Name: K562细胞的表观遗传工程：使用dCas9-DNMT3A和-HDAC1融合蛋白进行稳定靶向DNA甲基化的双载体游离策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学习使用双载体游离策略在K562细胞中进行表观遗传工程，通过dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1融合蛋白实现稳定靶向DNA甲基化。该方法可精准调控基因表达并减少脱靶效应。

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Irene Dereki 和 Vasiliki Chondrou 获得希腊开放大学研究基金特别账户（ELKE）为期三年的资助（资助编号：80706）。

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<li>Stavrou, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2-globin+replicator+greatly+enhances+the+potential+of+S%2FMAR+based+episomal+vectors+for+gene+transfer+into+human+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).</li>
<li>Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+cis-acting+sequences+improve+expression+and+establishment+of+a+nonviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).</li>
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<li>Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+S%2FMAR-based+infectious+episomal+genomic+DNA+expression+vector+provides+long-term+regulated+functional+complementation+of+LDLR+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency.</a> Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
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作者声明不存在任何竞争性的财务或非财务利益。

该方案中最关键的步骤之一是设计高度特异性的sgRNA。脱靶效应是基于CRISPR的表观遗传编辑系统已知的局限性，通常源于dCas9结合的不忠实性以及效应结构域的非特异性活性。为最大限度减少脱靶效应，必须使用生物信息学工具设计sgRNA，以优化其靶向活性并最小化脱靶结合30。建议采用sgRNA设计工具并对预测的潜在脱靶位点进行验证，同时比较携带不同sgRNA的克隆，有助于进一步区分真实的靶向效应。另一个关键步骤是仅使用表观遗传修饰酶的催化结构域，以避免全长酶的残余功能引发内源性相互作用31。需要注意的是，dCas融合系统的有效性受多种因素影响，而这些因素并不总是可预测的，例如染色质状态、靶区域在细胞核三维结构中的周围位点以及细胞类型。sgRNA靶位点的选择通常需要通过实验进行试错探索，耗时较长。设计多个覆盖目标CpG区域的sgRNA，并优先选择内源性甲基化水平较低和/或乙酰化水平较高的位点用于HDAC靶向，可提高获得有效克隆的可能性。目前，一些可在线使用的工具也正在逐步开发，用于预测sgRNA活性及CRISPR-Cas9表观遗传编辑系统的效果<...

