在培养细胞中使用功能化纳米抗体进行内吞转运的活细胞成像

我们正在研究跨膜蛋白的内吞和逆行运输，以及赋予该运输的机制。为了研究细胞表面的蛋白质运输，通常使用传统抗体，但它们可能促进交联和溶酶体靶向。首先，获取一粒用VHH-mCherry转殖的大肠杆菌颗粒。

在细菌细胞沉淀中加入30毫升含20毫莫尔吡唑的冰冷结合缓冲液，含PBS。用移液器上下移液，彻底重新懸浮沉淀。将重悬混合物转移到标记为50毫升的离心管中。

在再浮细胞中补充200微克每毫升溶酶、20微克每毫升DNase I、一毫莫尔氯化镁和一毫莫尔苯甲基磺酰氟化物。在室温下孵育10分钟后，将其置于一个翻转的旋转器上，并以4摄氏度继续孵化一小时。接着，将超声器六毫米的实心探针头直接插入细胞悬浮液中。

机械性地破坏细菌细胞，使用三次一分钟的超声波脉冲，振幅为40%，工作周期为1秒开机、1秒关闭。允许每次脉冲之间冷却一分钟。离心后，将净化后的裂解液冰放在冰上，同时准备使用预包装的一次性标签纯化柱进行固定金属亲和层析，这些标签纯化柱设计用于重力流作。

将镍-亚硝三醋酸柱固定在金属支架或合适的柱架上。然后完全抽干塔上的储存缓冲液。通过加入10毫升含20毫莫尔吡唑的结合缓冲液，在PBS中平衡该柱。

让缓冲器靠重力通过。逐渐将约30毫升清除的细菌裂解液涂抹于平衡柱中。让它通过重力，丢弃流动。

然后连续涂抹两大容量10毫升含20毫莫拉咪唑的结合缓冲液，浸入PBS洗涤柱。通过在两毫升微离心管中将含有500毫莫拉咪唑的洗脱缓冲液（PBS）浸入两毫升微离心管中，洗脱结合的纳米体。用5毫升PBS冲洗五次，使一个50毫升管适配器播种的脱盐柱达到平衡。

让缓冲液完全进入填装树脂，然后丢弃流动。最后冲洗后，将柱子以1000 x g离心两分钟。现在，在丢弃流流后，将带有适配器的柱子移到新的50毫升收集管上。

将两毫升洗脱功能化纳米抗体装入预平衡脱盐柱上。然后再次以1000 x g离心两分钟收集洗脱液，确认VHH-mCherry的表达和纯度。启动自动活细胞成像系统的软件。

将ibidi显微镜腔转移到显微镜台。设置两个成像通道，使用激发和发射滤波器对应EGFP和mCherry。选择短曝光时间和低光照强度以避免光漂白。

所有实验的设置保持不变。不同记者的环境可能有所不同。对于每种条件，存储10个不同视场的坐标，包含三到四个对焦单元，组成点列表。

然后在添加VHH-mCherry之前，先捕捉点列表中每个位置的单一快照作为参考图像。要启动胞吞作用，应在每个孔中轻柔地加入350微升预热的VHH-mCherry溶液，同时尽量减少对单层的干扰。然后进行图像采集。

在保持37摄氏度和5%二氧化碳的同时，进行100帧、每32个间隔的延时采集。要分析VHH-mCherry的内吞摄取情况，将延时图像集加载到图像分析软件中。应用分割和追踪工具，量化不同关注区域内化荧光随时间的变化。

所有功能化纳米抗体变体均被纯化至高产率和高纯度，仅VHH-mCherry表现出轻微的蛋白水解降解。通过表位特异性免疫印迹检测，VHH-mCherry的降解产物被确认为单个VHH-mCherry结构域。在缺乏BirA的情况下，VHH-mCherry的回收量约为每份制备20毫克。

而生物素化则通过对纳米抗体BSA混合物的链霉亲和素琼脂糖提取得到证实。HeLa细胞中表达的EGFP标记融合蛋白表现出与其内源性蛋白一致的亚细胞定位模式，包括EGFP-CDMPR和EGFP-CIMPR的核周围定位。EGFP-TGN46在核周独占定位，TfR-EGFP在外周定位。

VHH-mCherry使EGFP-CDMPR的内吞转运在活细胞中可视化，显示出共定位在60分钟内逐渐增强。VHH-mCherry被EGFP-CDMPR表达细胞摄取约43分钟后达到平台，半衰期为9分钟。在表达TfR-EGFP的细胞中，VHH-mCherry在细胞间迅速积累，半衰期为4分钟，20分钟后达到饱和。

我们建立了多功能的纳米抗体工具包，用于分析任何跨膜蛋白从细胞表面的运输情况。我们使用荧光纳米抗体标记表面货物蛋白，然后通过活细胞显微镜研究其内吞运输。通过基于纳米抗体的活细胞成像方法，我们希望揭示驱动地表到高基氏体网络货物运输的通路。