Name: 在培养细胞中使用功能化纳米抗体进行内吞转运的活细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 了解利用功能化纳米抗体在HeLa细胞中进行内吞转运活细胞成像的方法。该技术可实时追踪跨膜蛋白从细胞表面到反式高尔基体网络的运输动态，为研究膜蛋白转运机制提供高效工具。

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本工作由巴塞尔大学资助。我们感谢荣誉教授 Martin Spiess 博士在图示设计与绘制方面的工作，感谢生物中心成像核心设施（IMCF）提供的支持，以及《美国国家科学院院刊》（PNAS）授予的 reprint 许可。

作者无任何利益冲突需要披露。

纳米抗体是一类快速兴起的蛋白质结合支架，相较于传统抗体具有诸多优势：分子量小、高度稳定、呈单体形式、不发生交联、不含二硫键，并且可筛选出高亲和力结合特性24。在我们之前的研究中，开发并应用了通过细菌表达产生的功能化纳米抗体，用于标记细胞表面暴露的蛋白质，并监测其向细胞内不同区室的转运过程，尤其聚焦于逆向转运至反式高尔基网络（TGN）的过程17。我们采用了一种抗GFP纳米抗体以确保通用性，从而能够靶向带有细胞外GFP、YFP或mCerulean标签的融合蛋白——这些荧光标签广泛可用，且通常已有充分表征。通过将抗GFP纳米抗体功能化修饰为mCherry、APEX2或酪氨酸硫酸化基序，我们实现了对固定细胞和活细胞成像中货物摄取的可视化，可在超微结构水平上定位逆向转运区室，执行靶向区室消融，并定量评估向TGN的转运动力学。该方法的一个局限性在于需要预先对目标细胞系进行遗传改造——即通过稳定过表达或内源性标记——才能有效使用功能化的抗GFP纳米抗体。然而，该策略可轻松扩展至日益增多的针对未标记内源性靶蛋白的纳米抗体，这些纳米抗体可通过动物免疫或利用核糖体展示或噬菌体展示技术从合成VHH文库中进行in vitro筛选获得34。此外，近年来已开发出针对常用表位标签（如mCherry、V5或ALFA）的纳米抗体35,36,37。值得注意的是，我们最近利用一种具备硫酸化能力的抗mCherry纳米抗体，通过快速功能性失活，研究了GGA2缺失的HeLa细胞中CDMPR的逆向运输过程28。小分子表位标签的优势在于能够保持靶蛋白的天然构象和功能，因其较少干扰关键结构域。识别这些紧凑表位（例如ALFA、V5）的纳米抗体可无缝整合到功能化纳米抗体工具包中，从而拓展其在研究内吞及逆向转运机制中的应用范围。
在本研究中，我们展示了VHH-mCherry在活细胞成像实验中的应用。通过使用EGFP-CDMPR和TfR-EGFP作为报告蛋白，我们能够可视化受体特异性的内吞摄取过程及其向稳态分布的动态进展。对这些报告蛋白从质膜到各自细胞内区室的转运过程进行定量分析，结果显示其动力学特征与先前研究中生化实验所得结果一致，相关数据见于之前研究的图217。我们发现，EGFP-CDMPR的表观半衰期明显长于TfR-EGFP（分别为约9分钟和约4分钟），其信号分别在约43分钟和20分钟后达到饱和。这些定量结果与已发表的关于MPR和TfR转运动力学的研究数据高度一致38,39,40。值得注意的是，VHH-mCherry构建体已引起研究领域的广泛关注，这一点从Addgene平台上的大量分发请求中可见一斑，并且该工具已在多项独立研究中成功应用28,41,42,43,44。
根据显微镜配置或实验需求，mCherry标记的抗GFP纳米抗体可能并非始终最优选择。在这些情况下，使用其他荧光染料或荧光蛋白变体可能在与GFP报告细胞系联用时提供更合适的光谱特性。为解决这一问题，我们构建了一个功能化纳米抗体文库，其中包含多种荧光蛋白，如mTagBFP2、mNeptune2.5、mCardinal2、TagRFP657和iRFP670（243764-68）。这些额外的纳米抗体构建体将通过Addgene提供。使用光谱特性不同的荧光染料可实现激发光与发射光信号的清晰分离，从而在光谱重叠最小的情况下，实现最多三个荧光通道的活细胞实时成像。
尽管监测内吞作用达到稳态看似直接，但追踪蛋白质逆行运输至反式高尔基网络（TGN）则带来了更大的实验挑战。除了VHH-mCherry和一种GFP标记的报告蛋白外，还需要一种额外的荧光或可偶联染料的TGN驻留标记物，以实现可视化与定量分析。然而，某些高尔基体驻留蛋白会部分泄漏至细胞表面，这种现象在细胞内运输通路受到干扰时可能进一步加剧，例如实验操作中对运输机制组分的干预即可能引发此类问题。例如，TGN46尽管发挥作为介导特定分泌性货物从TGN向细胞表面运输的载体受体功能，仍常被用作高尔基体驻留标记物16,45。类似地，诸如β-1,4-半乳糖基转移酶等糖基转移酶也已在质膜上被检测到41。尽管这些蛋白可循环至细胞表面，其主要的稳态定位仍保留在TGN内。将此类标记物与光谱上可区分的荧光蛋白或可兼容染料的标签（如SNAP、Halo等）融合，并与GFP标记的跨膜报告蛋白稳定共表达，即可实现对TGN到达过程的定量活细胞成像。该过程可参照上述实验流程进行测量，通过量化mCherry信号在对应于高尔基体驻留融合蛋白的荧光通道中的积累来进行分析。目前研究固定或活细胞中逆行运输的常用策略，通常依赖于嵌合受体构建体与IgG抗体（如CD8）的联合使用46,47。然而，由于传统IgG在细胞表面标记时具有双价性，其内在的交联风险可能显著改变标记蛋白的细胞内命运，通常在内吞后将其导向溶酶体降解48,49。相比之下，纳米抗体（nanobody）因其单价性质和1:1的结合化学计量比，不会诱导交联，从而保持了目标蛋白的生理运输路径。这使得基于纳米抗体的方法在研究真实的逆行运输动力学时尤为有价值，避免了人为引入的运输路径偏差。
进行活细胞成像时，为使本实验方案达到最佳效果，需仔细滴定纳米抗体浓度，因为过量的纳米抗体会导致培养基中未结合的纳米抗体产生较高的背景荧光。此外，在滴定过程中必须考虑不同GFP报告细胞系表达水平的差异，以确保定量比较的准确性。在纳米抗体的表达过程中，大肠杆菌（E. coli）的低温诱导至关重要，有助于mCherry结构域的正确折叠。较高的诱导温度通常会导致蛋白错误折叠或降解，因此不推荐使用。
该方案的成功关键取决于以下三个方面：首先，功能性纳米抗体构建体的高产量表达和高纯度，以确保标记的一致性并最大限度减少背景信号；其次，使用经过充分表征的、稳定表达GFP标记报告蛋白且该蛋白定位于细胞表面的细胞系，以重现生理状态下的运输途径；第三，荧光显微镜系统的优化操作与配置，包括成像参数和光谱分离，以实现对货物运输动态的准确定性和定量分析。
本文所述方法与实验方案以使用mCherry标记的抗GFP纳米抗体为核心，能够在培养的哺乳动物细胞中对货物蛋白从细胞表面到内吞区室的转运过程进行定性和定量追踪。当与荧光标记的高尔基体定位标志物共表达时，该方法还可用于分析逆行运输通路。因此，该工具为监测细胞表面跨膜蛋白和受体的细胞内运输提供了强有力的策略，而这些蛋白和受体由于缺乏特异性配体或兼容的单体结合试剂，此前难以进行标记。

