合的动态变化。该方法为追踪移植线粒体在受体细胞中的整合与功能提供了有效框架。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目（资助号：5R01DK135470-03）、ISAC-NIH 资助项目（资助号：5U24DK128851-03）以及美国心脏协会博士后奖学金的支持。

所有动物实验均依照天普大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行（天普大学，动物实验方案编号-5183）。表达Dendra2蛋白的线粒体Pham小鼠为外购获得。
1. 细胞培养基的制备
<ol>
	<li>根据实验方案分离肾近端小管细胞，该方案在使用磁珠分离肾小球内皮细胞后进行24（图1A）。Bouchareb 等人开发了一种方法，利用磁珠从表达荧光线粒体（mito-Dendra2）的转基因小鼠肾脏中分离并培养肾小球内皮细胞（GECs）。在分离出GEC后，将沉淀中残留的小管部分分离并进行培养。</li>
	<li>将肾近端小管细胞接种于10 cm培养皿中，加入10 mL DMF-12培养基，补充5% FBS（热灭活）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）。培养2-3天，直至细胞从小管组织中迁移出来。</li>
	<li>通过形态学特征筛选小管细胞，筛选前需进行为期2天的饥饿处理（使用不含FBS的DMF-12培养基）。 
	注意：实验时应使用细胞融合度为50-70%的培养皿。接种前需使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>实验用细胞接种：根据实验需求，将细胞以每孔1-5 × 105个细胞的密度接种至玻璃底培养板中。接种后过夜培养，使细胞充分贴壁和生长，再加入顺铂。 
	注意：顺铂是一种具有危害性的化疗药物，必须严格遵守安全操作规程以保护人员和环境。为此，应遵循II级生物安全柜操作规范，穿戴个人防护装备（PPE），执行去污染、泄漏控制和废弃物处置（危险药物废弃物—化疗类）的相关规定：佩戴双层手套、护目镜，对工作台面进行去污染处理，并在工作区附近配备泄漏应急处理包，废弃物容器须明确标识。对于DMSO，也需穿戴PPE，在通风橱中操作，并遵守泄漏去污染及废弃物处置程序。</li>
</ol>
2. 使用顺铂诱导应激
<ol>
	<li>顺铂培养基的制备
	<ol>
		<li>将顺铂溶于DMSO中，配制50 mM的储备液。</li>
		<li>在玻璃底培养板中接种1–5 × 106个近端肾小管细胞，加入2 mL DMF-12培养基。 
		注：可使用任何类型的玻璃底培养皿。</li>
		<li>向实验组培养板中加入顺铂，使其终浓度为2 µM，DMSO终浓度为0.004%。 
		注：取2 µL 50 mM顺铂加入1,998 µL无FBS的DMF-12培养基中稀释，取80 µL加入实验组培养板中。</li>
		<li>将细胞孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成像
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜
	<ol>
		<li>将激光器配置为 405 nm（Dendra2 光转化）、488 nm（未转化 Dendra2 激发）和 561 nm（光转化后 Dendra2、Alexa 594）。</li>
		<li>打开激光器并等待其稳定（约 10 分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>研究分裂与融合事件
	<ol>
		<li>将激光器配置为 405 nm（Dendra2 光转化）、488 nm（未转化 Dendra2 激发）和 561 nm（光转化后 Dendra2、Alexa 594）。</li>
		<li>将培养皿放入孵育室中。</li>
		<li>在孵育室周围加入水，并将温度设定为 37 °C。应维持 CO2 的供应。</li>
		<li>让孵育室达到平衡状态。温度变化会对细胞造成应激。</li>
		<li>使用更高放大倍数和分辨率观察细胞，以进行线粒体成像。</li>
		<li>打开左上角的下拉菜单，选择 FRAP 选项（图 2A-D）。</li>
		<li>使用 LAS X 软件定义感兴趣区域（ROI），用于进行光漂白。 
