利用功能化纳米抗体对培养细胞进行内吞运输的活细胞成像

我们正在研究跨膜蛋白的内吞作用和逆向运输，以及介导这些运输过程的分子机制。为了研究从细胞表面出发的蛋白质运输，通常会使用传统抗体，但这类抗体可能引起交联并导致蛋白被靶向溶酶体。首先，获取经 VHH-mCherry 转化的大肠杆菌（Escherichia coli）菌体沉淀。

向细菌细胞沉淀中加入 30 毫升含有 20 毫摩尔咪唑的 PBS 冰冷结合缓冲液。用移液器上下吹打，充分重悬沉淀。将重悬后的混合液转移至已标记的 50 毫升离心管中。

向重悬的细胞中加入终浓度为 200 微克/毫升的溶菌酶、20 微克/毫升的 DNase I、1 毫摩尔的氯化镁和 1 毫摩尔的苯甲基磺酰氟。将离心管在室温下孵育 10 分钟后，置于翻转摇床中，在 4 摄氏度继续孵育 1 小时。接着，将超声破碎仪的 6 毫米实心探头直接插入细胞悬液中。

使用超声波破碎仪以40%的振幅进行三次、每次一分钟的脉冲处理，工作周期为开启1秒、关闭1秒，机械性裂解细菌细胞。每次脉冲之间间隔1分钟进行冷却。离心后，将澄清的裂解液置于冰上保存，同时准备使用预装的一次性标签蛋白纯化柱（专为重力流操作设计）进行固定化金属亲和层析。

将镍-次氮基三乙酸柱固定在金属支架或合适的柱固定架上，然后完全排出柱中的保存缓冲液。用含有20毫摩尔咪唑的PBS结合缓冲液10毫升平衡柱子。

让缓冲液依靠重力流过。逐渐加入约 30 毫升澄清的细菌裂解液至已平衡的层析柱中。让其依靠重力流过，弃去流出液。

然后用含有20毫摩尔咪唑的PBS结合缓冲液，分两次每次10毫升洗涤层析柱。用含有500毫摩尔咪唑的PBS洗脱缓冲液2毫升洗脱结合的纳米抗体，收集至2毫升微量离心管中。用5毫升PBS冲洗5次，对置于50毫升试管接头中的脱盐柱进行平衡。

让缓冲液完全进入填装好的树脂中，然后弃去流出液。最后一次冲洗后，将柱子在1000 × g离心两分钟。弃去流出液后，将柱子连同其适配器转移至新的50毫升收集管中。

将两毫升洗脱的功能化纳米抗体上样至预先平衡的脱盐柱中。随后在1000 × g下再次离心两分钟，收集洗脱液，然后验证VHH-mCherry的表达与纯度。启动自动活细胞成像系统的软件。

将ibidi显微镜腔室转移至显微镜载物台上。使用EGFP和mCherry的激发滤光片和发射滤光片设置两个成像通道。选择较短的曝光时间和较低的照明强度，以避免光漂白。

所有实验均保持设置不变。不同报告基因间的设置可能有所差异。对于每种条件，需在点列表中存储包含三到四个处于焦平面上的细胞的10个不同视野的坐标。

然后在添加VHH-mCherry之前，对点列表中的每个位置拍摄单张快照，作为参考图像。为启动内吞作用，轻轻向每个孔中加入350 µL预热的VHH-mCherry溶液，同时尽量减少对单层细胞的扰动。随后开始图像采集。

在保持37摄氏度和5%二氧化碳的条件下，以32秒间隔进行100帧的时间序列图像采集。为分析VHH-mCherry的内吞摄取，将时间序列图像集载入图像分析软件，应用分割和追踪工具，对不同感兴趣区域随时间变化的内化荧光进行定量分析。

所有功能化的纳米抗体变体均被高产量、高纯度地纯化，仅 VHH-mCherry 出现轻微的蛋白水解降解。通过表位特异性的免疫印迹检测确认，VHH-mCherry 的降解产物为单独的 VHH-mCherry 结构域。在无 BirA 的情况下，每轮制备可回收约 20 毫克的 VHH-mCherry。

通过链霉亲和素琼脂糖沉淀纳米抗体与BSA的混合物，证实了生物素化。在HeLa细胞中表达的EGFP标记融合蛋白表现出与其内源对应物一致的亚细胞定位模式，包括EGFP-CDMPR和EGFP-CIMPR的核周定位。EGFP-TGN46特异性定位于核周区域，而TfR-EGFP则定位于细胞外周。

VHH-mCherry 实现了对表达 EGFP-CDMPR 的细胞中内吞运输过程的活细胞可视化，显示在 60 分钟内共定位信号逐渐增强。VHH-mCherry 在表达 EGFP-CDMPR 的细胞中的摄取约在 43 分钟后达到平台期，半衰期为 9 分钟。在表达 TfR-EGFP 的细胞中，VHH-mCherry 在细胞内迅速积累，半衰期为 4 分钟，20 分钟后达到饱和。

我们已建立了一套基于纳米抗体的多功能工具包，用于分析任何跨膜蛋白从细胞表面的转运过程。我们利用荧光标记的纳米抗体对细胞表面的货物蛋白进行标记，随后通过活细胞显微镜研究其内吞运输过程。通过这种基于纳米抗体的活细胞成像方法，我们旨在揭示驱动细胞表面至反式高尔基体网络货物运输的分子通路。