受体及其他跨膜（TM）蛋白从质膜内吞至各种细胞内区室，对于维持膜稳态至关重要1,2。通过网格蛋白依赖性或非依赖性内吞作用被内化后，这些蛋白货物首先进入早期内体，随后被进一步分选至内体-溶酶体系统、循环返回质膜，或逆行转运至反式高尔基网络（TGN）3,4,5。从早期内体和/或细胞表面循环返回TGN是多种跨膜货物受体功能循环的一部分，例如阳离子依赖性和非依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CDMPR和CIMPR），它们将新合成的溶酶体水解酶从TGN递送至晚期内体和溶酶体6,7,8；Wntless（WLS）将Wnt配体转运至细胞表面9,10,11,12；TGN46则介导可溶性分泌蛋白货物（包括胰腺上调因子（PAUF）及其他CARTS货物）从TGN的转运13,14,15,16。尽管上述所有货物受体均需经过TGN以装载新的客户蛋白，但转铁蛋白受体（TfR）在内化铁结合型转铁蛋白后则被排除在高尔基体逆行路径之外17,18,19,20,21。
为了研究内吞作用和逆向运输过程，我们先前建立了一种基于纳米抗体的工具包，旨在对从细胞表面到细胞内区室的货物蛋白进行标记和示踪17。纳米抗体是一类新型的蛋白质结合分子，来源于天然存在于骆驼科动物和软骨鱼类中的同源二聚体仅重链抗体（hcAbs）22,23。它们代表了hcAbs的重链可变区（VHH），相较于传统抗体（如IgG）具有多种优势：呈单体形式、分子量小（约15 kDa）、高度可溶、不含二硫键、可在细菌中表达，并且可通过筛选获得高亲和力结合能力24。为了增强该纳米抗体工具包的多功能性和广泛应用性，我们采用功能化的抗GFP纳米抗体，对胞外域或管腔域带有GFP标签的蛋白质进行细胞表面标记与追踪。通过将纳米抗体与mCherry、抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2）或酪氨酸硫酸化序列进行重组偶联，可利用固定细胞和活细胞荧光显微镜、电子显微镜或基于放射自显影的生化检测方法，分析真正的跨膜货物蛋白的逆向运输过程。由于酪氨酸硫酸化是由酪氨酸蛋白硫酸转移酶TPST1和TPST2催化的翻译后修饰，且该修饰仅发生在反式高尔基体/反式高尔基网络（TGN）中，因此该策略能够直接评估货物蛋白从细胞表面至高尔基体区室的运输动态和动力学特征25,26,27。最近，我们进一步扩展了此类功能化蛋白结合分子的种类，新增了衍生化的抗mCherry纳米抗体。这些试剂在通过生化分析解析依赖于分子机器的甘露糖-6-磷酸受体（MPRs）尤其是CDMPR向TGN运输通路方面发挥了关键作用17,28。
尽管之前的研究主要关注通过放射自显影技术生化评估经酪氨酸硫酸化序列修饰的纳米抗体在反式高尔基网络（TGN）中的定位19，本文方法学文章则描述了荧光标记的功能化纳米抗体（VHH-mCherry）及报告细胞系的构建，用于活细胞成像中内吞运输过程的可视化。结合另一种定位于高尔基体的荧光报告蛋白，本方案可进一步优化，形成一套稳健的工作流程，用于定量分析选定货物蛋白从内体到反式高尔基网络的活细胞运输过程。
在应用本方案之前，研究人员应确保目标蛋白以GFP标签融合构建体的形式表达，通常通过标准的分子克隆方法获得。功能化纳米抗体可在细菌中高效表达，产量足以满足表面标记实验的需求，工作浓度在低纳摩尔范围内即可适用于大多数活细胞成像分析。用户还应注意，不同货物蛋白的运输动力学会存在差异，可能需要调整标记时间或成像频率，以实现对内吞作用或内体到反式高尔基网络（TGN）运输过程的最佳可视化。