		注意：感兴趣区域可绘制为任意大小，不会影响结果，因为后续将对单个线粒体进行分析。</li>
		<li>以低激光强度采集一系列漂白前图像，以建立基线荧光强度。将激光器设置为 405 nm 波长用于光转换（0.00）、48&#8239;nm（0.20）和 56&#8239;nm（0.20），确保细胞处于聚焦状态。 
		注意：激光波长后括号中的数值表示激光强度，可设为任意值，因其不影响光漂白效果。</li>
		<li>为对细胞进行光漂白，应用高强度激光脉冲对 ROI 区域进行漂白。将 FRAP 激光器设置为 405 nm（4.00）、488 nm（0.00）和 561 nm（0.00）。将漂白前设置为 5.140 秒，共 59 次迭代，漂白后时间设置为所需时长（图 2B）（括号中注明漂白前后激光强度）。</li>
		<li>漂白后成像时，继续以低激光强度采集图像，观察荧光恢复情况，持续 10 分钟。保持 FRAP 激光器设置为 405 nm（0.00）、488 nm（0.50）和 561 nm（0.50）。 
		注意：漂白时间可能因细胞类型而异；在本实验条件下，管状细胞和瓣膜间质细胞（VIC）中的线粒体采用了相似的漂白时间。FRAP 实验结束后，可进行图像采集或活细胞成像（图 3 和 补充视频 1），也可继续采集漂白后的图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 图像分析
注意：由于线粒体标记了 Dendra2 蛋白，经过光漂白后，Dendra2 蛋白会发生不可逆的构象变化，导致通过 561 nm 激光检测到的红色荧光增强。当红色线粒体与未漂白的绿色线粒体融合时，两者结合呈现黄色。利用这一现象，可检测动态的分裂/融合事件。
<ol>
	<li>分析融合的红色与绿色线粒体
	<ol>
		<li>安装 RGB 轮廓插件，用于分析所选区域中红色和绿色信号的分布。 
		注意：请按照网站上的说明将该插件添加到 Fiji 软件中。</li>
		<li>打开 ImageJ（图 4A）。</li>
		<li>从 文件 菜单中找到并打开待分析的文件（图 4B）。</li>
		<li>选择 彩色模式复合图像，勾选 自动缩放 选项，并打开待分析的视频（图 4C）。</li>
		<li>选择一个矩形区域进行分析（图 4D）。</li>
		<li>将鼠标悬停在所选矩形区域附近，右键单击并选择 复制 （图 4E）。</li>
		<li>选择 复制超堆栈 选项，以复制所有图像堆栈（图 4F）。</li>
		<li>为将复制的堆栈转换为 RGB 格式，请选中图像，然后在图像下拉菜单中选择 RGB 选项（图 4G-H）。</li>
		<li>RGB 图像被复制后，仅选择一个帧（图 4I）。</li>
		<li>如果图像中的线粒体呈弯曲状，请沿其长度方向绘制一条线，然后进入 编辑 菜单，选择 选区，并点击 拉直 （图 5A）。</li>
		<li>为图像设置标题，并将线条宽度设为 20 像素（图 5B）。</li>
		<li>拉直线粒体后，沿目标线粒体绘制一条线，以确保其与直线对齐（图 5C）。</li>
		<li>打开 RGB 轮廓插件（图 5D）。</li>
		<li>插件激活后，将生成一条曲线图，显示沿所画线段的红色和绿色荧光强度。每个峰的高度与荧光强度成正比（图 5E）。 
		注意：也可使用线粒体分析插件25计算线粒体形态。选择用于曝光的区域，分析所选区域内的阈值，然后测量线粒体形态及二维参数。可选择面积、周长等其他参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 分析融合事件
<ol>
	<li>建立融合前基线：在线粒体融合之前，确认红色荧光（561 nm）定位于一个线粒体，绿色荧光（488 nm）定位于相邻的另一个线粒体。相应的荧光强度图应显示两个明显分离的峰，分别为红色峰和绿色峰，且重叠部分极少。</li>
	<li>确认融合后事件：融合发生后，红色信号（代表 Dendra2 基质内容物）应扩散至相邻的绿色线粒体中，表明内容物混合。此时荧光强度图将显示红色与绿色峰的重叠，从而确认融合事件的发生。</li>
	<li>融合事件的评估可通过在活细胞成像中仔细选择健康的线粒体与光漂白的线粒体进行融合来实现。随时间推移，红/绿荧光强度比值的变化可指示融合事件的发生。</li>
</ol>