表观遗传调控，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，在控制基因表达、细胞分化和基因组稳定性方面发挥着关键作用。这些机制的失调通常参与多种病理状态的发生发展，无论是作为原因还是结果，尤其在癌症、神经疾病和基因组印记综合征中尤为显著1,2,3。值得注意的是，利用表观基因组编辑技术——成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统，可对特定基因组位点的表观遗传景观进行精确干预，实现与基因敲除模型相当的基因抑制水平，同时不改变底层DNA序列4。因此，靶向表观遗传编辑已成为解析基因调控机制和开发精准治疗策略的一种极具前景的方法。
DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂是目前已被批准用于临床的表观遗传治疗手段。然而，这些药物会非选择性地靶向全基因组范围内的表观遗传标记，改变整体的染色质状态，从而导致患者出现脱靶效应和毒性反应5。为克服传统表观遗传调控药物的局限性，研究人员已开发出基于催化失活的Cas9（dCas9）与效应结构域融合的可编程表观遗传编辑工具，这些效应结构域包括DNA甲基转移酶（例如DNMT3A）、去甲基化酶（例如TET1）、组蛋白乙酰转移酶（例如p300）或去乙酰化酶（例如HDAC3）6,7,8,9。dCas9-效应因子系统可在小RNA分子——即单导向RNA（sgRNA）——的引导下，实现对特定基因组位点的表观基因组修饰，且不会在目标序列处引入双链断裂。近期研究已证实，该系统可用于调控基因表达、重塑染色质可及性，甚至重编程细胞表型10,11,12。
尽管取得了快速进展，基于 dCas9 的表观基因组编辑系统仍面临一些局限性。最常见的挑战是由于表观遗传效应结构域缺乏特异性而导致的脱靶效应，尤其是在 dCas9 融合工具强表达或长期表达的情况下13,14。此外，dCas9 融合蛋白分子量较大，给递送带来显著困难。Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）序列的大小约为 4.2 kb15，接近腺相关病毒（AAV）载体的最大承载容量。虽然慢病毒载体具有相对较大的承载能力（~12-1&#8239;kb），能够递送全长的 SpCas9 与表观遗传效应因子的融合体，但仍存在随机整合到基因组的风险，可能导致插入突变，从而限制其临床应用16。另一方面，非病毒方法（如质粒转染）在分裂细胞中保留率较低。瞬时或&#34;击即离去&#34;的递送策略虽可避免基因组整合，但通常难以在细胞分裂过程中维持稳定的甲基化改变，除非与染色质重塑因子或协同效应因子联用17,18,19。
为应对这些挑战，我们采用了一种非整合型、可自我复制的附加体质粒系统（pEPI-S/MAR）来递送与dCas9融合的表观遗传效应因子。该质粒在分裂细胞中以低拷贝数（约每细胞1-2个）在染色体外持续存在，从而实现持续但适度的表达，以最大限度地减少因过表达引起的非预期功能20,21。附加体中的支架/基质附着区（S/MAR）元件可与核基质相互作用，有助于在细胞分裂过程中使附加体在细胞核内稳定维持22,23。此外，pEPI质粒系统避免了病毒整合相关的风险，并可在不超出包装容量限制的情况下递送构建体。
近期研究表明，带有活性组蛋白修饰（特别是H3K27乙酰化，H3K27ac）的启动子区域通常对工程化DNA甲基化具有抗性。已有研究显示，采用组合策略，即利用组蛋白修饰的“书写”酶或“擦除”酶来去除或添加组蛋白修饰，同时通过DNMT3A引入DNA甲基化，可提高基因沉默的稳定性和持久性，即使在瞬时干预中也是如此19,24。基于这些发现，我们提出假设：共递送dCas9-HDAC1和dCas9-DNMT3A，并靶向邻近的遗传区域，将促进染色质重塑，从而在目标调控元件上实现更高效且持久的甲基化。
本研究旨在设计并构建一个能够靶向且稳定地对 ZBTB7A 基因的CpG岛326区域进行DNA甲基化的系统，该区域在K562细胞中具有内源性甲基化水平低和H3K27ac异常修饰的特征。本研究的目标是利用低表达、稳定且非整合型的pEPI系统，递送两个分别编码dCas9与不同表观遗传效应蛋白融合的附加体质粒，同时递送靶向 ZBTB7A 基因上游富含CpG的调控区域的sgRNA。如图1所示，将这些附加体质粒共转染至K562细胞后，可实现编辑复合物在目标CpG岛上的双重招募：其中HDAC1去除局部组蛋白乙酰化修饰，从而促进DNMT3A介导的后续DNA甲基化，最终实现协调且位点特异性的表观遗传修饰。
此处描述的系统适用于因构建体大小、安全问题或成本限制而不适合采用病毒递送的应用场景。该系统支持不同sgRNA和效应蛋白融合体的模块化克隆，可灵活适用于多种靶位点。目前最适用于 体外 或在能够耐受质粒转染和抗生素筛选的细胞系中进行的临床前研究。在本实验中，通过基于脂质体转染试剂的方法将附加体质粒递送至K562细胞，并在G-418筛选条件下维持培养。

<table><tbody><tr><td>Absolute Q DNA 数字PCR预混液（5倍浓度）</td><td>Applied Biosystems</td><td>A52490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI-HF&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R3552</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>NEB</td><td>R0558</td><td></td></tr><tr><td>AseI</td><td>NEB</td><td>R0526</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Melody 细胞分选仪</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bglll</td><td>NEB</td><td>R0144</td><td></td></tr><tr><td>BspEI</td><td>NEB</td><td>R0540</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物（每种10 mM）</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基，含稳定型谷氨酰胺和丙酮酸钠</td><td>Biowest</td><td>L0103</td><td></td></tr><tr><td>DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）</td><td>NEB</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>DNMT3A（CD）、HDAC1序列</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0712</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td>亚硫酸氢盐转化试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Epitect 亚硫酸氢盐试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0734</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）</td><td>Gibco</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>NEB&amp;reg;&amp;nbsp;5-alpha 感受态&amp;nbsp;E. coli&amp;nbsp;（高效率）</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEB&amp;reg;&amp;nbsp;5-alpha F'Iq&amp;nbsp;感受态&amp;nbsp;E. coli&amp;nbsp;（高效率）</td><td>NEB</td><td>C2992H</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 组织DNA提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td></td></tr><tr><td>PBS，10倍浓缩液，pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>BE17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>pGuide载体</td><td>OriGene Technologies</td><td>GE100042</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，用含10 mM Tris（pH 8.0）和1 mM EDTA的溶液饱和</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>引物，sgRNA&amp;nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyroMark 引物设计软件&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>Version 2.0</td><td>亚硫酸氢盐引物设计工具&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PyroMark Gold Q24 试剂</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark PCR试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24 MDx</td><td>Qiagen</td><td></td><td>焦磷酸测序工作站&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PyroMark Q24 软件&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>v2.0.8</td><td>焦磷酸测序软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Q5&amp;reg; 高保真DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect 反转录试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Absolute Q MAP16 板试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>A52865</td><td>数字PCR系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I 核酸凝胶染料，DMSO中10,000倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

k562细胞的表观遗传工程：利用dcas9-dnmt3a和dcas9-hdac1融合蛋白的双载体附加体策略实现稳定的靶向dna甲基化

Epigenetic Engineering of K562 Cells: Dual-Vector Episomal Strategy for Stable Targeted DNA Methylation using dCas9-DNMT3A and -HDAC1 Fusion Proteins