<table><tbody><tr><td>抗GFP抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>产品由 Sigma-Aldrich 销售，但由 Roche 生产</td></tr><tr><td>100毫米细胞培养皿</td><td>TPP</td><td>TPP93100</td><td></td></tr><tr><td>抗肌动蛋白抗体</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>抗HA抗体</td><td>从实验室</td><td>由12CA5杂交瘤制备</td><td></td></tr><tr><td>抗His6抗体</td><td>Bethyl Laboratories&amp;nbsp;</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>抗T7抗体&amp;nbsp;</td><td>Bethyl Laboratories&amp;nbsp;</td><td>A190-117A</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) 感受态细胞&amp;nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>默克密理博</td><td>102382</td><td>溶于无菌水，储存液浓度为 1 M</td></tr><tr><td>羧苄西林二钠盐</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>溶于无菌水，储存液浓度为100 mg/mL</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝R（Brilliant Blue）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>溶于无菌的500 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;或 DMSO</td></tr><tr><td>一次性PD10脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX-I</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，无谷氨酰胺，无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>溶于无菌水</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;无钙杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/毫克&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S，PES，孔径&amp;ouml;&amp;szlig;e：0.45 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD 转染试剂</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（No. 1.5H）</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>His缓冲液试剂盒</td><td>Cytvia</td><td>11003400</td><td></td></tr><tr><td>His GraviTrap 柱</td><td>Cytvia</td><td>11003399</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &amp;micro;-滑动4孔板，ibiTreat</td><td>80426-IBI</td><td>ibidi</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>溶于无菌水，贮存液浓度为 1 M</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>溶于无菌水，储存液浓度为100 mg/mL</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>产品由 Sigma-Aldrich 销售，但由 Roche 生产</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>默克密理博</td><td>105833</td><td>溶于无菌水，储备液浓度为 1 M</td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX 凝胶，4-20%，15 孔</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>改良的HeLa京都细胞</td><td>从实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB5-alpha 感受态细胞&amp;nbsp;大肠杆菌</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus，10次制备</td><td>Macherey-Nagel&amp;nbsp;</td><td>740412.1</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>生物概念&amp;nbsp;</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>溶于40% DMSO和60%异丙醇中，储存液浓度为500 mM</td></tr><tr><td>Phoenix ampho细胞系</td><td>诺兰实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene（六亚甲基溴化铵）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>默克密理博</td><td>106404</td><td>溶于无菌水，贮存液浓度为 5 M</td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 小型装</td><td>Bio-Rad</td><td>1704158</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr></tbody></table>

利用功能化纳米抗体对培养细胞进行内吞运输的活细胞成像

Live-cell Imaging of Endocytic Transport using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