<ol><li>Liesa, M., Palacin, M., Zorzano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+mammalian+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease.</a> Physiol Rev. 89 (3), 799-845 (2009).</li>
<li>Chen, Z., Berquez, M., Luciani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+mitophagy%2C+and+metabolic+disease%3A+towards+assembling+the+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, mitophagy, and metabolic disease: towards assembling the puzzle.</a> Cell Stress. 4 (6), 147-150 (2020).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+segmentation+and+function+prediction+in+live-cell+images+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial segmentation and function prediction in live-cell images with deep learning.</a> Nat Commun. 16, 743(2025).</li>
<li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitocytosis%2C+a+migrasome-mediated+mitochondrial+quality-control+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitocytosis, a migrasome-mediated mitochondrial quality-control process.</a> Cell. 184 (11), 2896-2910.e13 (2021).</li>
<li>Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+regulation+of+the+divisome+for+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission.</a> Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPBP8+modulates+mitochondrial+fission+through+a+Drp1-dependent+process%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">GTPBP8 modulates mitochondrial fission through a Drp1-dependent process.</a> J Cell Sci. 137 (8), jcs261612(2024).</li>
<li>San-Millán, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+role+of+mitochondrial+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">The key role of mitochondrial function in health and disease.</a> Antioxidants. 12 (4), 782(2023).</li>
<li>Ponte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drp1-mediated+mitochondrial+fission+regulates+calcium+and+F-actin+dynamics+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Drp1-mediated mitochondrial fission regulates calcium and F-actin dynamics during wound healing.</a> Biol Open. 9 (5), bio048629(2020).</li>
<li>Sabouny, R., Shutt, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+dynamics+in+mtDNA+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial dynamics in mtDNA maintenance.</a> J Cell Sci. 134 (24), jcs258944(2021).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+tracking+with+two-photon+phosphorescent+terpyridyl+iridium%28III%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics tracking with two-photon phosphorescent terpyridyl iridium(III) complexes.</a> Sci Rep. 6, 20887(2016).</li>
<li>Chen, W., Zhao, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+health+and+disease%3A+mechanisms+and+potential+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 333(2023).</li>
<li>Sabouny, R., Shutt, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+mitochondrial+fission+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of mitochondrial fission and fusion.</a> Trends Biochem Sci. 45 (7), 564-577 (2020).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+adaptation+in+cancer+drug+resistance%3A+prevalence%2C+mechanisms%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial adaptation in cancer drug resistance: prevalence, mechanisms, and management.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 97(2022).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+scaffold+SLP2+anchors+a+proteolytic+hub+in+mitochondria+containing+PARL+and+the+i-AAA+protease+YME1L%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The membrane scaffold SLP2 anchors a proteolytic hub in mitochondria containing PARL and the i-AAA protease YME1L.</a> EMBO Rep. 17 (12), 1844-1856 (2016).</li>
<li>Schiavon, C. R., Shadel, G. S., Manor, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+mobility+in+Charcot-Marie-Tooth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial mobility in Charcot-Marie-Tooth disease.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 624823(2021).</li>
<li>Sivakumar, A., Shanmugarajan, S., Subbiah, R., Balakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondrial+PTEN-L+determines+cell+fate+between+apoptosis+and+survival+during+chronic+alcohol+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondrial PTEN-L determines cell fate between apoptosis and survival during chronic alcohol consumption.</a> Apoptosis. 25 (7-8), 590-604 (2020).</li>
<li>Simula, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+sustains+CD8%2B+T+cell+migration+for+an+efficient+infiltration+into+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism sustains CD8+ T cell migration for an efficient infiltration into solid tumors.</a> Nat Commun. 15 (1), 2203(2024).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+3D+superresolution+fluorescence+and+electron+microscopy+reveal+the+relationship+of+mitochondrial+nucleoids+to+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5, 7924(2015).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+the+arrangement+of+inner+membrane+protein+complexes+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals the arrangement of inner membrane protein complexes in mammalian mitochondria.</a> J Cell Sci. 134 (13), jcs252197(2021).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interactome+of+intact+mitochondria+by+cross-linking+mass+spectrometry+provides+evidence+for+coexisting+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The interactome of intact mitochondria by cross-linking mass spectrometry provides evidence for coexisting respiratory supercomplexes.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (2), 216-232 (2018).</li>