由于缺乏能够诱导位点特异性且长期表观遗传修饰以调控基因表达的多功能工具，研究DNA甲基化在基因转录调控中的精确作用以及开发靶向特定基因甲基化模式的疗法面临重大挑战。本研究旨在开发并验证一种创新的基于附加体（episomal）的系统，以促进在特定基因位点实现稳定的DNA甲基化，该系统可能对基础表观遗传学研究和治疗应用均具有价值。为实现这一目标，K562细胞系被&#160;共转染了两种不同的附加体载体。这两种载体均被设计用于表达靶向ZBTB7A基因上游CpG岛326内一段367 bp非甲基化区域的向导RNA（gRNA）。每种载体编码一种失活形式的核酸酶Cas9（即“死亡Cas9”或dCas9），该蛋白分别与DNA甲基转移酶DNMT3A的催化结构域（dCas-DNMT3A-CD）或全长组蛋白去乙酰化酶HDAC1（dCas-HDAC1）融合。dCas序列包含两个核定位信号（NLS），以确保蛋白进入细胞核。这种双系统表达盒可促进形成一种可能有利于长期表观遗传沉默的染色质状态，有望实现强效且持久的表观遗传效应。通过使用可自我复制的附加体载体干预宿主表观基因组具有多项优势：可在多次细胞分裂过程中以低拷贝数维持载体的存在与表达，且不整合入宿主基因组，从而最大限度减少脱靶效应并保持基因组完整性。我们报告了在靶向的ZBTB7A CpG岛326区域DNA甲基化的精确且显著增加。研究结果验证了所构建的附加体CRISPR/dCas系统能够诱导持久且位点特异性的DNA甲基化。因此，该系统是一种评估靶向甲基化变化功能效应的宝贵研究工具，也为未来表观遗传治疗的发展提供了有前景的平台。

为了研究我们设计的靶向表观遗传编辑工具是否能够在ZBTB7A CpG岛326位点诱导特异性的DNA甲基化改变，我们首先构建了编码dCas9与DNMT3A(CD)或HDAC1融合蛋白的附加体型载体，并设计了多种靶向CpG岛326区域内不同位点的sgRNA。我们最初将这些质粒组合共转染至K562细胞中，以评估sgRNA与效应模块同时递送是否能够引起可重复的表观遗传修饰。
初始的附加体质粒共转染策略及其局限性 
我们首先尝试同时共转染四种附加体性质粒。最初使用了两种表达dCas9融合表观遗传效应因子的载体（pEPI-1-dCas9-DNMT3A 和 pEPI-1-dCas9-HDAC1），以及两种仅携带靶向CpG岛326的sgRNA表达盒的独立pEPI-1质粒（图2）。测试了不同组合的sgRNA（1-4），每次转染共递送两种sgRNA，以覆盖CpG岛326上的调控位点。sgRNA在CpG岛326上的靶位点如图3D...

本方案描述了一种非整合型、附加体型的CRISPR/dCas9系统，用于在K562细胞中进行靶向表观遗传编辑。该系统结合dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1效应蛋白与特异性sgRNA，可精确诱导位点特异性的DNA甲基化，并降低脱靶效应。