受体及其他跨膜蛋白从细胞表面向内体及更远区室的内吞作用，对于细胞稳态、生理功能和正常运作至关重要。为了研究内吞摄取及逆行性蛋白运输，我们建立了一套多功能工具包，包含经过功能修饰的纳米抗体，可用于通过固定细胞成像、活细胞成像、电子显微镜以及结合放射自显影的凝胶电泳技术，监测从细胞表面至反式高尔基网络（TGN）的运输过程。我们开发了靶向绿色荧光蛋白（GFP）或mCherry的衍生化纳米抗体——这些为单体、不发生交联、高亲和力的蛋白质结合剂，可直接添加至表达带有相应胞外荧光标签的目标膜蛋白的细胞系中。当这些纳米抗体结合于GFP或mCherry标记的跨膜报告蛋白后，会随着报告蛋白自身的内源分选通路被特异性地内化并同步运输。这些纳米抗体已被偶联不同的功能分子：通过连接特定荧光染料，实现荧光显微镜和活细胞成像下的逆行运输追踪；连接抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2），用于电子显微镜下解析超微结构定位；连接酪氨酸硫酸化基序，以定量评估到达TGN的动力学过程。在本方法学研究中，我们详细描述了功能化纳米抗体的细菌表达与纯化通用方案，以及稳定表达GFP报告蛋白细胞系的构建方法。我们以一种经mCherry修饰的抗GFP纳米抗体（VHH-mCherry）为例，展示该方法在活细胞成像中的应用，用于分析转铁蛋白受体（TfR）和依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CDMPR）的内吞摄取过程。