<li>Karbowski, M., Cleland, M. M., Roelofs, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarbowski%2C+M+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. , Elsevier. Netherlands. (2014).</li>
<li>Kleih, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+impact+of+cisplatin+on+mitochondria+induces+ROS+production+that+dictates+cell+fate+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Direct impact of cisplatin on mitochondria induces ROS production that dictates cell fate of ovarian cancer cells.</a> Cell Death Dis. 10 (11), 851(2019).</li>
<li>Bouchareb, R., Yu, L., Lassen, E., Daehn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+endothelial+cells+with+fluorescent+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria.</a> J Vis Exp. (187), e64147(2022).</li>
<li>Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+of+the+mitochondrial+network+morphology+with+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Phys%22%5BJournal%5D)">Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research.</a> Front Phys. 10, 855775(2022).</li>
<li>Montecinos-Franjola, F., Ramachandran, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMontecinos-Franjola%2C+F+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. , Springer, US. (2020).</li>
<li>Gaspar, M. L., Chang, Y. F., Jesch, S. A., Aregullin, M., Henry, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+repressor+Opi1p+and+ER+membrane+protein+Scs2p+facilitates+transit+of+phosphatidic+acid+from+the+ER+to+mitochondria+and+is+essential+for+INO1+gene+expression+in+the+presence+of+choline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction between repressor Opi1p and ER membrane protein Scs2p facilitates transit of phosphatidic acid from the ER to mitochondria and is essential for INO1 gene expression in the presence of choline.</a> J Biol Chem. 292 (45), 18713-18728 (2017).</li>
<li>Karbowski, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarbowski%2C+M+%22Adv+Exp+Med+Biol%22">Adv Exp Med Biol</a>. , Springer, US. (2010).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+quantitatively+revealed+by+STED+nanoscopy+with+an+enhanced+squaraine+variant+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe.</a> Nat Commun. 11 (1), 3699(2020).</li>
<li>Opstad, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+data+of+mitochondria+and+lysosomes+in+cardiomyoblasts+under+normal+and+galactose-adapted+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy data of mitochondria and lysosomes in cardiomyoblasts under normal and galactose-adapted conditions.</a> Sci Data. 9 (1), 98(2022).</li>
<li>Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+expansion+microscopy+to+visualize+and+characterize+the+morphology+of+mitochondrial+cristae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 617(2020).</li>
<li>Teixeira, P., Galland, R., Chevrollier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopies%2C+technological+breakthrough+to+decipher+mitochondrial+structure+and+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopies, technological breakthrough to decipher mitochondrial structure and dynamic.</a> Semin Cell Dev Biol. 159 - 160, 38-51 (2024).</li>
<li>Kirchweger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshots+of+mitochondrial+fission+imaged+by+cryo-scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Snapshots of mitochondrial fission imaged by cryo-scanning transmission electron tomography.</a> J Cell Sci. 138 (9), jcs263639(2025).</li>
<li>Collins, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+morphology+and+mitophagy+in+heart+diseases%3A+qualitative+and+quantitative+analyses+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial morphology and mitophagy in heart diseases: qualitative and quantitative analyses using transmission electron microscopy.</a> Front Aging. 2, 670267(2021).</li>
<li>Marshall, A. G., Damo, S. M., Hinton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Revisiting focused ion beam scanning electron microscopy.</a> Trends Biochem Sci. 48 (6), 585-586 (2023).</li>
<li>Adebayo, M., Singh, S., Singh, A. P., Dasgupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion+and+fission%3A+the+fine-tune+balance+for+cellular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion and fission: the fine-tune balance for cellular homeostasis.</a> FASEB J. 35 (6), e21620(2021).</li>
<li>Munro, D., Baldy, C., Pamenter, M. E., Treberg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exceptional+longevity+of+the+naked+mole-rat+may+be+explained+by+mitochondrial+antioxidant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The exceptional longevity of the naked mole-rat may be explained by mitochondrial antioxidant defenses.</a> Aging Cell. 18 (3), e12916(2019).</li>
<li>Varuzhanyan, G., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics during spermatogenesis.</a> J Cell Sci. 133 (14), jcs235937(2020).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突可披露。