K562细胞的表观遗传工程：利用dCas9-DNMT3A和dCas9-HDAC1融合蛋白的双载体附加体策略实现稳定的靶向DNA甲基化

研究DNA甲基化在基因转录调控中的精确作用，并开发针对特定基因甲基化模式的治疗方法……

我们的研究旨在开发一种稳定且非整合式的靶向DNA甲基化系统，以探索在K562细胞中持久的表观遗传编辑。该领域的最新进展包括双效应子CRISPR-dCas9系统，该系统结合表观遗传酶以实现协同性、稳定性和位点特异性的表观遗传修饰。首先，在37°C、5%二氧化碳及湿润条件下，将K562细胞培养于T75培养瓶中。使用分光光度计在260纳米处定量用于转染的附加体质粒DNA。每次转染使用8微克总质粒DNA，若进行共转染，则准备每种质粒各4微克，并将所需量与90微升超纯水混合。随后，向稀释后的DNA溶液中加入10微升3摩尔的醋酸钠溶液和2.5倍体积的100%乙醇。充分混匀DNA溶液，并在20摄氏度下孵育过夜，以使DNA沉淀。次日，在4摄氏度条件下，以11,000 G离心15分钟。在生物安全柜内的无菌条件下，小心弃去管中的上清液。向离心管中加入 500 微升 70% 乙醇以洗涤沉淀物，然后在 4 摄氏度下以 11,000 G 离心 5 分钟。接着，彻底移除管中的乙醇上清液，并让 DNA 沉淀物自然风干，直至无可见乙醇残留。随后，将干燥的 DNA 沉淀物充分重悬于 50 微升 DMEM 中。取约2.5微升重新悬浮的DNA（含400纳克），置于新离心管中，并将质粒DMEM溶液于4摄氏度保存以备后续使用。将剩余的DNA样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，以验证DNA的纯化效果与完整性。当K562细胞培养至50%至60%融合度时，从T75培养瓶中收集细胞，以确保最佳转染效率。使用血细胞计数板对收获的细胞进行计数，并将含有2 × 10⁵个细胞的体积转移至一个含有900 µL不含FBS或抗生素的DMEM的35毫米培养皿中。将培养皿置于37°C、含5% CO₂的培养箱中，使细胞保持适合转染的准备状态。使用基于Lipofectamine的转染试剂盒，按照制造商说明书进行质粒转染，必要时调整体积。向先前制备的质粒DMEM溶液中加入3 µL P3000试剂。轻轻混匀，并在室温下孵育5分钟。随后，加入5 µL Lipofectamine 3000试剂，并加入足量DMEM使终体积达到100 µL。将转染混合物在室温下孵育15分钟。将100微升转染混合物全部加入含有细胞的35毫米培养皿中。轻轻摇动培养皿使混合物均匀分散，然后放回培养箱中。转染后24小时，向每皿中加入3毫升含10%胎牛血清（FBS）和1倍青霉素-链霉素的完全DMEM培养基，以促进转染细胞的增殖。转染后72小时，加入G418抗生素开始筛选，使其终浓度达到1毫克/毫升。当筛选过程稳定且总细胞数超过1×10⁶时，在25°C下以300×g离心6分钟收集细胞。用一份量的无菌 PBS（pH 约为 7.4）洗涤沉淀物一次，并在相同条件下再次离心。将最终的细胞沉淀重悬于一份量 PBS 中后，使用血细胞计数板测定细胞浓度。将细胞悬液稀释至每毫升 1 × 10⁶ 个细胞，确保细胞充分重悬，然后将细胞转移至流式细胞术检测管中。接下来，使用96孔经组织培养处理的板作为收集装置，将荧光激活细胞分选仪设置为单细胞模式。根据所用仪器调整软件参数。通过前向散射和侧向散射对细胞进行设门，选择目标细胞群，以分离出预期大小和颗粒度的细胞。排除碎片以及颗粒度较高或已死亡的细胞，使用前向散射面积对高度或侧向散射面积对高度图来圈选单细胞。然后，向96孔板的每个孔中预先加入含1毫克/毫升G418的完全培养基100微升，并将该板置于37摄氏度培养箱中预热。以单细胞模式进行细胞分选，保持分选速率低于每秒300个事件，以提高准确性。分选后，在显微镜下检查每个孔，确认每孔中存在单个细胞，并将培养板置于含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中。让单细胞克隆在96孔板中各自扩增。当克隆生长明显时，向孔中加入含较低浓度G418的培养基，使其终浓度为400微克/毫升，以维持筛选压力。将生长良好的克隆依次转移至12孔板，然后转移至T25培养瓶，最后根据需要转移至T75培养瓶，直至每个克隆达到约1 × 10⁶个细胞。接着，定期收集两份细胞沉淀。将其中一份沉淀于-20 °C保存，用于基因组DNA提取。将第二个沉淀用500微升TRIzol试剂充分匀浆，并于-20摄氏度保存，用于RNA提取和互补DNA合成。采用酚-氯仿抽提法结合乙醇沉淀法，从选定的克隆中提取基因组DNA。将提取的DNA完全重悬于无核酸酶的水或TE缓冲液中。在进行后续步骤之前，使用分光光度计测定DNA的浓度和纯度。最后，使用TRIzol试剂从保存的细胞沉淀中提取总RNA，随后进行异丙醇沉淀。使用荧光激活细胞分选技术将单个细胞分选至96孔板中，以分离同时携带两种构建体的细胞。对10个扩增克隆的PCR分析证实，仅部分克隆保留了两个构建体，表现为230个碱基对和205个碱基对处的条带。焦磷酸测序显示，阳性克隆二在gRNA1靶向区域附近的多个CpG位点的甲基化水平较未转染对照组有所升高。我们解决了缺乏非整合型长期递送系统的问题，实现了在不改变宿主基因组的前提下进行精确且稳定的表观遗传编辑。我们的研究结果建立了一种通过靶向甲基化研究基因调控的可靠工具，并为开发潜在的精准表观遗传疗法提供了支持。未来的研究将探索改进附加体递送方式、最小化脱靶效应、提高Cas9效率，以及将该系统适用于原代细胞或体内模型。

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