为了研究蛋白质向不同细胞内区室的逆向转运过程，我们近期建立了一种基于抗GFP纳米抗体的工具，用于对来自细胞表面的重组融合蛋白进行标记和追踪17。本文描述了此类修饰型纳米抗体的细菌表达生产方法，并展示了其在活细胞成像中监测内吞摄取过程的应用价值。结合一种定位于高尔基体的荧光报告分子，该实验方案提供了一个可靠的平台，可对特定货物蛋白向反式高尔基网络（TGN）的逆向运输过程进行实时定量研究。
我们利用标准的分子克隆技术，构建了一系列具有共同模块化结构的不同功能化抗GFP纳米抗体17。尽管本研究主要关注荧光变体VHH-mCherry，但我们还提供了其他衍生的纳米抗体，以展示该工具集的多功能性，并突出其在未来应用中的潜力。我们最基础的构建体VHH-std（std代表标准）包含VHH结构域、用于基于抗体检测的T7和HA表位、用于纯化的C端六组氨酸（His6）标签，以及一段生物素受体肽（BAP）序列，以实现酶促生物素标记和高亲和力链霉亲和素介导的pull-down实验（图1A）。基于这一核心设计，我们开发了多种纳米抗体衍生物，以促进通过生化分析、固定细胞与活细胞成像以及电子显微镜对内吞作用和逆向转运过程的研究。
为了对内吞运输进行活细胞成像，我们设计了一种带有荧光团的抗GFP纳米抗体，该荧光团的激发和发射光谱与GFP明显不同，从而确保在荧光显微镜下实现最佳的光谱分离。根据其在IPTG诱导的E. coli中优异的折叠特性以及已被充分表征的光物理性质，我们选择mCherry作为首选的荧光标签。其他红移荧光团（如单体红色荧光蛋白mRFP）在原则上也可作为替代方案，但mCherry在此系统中表现出尤为优异的稳定性和有效性。
除VHH-mCherry外，其他功能化纳米抗体具有怎样的潜力？为了研究蛋白质从质膜到反式高尔基网络（TGN）的转运过程，我们利用了TPSTs的区室特异性定位特性，这些酶仅存在于TGN和反式高尔基体囊膜中。为此，我们将源自大鼠胆囊收缩素原的串联酪氨酸硫酸化基序（2xTS）引入VHH-std中进行改造29，从而实现对货物到达这些区室的生化检测。虽然将 VHH-std 与 mCherry 融合可通过对固定细胞或活细胞成像直接观察逆向运输过程，但通过与 APEX2 等过氧化物酶功能化结合30 可通过透射电镜实现超微结构定位、靶向细胞化学消融或基于邻近性的生物素化检测。此外，在纳米抗体支架中引入烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点，可提供一种生化手段以区分内化与细胞表面结合的纳米抗体图1A我们先前使用 VHH-tev 构建体来监测纳米抗体结合的 EGFP-CDMPR 和 TfR-EGFP 的再循环动力学17通过在细胞外施加重组TEV蛋白酶，可轻易检测到纳米抗体标记的受体在细胞表面的重新出现，导致纳米抗体C端表位盒的特异性丢失。类似地，在本研究中所呈现的mCherry功能化的纳米抗体VHH-mCherry中引入TEV切割位点，可实现通过活细胞成像对EGFP报告分子再循环的动态评估。通过SpeI和EcoRI限制性酶切位点，将所需插入片段亚克隆至VHH-std骨架中，可轻松实现以其他蛋白结构域（如额外的荧光团、酶标签或翻译后修饰序列基序）对纳米抗体进行功能化修饰。原始研究中使用的所有功能化抗GFP纳米抗体构建体17 已存入Addgene供公众分发。
使用上述方案，本文所示的所有纳米抗体变体均被高效、高纯度地纯化（图1B）。只有mCherry融合蛋白在纯化后表现出轻微的蛋白结构域蛋白水解剪切（图1B，第5泳道）。根据其表观分子量并通过表位特异性免疫印迹检测验证，这两种观察到的降解产物很可能对应于单独的VHH和mCherry结构域（图1C）。在未共表达BirA的情况下，VHH-mCherry的产量通常约为每次制备20 mg。根据我们的经验，共表达BirA会使纳米抗体的产量稳定减少约1/3。rd 至1/2。由于与BSA以1:1混合的纳米抗体可被链霉亲和素-琼脂糖完全回收，表明生物素化反应基本完全（图1D).
为了评估该纳米抗体工具包在研究内吞运输中的适用性，我们构建了稳定表达EGFP标记的细胞表面受体蛋白的HeLa细胞系，这些受体具有不同的细胞内运输途径。其中包括TfR，它在质膜与早期内体（分选和再循环内体）之间循环；TGN46，通过早期内体在质膜与反式高尔基网络（TGN）之间运输；以及两种MPR（CDMPR和CIMPR），它们在TGN、质膜以及早期内体和晚期内体之间穿梭17。EGFP被融合至各受体的胞外结构域——具体而言，对于CDMPR、CIMPR和TGN46，EGFP被插入信号肽与受体序列之间；而对于TfR，则融合在其C末端。该设计保留了天然的胞质结构域，确保所有已知的分选信号保持完整，同时使EGFP标签可被胞外抗GFP纳米抗体识别结合（图1E）。对于胞外结构域异常大的CIMPR，采用了截短版本，这与先前研究结果一致，表明此类截短仍可维持正常的运输行为31,32。
通过逆转录病毒转导建立稳定细胞系，随后进行荧光激活细胞分选（FACS），以分离表达水平适中且可比的均一细胞群体。值得注意的是，EGFP-CDMPR在免疫印迹中始终呈现为双条带，与其内源性对应物相似33，提示存在异质性糖基化。为了评估EGFP融合蛋白是否能够重现内源性蛋白的稳态定位和表达模式，将稳定表达的细胞与亲本HeLa细胞共培养，并通过共聚焦荧光显微镜进行分析（图2B）。EGFP信号忠实地反映了相应内源性蛋白的分布。如预期所示，CDMPR、CIMPR及其EGFP标记版本主要定位于核周区域——对应反式高尔基网络（TGN）和晚期内体区室——并在外周内体中也有额外标记。内源性和EGFP标记的TGN46几乎完全定位于核周TGN，而TfR及TfR-EGFP则表现出典型的早期内体分布特征，具有明显的外周分选结构和核周再循环内体。尽管所用抗体可同时检测内源性和EGFP标记的蛋白形式（CIMPR除外），但在表达融合蛋白的细胞中，整体染色强度并未显著增强，表明EGFP构建体并未显著过表达。我们在图2B中纳入了EGFP-TGN46和EGFP-CIMPR，以便与EGFP-CDMPR和TfR-EGFP进行直接比较。细胞固定和荧光显微成像所用的实验方案已在先前的研究中描述17,19。
利用VHH-mCherry，可通过活细胞成像监测EGFP标记的报告蛋白的内吞运输过程。为此，我们以表达EGFP-CDMPR和TfR-EGFP的细胞为例进行实验。在向培养基中加入VHH-mCherry后，使用倒置宽场荧光显微镜对细胞进行时间序列成像（视频1和视频2）。不同时间点的静态图像如图3所示。通过测量mCherry通道信号、扣除自发荧光背景，并将结果归一化至EGFP信号，以消除由于标记区室移动或焦平面轻微偏移所引起的信号波动，从而对摄取过程进行定量分析。在25 nM浓度下，培养基中VHH-mCherry的荧光信号可忽略不计，不会干扰测量结果。对报告蛋白从细胞表面运输至其细胞内区室并达到稳态分布的动力学分析，所得结果与先前发表文献中图2所示的生化实验结果一致17，其中EGFP-CDMPR的表观摄取半衰期约为9分钟，TfR-EGFP约为4分钟，分别在约43分钟和约20分钟后达到饱和。这些数值与使用免疫印迹法进行的生化摄取实验所得结果具有可比性17。原则上，也可分析纳米抗体逆行运输至特定亚细胞区域（例如MPR浓度最高的核周区域）的动力学。然而，核周区域不仅包含高尔基体/反式高尔基网络（TGN），还富集了晚期内体和循环内体。因此，纳米抗体进入核周区域的动力学特异性不足以用于分析向特定细胞器的逆行运输。为了更可靠地评估质膜到TGN的运输过程，需要稳定共表达另一种荧光蛋白标记的TGN驻留跨膜蛋白，且确保其荧光特性与GFP报告蛋白无光谱重叠。通过引入这一额外标记物，可实现对报告蛋白导入的VHH-mCherry的检测，其原理类似于此前报道的由TPSTs介导的酪氨酸硫酸化过程19。