线粒体分裂/融合是维持线粒体稳态和细胞存活的关键动态过程26。对这些过程进行准确评估需要采用先进的成像技术，以可视化并定量分析线粒体的形态、动态变化及功能27,28。目前已有多种技术用于测量线粒体的分裂与融合。其中一些精密工具包括受激辐射损耗（STED）纳米显微镜，可用于活细胞中线粒体嵴动态的可视化观察29。结构照明显微镜（SIM）已被用于线粒体亚结构的多色成像30。扩展显微镜技术可用于可视化和表征线粒体嵴的形态31。电子显微镜可提供线粒体的超微结构细节32。此外，电子断层扫描技术（Cryo-STET）可用于观察完整的线粒体及其周围环境33。透射电子显微镜（TEM）可用于观察细胞中线粒体形态和数量的变化...

线粒体是一种动态的细胞器，在能量产生、细胞死亡和信号转导中发挥着至关重要的作用1。线粒体形态是指线粒体区室的大小和形状，其形态高度响应细胞内外环境的变化，并对维持细胞健康至关重要2。线粒体的形态可为其功能提供关键信息，然而，线粒体形状的改变可能影响细胞代谢及整体健康状态3。线粒体形态的异常与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、癌症和代谢性疾病4。线粒体形态通过融合与分裂/融合过程动态调控，这些过程对于维持细胞稳态以及响应各种代谢需求至关重要5,6。
线粒体动力学有助于该细胞器应对不同的应激因素和代谢需求7涉及线粒体在细胞内或细胞间的持续分裂与融合，以及运动。线粒体通过形态变化来适应细胞的能量需求 通过 分裂/融合事件8这些过程决定了线粒体的形态，并影响其功能，如能量产出、活性氧（ROS）生成以及线粒体质量控制。7,9,10此外，线粒体分裂与融合是维持功能性线粒体网络的相互平衡的机制。11融合可促进线粒体内容物的交换，实现互补并缓冲局部损伤，而分裂则有助于受损线粒体的分离与清除 通过 线粒体自噬7,12此外，分裂有助于分离线粒体中受损的组分，这些组分随后通过线粒体自噬（一种选择性自噬过程）被清除。13另一方面，融合能够实现线粒体内容物的互补，从而稀释任何受损组分14线粒体分裂/融合的关键调控因子是线粒体融合蛋白（Mitofusins, MFN1/2），其在介导线粒体外膜融合过程中发挥重要作用15,16（OPA1）：这种动力蛋白样GTP酶负责线粒体内膜融合16裂变蛋白包括动力相关蛋白1（Drp1）和促裂变蛋白13,17线粒体分裂蛋白1（Fis1）、线粒体分裂因子（Mff）和线粒体分裂调节因子1样蛋白（MTFR1L）。已有多种技术被用于研究线粒体超微结构，例如超分辨率电镜（EM）。18单分子荧光 原位 杂交（smFISH）技术结合STED与MINFLUX超分辨率显微镜（纳米显微技术），已被用于可视化单个线粒体mRNA及其相关蛋白18单分子定位显微技术（SMLM）可追踪膜间距的变化19随机光学重建显微镜（STORM）超分辨率显微技术可用于研究线粒体内膜复合物20然而，这种先进设备的使用并不容易普及。共聚焦显微镜则更具可及性，且对操作者专业技术要求较低。此外，线粒体靶向荧光蛋白的开发极大地推动了活细胞中线粒体动态的研究21，因为我们使用光激活型绿色荧光蛋白（GFP）来观察和定量线粒体融合22.
为了研究线粒体分裂与融合，可对细胞施加应激或使用顺铂等药物处理，顺铂能够结合DNA并诱导DNA损伤，最终导致线粒体介导的细胞凋亡23。在本研究中，我们利用光可转换标记的Dendra2线粒体（来自光激活型线粒体小鼠）来观察经顺铂处理的肾小管上皮细胞中的线粒体分裂与融合事件，因为这类细胞富含线粒体且具有较强的再生能力。然而，该实验方案也可应用于任何表达光可转换标记Dendra2线粒体的细胞类型（图1A-C）。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>基础培养基&amp;nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. No.11320033 )&amp;nbsp;</td><td>近端小管细胞培养&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)&amp;nbsp;</td><td>5–10% 添加量&amp;nbsp;</td><td>(Biowest/Cat. No.S181B)&amp;nbsp;</td><td>培养基增补&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>100倍浓度&amp;nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. No.15140122)&amp;nbsp;</td><td>抗生素保护&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白&amp;nbsp;</td><td>包被&amp;nbsp;</td><td>(Sigma-C5533-5M)&amp;nbsp;</td><td>Ibidi 培养板包被&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>0.25% 溶液&amp;nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. No.25200056)&amp;nbsp;</td><td>细胞解离&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)&amp;nbsp;</td><td></td><td>(Gibco/Cat. No.10010023 )&amp;nbsp;</td><td>细胞洗涤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;处理&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顺铂&amp;nbsp;</td><td>2 &amp;micro;M 工作浓度&amp;nbsp;</td><td>(Selleck Chemicals/Cat. No.S1166)&amp;nbsp;</td><td>应激诱导&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)&amp;nbsp;</td><td>溶剂对照&amp;nbsp;</td><td>(Fisher Scientific/Cat. No.D1391)&amp;nbsp;</td><td>顺铂溶剂对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成像&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无酚红培养基&amp;nbsp;</td><td>活细胞成像&amp;nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. No.21041025)&amp;nbsp;</td><td>降低背景荧光&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>分子生物学&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&amp;reg;&amp;nbsp;</td><td>RNA 提取&amp;nbsp;</td><td>(Gibco/Cat. No.15596018)&amp;nbsp;</td><td>总RNA分离&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix&amp;nbsp;</td><td>qPCR 反应体系&amp;nbsp;</td><td>(Thermo Scientific/Cat. No.K0221)&amp;nbsp;</td><td>线粒体动力学相关基因表达分析（DNM1L、FIS1、MFN1、MFN2、OPA1）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>荧光工具&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dendra2&amp;nbsp;</td><td>线粒体基质标签&amp;nbsp;</td><td>Jacson Laboratory(PhAM&lt;sup&gt;excised&lt;/sup&gt;)&amp;nbsp;</td><td>光转换报告蛋白（405 nm 转换，488/561 nm 成像）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica DMi8&amp;nbsp;</td><td>活细胞成像和荧光漂白恢复（FRAP）&amp;nbsp;</td><td>405 nm/488 nm/561 nm 激光器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Image J&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RGB Profiler 插件&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html.&amp;nbsp;</td><td>融合事件分析（红/绿信号重叠）&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