<img alt="Protein analysis via SDS-PAGE and Western blot; schematic shows VHH variants tagging; electrophoresis results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 1"> 
图1设计与制备用于追踪EGFP标记细胞表面蛋白的衍生化纳米抗体。 (A) 衍生化纳米抗体的示意图概述。标准纳米抗体构建体包含一个特异性识别GFP的VHH结构域、T7和HA表位标签、生物素受体肽（BAP）以及C端六聚组氨酸（His6) 标签用于纯化。其他纳米抗体变体包括含有串联酪氨酸硫酸化位点（2xTS）、工程化过氧化物酶 APEX2 或荧光蛋白 mCherry 的修饰。比例尺表示氨基酸（aa）长度。B细菌表达并经亲和纯化后的纳米抗体（20–50 µg）通过梯度SDS-PAGE分析，并经考马斯亮蓝染色显影。左侧标注了分子量标准（单位为kDa）。仅在VHH-mCherry中观察到轻微的蛋白水解剪切，可能发生在VHH与mCherry结构域之间。C) 使用抗 T7、HA 或 His 抗体对纳米抗体样品（10 ng）进行免疫印迹分析6 表位，或通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）检测以评估生物素化情况。D通过将纳米抗体与BSA以1:1比例孵育，随后进行链霉亲和素-琼脂糖沉淀、离心收集沉淀物并洗涤珠子，评估纳米抗体生物素化的程度。取等体积的上清液（S）和珠子结合组分（B），经SDS-PAGE分离及考马斯亮蓝染色分析。纳米抗体在珠子结合组分中的定量回收表明生物素化完全。结合组分中同时出现VHH和mCherry片段提示存在部分降解，可能发生在SDS-PAGE样品制备过程中。第2道与第3道之间的白色线条表示删除了两个无关的泳道。该图已从原文修改而来17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="EGFP-tagged protein localization; microscopy and Western blot analysis; protein expression; diagram and experiment results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 2"> 
图2荧光标记的EGFP标签货物受体的表达及细胞内定位。 (AEGFP融合构建体的示意图。源自分泌型跨膜蛋白的序列以黑色表示，N端信号肽和内部跨膜结构域以黄色标出，EGFP部分以绿色表示。CDMPR、TfR和TGN46构建了全长融合体，而CIMPR则采用已充分表征的截短变体，以维持正常的运输行为。比例尺表示氨基酸（aa）长度。EGFP-CDMPR和TfR-EGFP此前已有描述17. (B为了评估亚细胞定位，将稳定表达EGFP融合蛋白的HeLa细胞与亲本HeLa细胞共培养，并通过荧光显微镜进行分析。比例尺表示10 µm。C) 稳定表达EGFP标记报告蛋白的HeLa细胞经裂解后，提取蛋白并进行SDS-PAGE电泳，随后使用抗GFP和肌动蛋白（actin）抗体进行免疫印迹检测。右侧所示为分子量标记（单位：kDa）。该图已修改自17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="EGFP-CDMPR 和 TfR-EGFP 荧光显微镜、时间推移蛋白共定位、强度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 3"> 
图 3：EGFP-CDMPR 和 TfR-EGFP 介导的纳米抗体胞吞摄取动力学的活细胞成像。在含 25 nM VHH-mCherry 的无酚红完全培养基中，于 37 °C 条件下孵育稳定表达（A）EGFP-CDMPR 或（B）TfR-EGFP 的 HeLa 细胞后，进行活细胞成像。使用半自动宽场荧光显微镜，以 36 秒为间隔，在 GFP 和 mCherry 通道中对细胞进行成像。图中显示了代表性合并静态图像，并在下方展示了各通道中核周区域的放大视图（放大倍数：2.2 倍）。（比例尺：10 µm。）另见 视频 1 和 视频 2。对（C）EGFP-CDMPR 和（D）TfR-EGFP 的纳米抗体摄取动力学进行定量分析，数据来自三次独立实验，每次实验捕获约 40 个单个细胞。为校正细胞器运动和焦平面变化的影响，将 mCherry 荧光强度相对于 GFP 信号进行归一化（norm），并以三次实验中所有细胞的均值 ± 标准差（SD）形式绘图。平均最大摄取信号被归一化至 1。对每个细胞的摄取动力学单独采用一级动力学模型进行拟合，图中曲线表示由相应速率常数的均值计算得到的平均拟合曲线。本图改编自17。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
视频 1：EGFP-CDMPR 介导的 mCherry 纳米抗体摄取的活细胞成像。 稳定表达 EGFP-CDMPR 的 HeLa 细胞在含有 25 nM VHH-mCherry 的完全培养基中于 37 °C 孵育，并以每 36 秒一次的间隔在 EGFP 和 mCherry 荧光通道中进行成像。该视频以每秒 5 帧的速度播放，相当于每秒压缩 3 分钟的真实时间。本视频改编自17。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%201.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：TfR-EGFP 摄取 mCherry 纳米抗体的活细胞成像。 稳定表达 TfR-EGFP 的 HeLa 细胞在含 25 nM VHH-mCherry 的完全培养基中于 37 °C 培养，并以 36 秒间隔对 EGFP 和 mCherry 荧光进行成像。该视频以每秒 5 帧的速度生成，对应的时间压缩速率为 3 分钟/秒。本视频改编自17。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%202.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