肾近端小管细胞中线粒体分裂/融合动态的评估

Assessment of Mitochondrial Fission/Fusion Dynamics in Kidney Proximal Tubular Cells

线粒体最主要的功能是合成ATP，同时也是细胞代谢的关键调控因子。线粒体动力学包括线粒体在细胞内和细胞间的移动，以及分裂与融合过程。这些事件对于维持线粒体功能至关重要，有助于保持细胞稳态、形态、生物能量学、质量控制以及应激反应。相反，线粒体动力学的失调会影响细胞的形态和功能。精确测量线粒体的分裂与融合事件可反映细胞的健康状态。目前测量线粒体动力学的方法包括使用超分辨率显微镜等先进成像技术、用于评估连接性的荧光技术（如光漂白后荧光恢复，FRAP），以及用于时空控制的光遗传学工具。定量分析则利用计算工具测量长度、数量和分支等参数，以反映分裂与融合的平衡状态。然而，这些方法需要专业技术以及复杂的仪器设备。本文中，我们描述了结合共聚焦显微镜与ImageJ（Fiji）中免费工具，利用标记在线粒体细胞色素c上的dendra2蛋白的光转换特性，来研究线粒体分裂与融合事件的方法。

通过酶消化法从小鼠肾脏中分离原代肾小管上皮细胞，并在添加了5%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMF-12培养基中，于37 °C、5% CO2条件下进行培养。当细胞融合度达到80%时，用胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶-EDTA）消化后，以每孔5 × 104个细胞的密度接种于预先包被胶原蛋白的玻璃底培养板中。
培养基中含顺铂，终浓度为 µM，溶剂为 DMF-12 培养基，添加 0.004% DMSO（v/v，与顺铂溶剂体积一致）。每孔加入 2 mL 培养基，细胞处理 24 小时。处理结束后，弃去原培养基，更换为不含化合物的新鲜培养基。随后评估细胞形态 通过 相差显微镜。本文中，我们提供了一种自适应方法，利用共聚焦显微镜和ImageJ分析Dendra2光转换荧光，以检测化疗处理后线粒体裂变与融合事件的动态变化。
光漂白后荧光恢复（FRAP） 
使用 FRAP 方法评估了顺铂处理的近端小管细胞中的线粒体动力学。在表达线粒体靶向 dend...

本文介绍了利用共聚焦显微镜和ImageJ评估线粒体裂变/融合动态的方法 通过 Dendra2 光转换荧光

线粒体最广为人知的功能是合成ATP，并作为细胞代谢的关键调节者。线粒体动力学包括……

在我们的实验室中，我们致力于将线粒体移植到受损器官以实现修复。因此，我们正在开发新的操作方案，以分离出高效且具有动态活性的线粒体。挑战包括在不进行染色标记的情况下追踪移植后的线粒体，同时准确评估其在新宿主细胞中的整合情况、功能状态及动态行为。将肾近端小管细胞接种于玻璃底培养板中。在培养箱中孵育过夜，以促进细胞贴壁和生长。次日，向实验组培养板中加入顺铂，使其终浓度为 2 µM。接下来，将共聚焦显微镜的激光器设置为 405 纳米、用于未转化 Dendra2 激发的 488 纳米以及 561 纳米。打开激光器，并等待约 10 分钟以使其稳定。将培养皿放入孵育腔室中。在腔室周围加入水，并将温度设置为37摄氏度，确保持续供应二氧化碳。在成像前使培养腔室达到平衡状态。使用更高放大倍数和分辨率观察细胞，以进行线粒体成像。打开左上角的下拉菜单，选择 FRAP 选项。使用 LAS X 软件定义将要进行光漂白的兴趣区域。现在，通过将 FRAP 激光设置为 405 纳米（强度为 4.00）和 488 纳米（强度为 0.00），施加高强度激光脉冲以漂白该兴趣区域。561 纳米波长设置为 0.00。预漂白阶段设为 5.140 秒，共 59 次迭代，并定义漂白后的成像时间点。漂白后成像阶段，使用 FRAP 激光在 405 纳米波长（0.00）和 488 纳米波长（0.50）下，以低激光强度持续采集图像 10 分钟。以及561纳米处为0.50。为了分析融合的绿色和红色线粒体，首先安装RGB Profiler插件。打开ImageJ软件，然后从文件菜单中定位并打开待分析的图像文件。选择彩色模式为“复合”，勾选自动缩放选项，然后打开要分析的视频或图像堆栈。在图像上绘制一个矩形区域，右键单击并选择“复制”。选择“复制超堆栈”选项以复制所有图像堆栈。选择图像，然后在“图像”下拉菜单中选择 RGB，将复制的堆栈转换为 RGB 格式。复制 RGB 图像并仅选择一个帧。如果线粒体呈现弯曲状，沿其长度绘制一条线，然后进入“编辑”菜单，选择“选择”并点击“拉直”。现在，为校直后的图像选择一个标题，并将线条宽度设置为 20 像素。沿校直后的线粒体绘制一条线以正确对齐。然后打开 RGB Profiler 插件。插件激活后，将生成一条曲线图，显示所绘制线路上的红色和绿色荧光强度。每个峰的高度与荧光强度成正比。融合后，需确认红色荧光已扩散至相邻的绿色线粒体，表明内容物已混合。验证强度图现在是否显示重叠的红色和绿色峰。为评估融合，选择活细胞成像中健康的线粒体和光漂白的线粒体进行融合分析。通过监测红色与绿色荧光比值随时间的变化来指示融合事件。对照细胞显示出细长的线粒体，其基质呈黄色，表明红色和绿色基质发生了线粒体融合。顺铂处理的细胞则表现出断裂的线粒体，红色和绿色信号重叠减少，提示融合功能受损。在对照细胞中，光漂白区域的荧光随时间推移逐渐恢复，表明线粒体融合活动活跃。经顺铂处理的细胞其荧光比值几乎保持稳定，表明线粒体融合功能受损。与对照组相比，顺铂处理组细胞中CLRS-1的表达显著降低。通过细胞中荧光表达及光可切换线粒体技术，可帮助我们追踪线粒体并评估其在受体细胞中的动态变化。活细胞线粒体形态测量可实时反映细胞健康状况，基因标记和光可切换蛋白可提高检测的准确性和稳健性。未来的研究将探索协调重塑过程的细胞内机制，包括线粒体和细胞质成分，以形成管状、球状或环状线粒体。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肾近端肾小管细胞线粒体裂变/融合动力学的评估

通过追踪光转化的基质靶向GFP在随时间变化的线粒体网络中的平衡情况，来测量线粒体融合。迄今为止，每次仅能对一个细胞进行长达一小时的动力学分析。我们提出了一种可同时测量多个细胞的方法，从而加快了数据采集过程。...

一种基于mtPA-GFP的快速、高分辨率线粒体融合检测方法：利用共聚焦显微镜并行获取多个细胞的动力学数据

本文描述了蛋白激酶C（PKC）同工酶激活对与呼吸和氧化磷酸化相关的线粒体功能以及细胞活力的影响。该方法采用腺病毒技术在原代细胞培养中选择性地过表达PKC同工酶，并结合多种检测手段以评估线粒体功能和细胞的能量状态。...

过表达蛋白激酶C同工酶的肾细胞中线粒体功能与细胞活力的评估

本文概述了如何研究一种（细胞周期）激酶在线粒体中的定位，以及如何确定其在线粒体内的亚结构定位和潜在的线粒体底物或靶标。将蛋白强制表达于线粒体中，是研究目的蛋白在线粒体定位后所产生功能效应的有效工具。...

研究核细胞周期激酶Cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

要深入理解线粒体功能的调控机制，必须分析线粒体结构与功能之间的关系。本文描述并演示了在活体和固定处理的黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中研究线粒体结构与功能的特定方法。...

在 Drosophila 卵巢中研究线粒体结构与功能

本方案提供了一种经济有效的方法，用于分离和鉴定小鼠原代肾小管细胞，随后可对这些细胞进行传代培养，以评估肾脏生物学功能...

小鼠原代肾小管上皮细胞的分离、鉴定及高通量细胞外通量分析

本文介绍了一种利用共聚焦显微镜对线粒体网络进行扫描，通过活体骨骼肌成像来分析线粒体密度及纵向分布变化的实验方案。...

通过共聚焦显微镜分析大鼠活体骨骼肌纤维中线粒体密度及其纵向分布

本文介绍了线粒体事件定位器（MEL），这是一种ImageJ插件，可用于定量分析随时间变化的线粒体分裂与融合活性的三维动态。我们还描述了一种图像处理流程，可用于在ImageJ中进行分析前对显微图像进行预处理和优化。...

通过动态三维荧光显微图像理解线粒体形态的变化

模拟近端肾小管上皮细胞的缺氧/复氧损伤

局部注射线粒体染料可标记终末施万细胞的线粒体 体内...

方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

在本视频中，我们将向您展示如何利用凝胶内活性检测方法分析人类胚胎干细胞线粒体呼吸链复合物。...

检测人类胚胎干细胞中线粒体复合物的活性

学习利用共聚焦显微镜和ImageJ软件，通过Dendra2光转换荧光技术评估肾近端肾小管细胞中线粒体裂变与融合的动态变化。该方法为追踪移植线粒体在受体细胞中的整合与功能提供了有效框架。

肾近端小管细胞中线粒体分裂/融合动态的评估

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