蛋白质从质膜到反式高尔基网络的内吞和逆向运输对于维持膜稳态和调控信号传导至关重要。本文介绍一种利用衍生化抗GFP纳米抗体，通过活细胞显微镜在HeLa细胞中对跨膜货物蛋白的内吞运输进行成像和定量分析的方法。

受体及其他跨膜蛋白从细胞表面向内体及更远区室的内吞作用，对于稳态、生理功能及……至关重要。

我们正在研究跨膜蛋白的内吞作用和逆向运输，以及介导这些运输过程的分子机制。为了研究从细胞表面出发的蛋白质运输，通常会使用传统抗体，但这类抗体可能引起交联并导致蛋白被靶向溶酶体。首先，获取经 VHH-mCherry 转化的大肠杆菌（Escherichia coli）菌体沉淀。向细菌细胞沉淀中加入 30 毫升含有 20 毫摩尔咪唑的 PBS 冰冷结合缓冲液。用移液器上下吹打，充分重悬沉淀。将重悬后的混合液转移至已标记的 50 毫升离心管中。向重悬的细胞中加入终浓度为 200 微克/毫升的溶菌酶、20 微克/毫升的 DNase I、1 毫摩尔的氯化镁和 1 毫摩尔的苯甲基磺酰氟。将离心管在室温下孵育 10 分钟后，置于翻转摇床中，在 4 摄氏度继续孵育 1 小时。接着，将超声破碎仪的 6 毫米实心探头直接插入细胞悬液中。使用超声波破碎仪以40%的振幅进行三次、每次一分钟的脉冲处理，工作周期为开启1秒、关闭1秒，机械性裂解细菌细胞。每次脉冲之间间隔1分钟进行冷却。离心后，将澄清的裂解液置于冰上保存，同时准备使用预装的一次性标签蛋白纯化柱（专为重力流操作设计）进行固定化金属亲和层析。将镍-次氮基三乙酸柱固定在金属支架或合适的柱固定架上，然后完全排出柱中的保存缓冲液。用含有20毫摩尔咪唑的PBS结合缓冲液10毫升平衡柱子。让缓冲液依靠重力流过。逐渐加入约 30 毫升澄清的细菌裂解液至已平衡的层析柱中。让其依靠重力流过，弃去流出液。然后用含有20毫摩尔咪唑的PBS结合缓冲液，分两次每次10毫升洗涤层析柱。用含有500毫摩尔咪唑的PBS洗脱缓冲液2毫升洗脱结合的纳米抗体，收集至2毫升微量离心管中。用5毫升PBS冲洗5次，对置于50毫升试管接头中的脱盐柱进行平衡。让缓冲液完全进入填装好的树脂中，然后弃去流出液。最后一次冲洗后，将柱子在1000 × g离心两分钟。弃去流出液后，将柱子连同其适配器转移至新的50毫升收集管中。将两毫升洗脱的功能化纳米抗体上样至预先平衡的脱盐柱中。随后在1000 × g下再次离心两分钟，收集洗脱液，然后验证VHH-mCherry的表达与纯度。启动自动活细胞成像系统的软件。将ibidi显微镜腔室转移至显微镜载物台上。使用EGFP和mCherry的激发滤光片和发射滤光片设置两个成像通道。选择较短的曝光时间和较低的照明强度，以避免光漂白。所有实验均保持设置不变。不同报告基因间的设置可能有所差异。对于每种条件，需在点列表中存储包含三到四个处于焦平面上的细胞的10个不同视野的坐标。然后在添加VHH-mCherry之前，对点列表中的每个位置拍摄单张快照，作为参考图像。为启动内吞作用，轻轻向每个孔中加入350 µL预热的VHH-mCherry溶液，同时尽量减少对单层细胞的扰动。随后开始图像采集。 在保持37摄氏度和5%二氧化碳的条件下，以32秒间隔进行100帧的时间序列图像采集。为分析VHH-mCherry的内吞摄取，将时间序列图像集载入图像分析软件，应用分割和追踪工具，对不同感兴趣区域随时间变化的内化荧光进行定量分析。所有功能化的纳米抗体变体均被高产量、高纯度地纯化，仅 VHH-mCherry 出现轻微的蛋白水解降解。通过表位特异性的免疫印迹检测确认，VHH-mCherry 的降解产物为单独的 VHH-mCherry 结构域。在无 BirA 的情况下，每轮制备可回收约 20 毫克的 VHH-mCherry。通过链霉亲和素琼脂糖沉淀纳米抗体与BSA的混合物，证实了生物素化。在HeLa细胞中表达的EGFP标记融合蛋白表现出与其内源对应物一致的亚细胞定位模式，包括EGFP-CDMPR和EGFP-CIMPR的核周定位。EGFP-TGN46特异性定位于核周区域，而TfR-EGFP则定位于细胞外周。VHH-mCherry 实现了对表达 EGFP-CDMPR 的细胞中内吞运输过程的活细胞可视化，显示在 60 分钟内共定位信号逐渐增强。VHH-mCherry 在表达 EGFP-CDMPR 的细胞中的摄取约在 43 分钟后达到平台期，半衰期为 9 分钟。在表达 TfR-EGFP 的细胞中，VHH-mCherry 在细胞内迅速积累，半衰期为 4 分钟，20 分钟后达到饱和。我们已建立了一套基于纳米抗体的多功能工具包，用于分析任何跨膜蛋白从细胞表面的转运过程。我们利用荧光标记的纳米抗体对细胞表面的货物蛋白进行标记，随后通过活细胞显微镜研究其内吞运输过程。通过这种基于纳米抗体的活细胞成像方法，我们旨在揭示驱动细胞表面至反式高尔基体网络货物运输的分子通路。

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科研

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生物化学

在培养细胞中使用功能化纳米抗体进行内吞转运的活细胞成像

活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。...

活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

来源：Zhang, Y., 等. 荧光纳米颗粒在研究胞内细菌介导的内体-溶酶体系统重塑中的应用. J. Vis. Exp.

纳米颗粒介导的细菌感染细胞中内体-溶酶体系统重塑的可视化研究

本视频展示了一种研究功能化纳米抗体摄取及其逆行运输的方法，以了解其细胞内转运途径。通过引入放射性标记的硫酸盐，并结合分离与检测技术，该方法可用于研究货物蛋白的内吞摄取及其向反式高尔基网络的运输过程。...

利用功能化纳米抗体监测GFP标记的膜蛋白到达反式高尔基体网络的过程

本视频展示了如何用特定的荧光蛋白标记神经元囊泡，以观察其运动。首先，将编码荧光蛋白的质粒与转染试剂孵育，然后导入神经元培养物中。随后，采集并分析神经元的图像，以追踪囊泡的运动。...

使用荧光成像技术观察神经元中囊泡的运动性

我们描述了用于研究转染的荧光蛋白在内质网（ER）中分布与移动性的成像方法，该方法通过共聚焦成像技术对活细胞进行观察。同时，我们还从超微结构层面分析了这些蛋白表达对该亚细胞区室结构的影响。...

培养细胞中内质网亚区室的可视化

我们描述了一种利用特异性多克隆抗体标记活神经元表面蛋白的方法，该抗体针对细胞外表位。通过内吞作用被抗体结合并在细胞表面内化的蛋白，可与在孵育期间仍停留在表面或转运至表面的蛋白区分开来。...

活体培养神经元抗体孵育后细胞表面与内化蛋白的差异标记

本文介绍了纳米颗粒（NPs）的合成及其荧光标记方法。这些纳米颗粒被用于脉冲-追踪实验，以标记真核细胞的内体-溶酶体系统。通过活细胞成像并进行定量分析，追踪了胞内病原体Salmonella...

应用荧光纳米颗粒研究细胞内细菌对内体-溶酶体系统的重塑

活细胞成像是一种用于可视化动态过程的强大工具。对固定细胞的观察仅能提供静态图像，可能导致对过程的误解和混淆。本研究介绍了一种用于在活细胞中研究脂质体纳米颗粒的摄取、药物释放及细胞内定位的方法。...

使用 体外 利用活细胞成像技术探究脂质纳米颗粒递送的化疗药物

研究膜运输对于理解神经元功能至关重要。本文介绍一种用于量化神经元中囊泡运动性的方法。该方法简便易行，可适用于神经系统中膜运输的量化分析。...

使用荧光探针定量培养神经元中内体和溶酶体的运动性

蛋白质从细胞表面逆行运输至高尔基体对于维持膜稳态至关重要。本文介绍一种利用功能化纳米抗体在HeLa细胞中对重组蛋白从细胞表面到高尔基体的运输进行生化分析的方法。...

利用功能化纳米抗体在培养细胞中分析内吞摄取及逆行转运至反式高尔基网络

了解利用功能化纳米抗体在HeLa细胞中进行内吞转运活细胞成像的方法。该技术可实时追踪跨膜蛋白从细胞表面到反式高尔基体网络的运输动态，为研究膜蛋白转运机制提供高效工具。

利用功能化纳米抗体对培养细胞进行内吞运输的活细胞成像

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