Name: 在GMP可扩展装置中高效快速生成CAR-T和细胞因子诱导杀伤细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解利用G-Rex装置高效扩增CAR-T和CIK细胞的规模化方案。该方法通过抗CD3/CD28抗体激活T细胞，结合慢病毒转导和白介素支持，实现高细胞存活率与细胞毒性功能保留，适用于临床级过继细胞治疗产品的标准化生产。

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CAR 构建体由圣裘德儿童研究医院（St. Jude Children's Research Hospital）根据材料转让协议（MTA）提供。本工作获得以下资助：ScaleReady G-Rex Grant 2025；帕多瓦大学（University of Padova）- SOMMAGGIO_BIRD24_01；AIRC 基金会 5x1000 2019 - 项目编号 ID. 22759；抗癌联盟（Alleanza Contro il Cancro），CAR-T_2 项目 RCR-2023-23684268。本研究还获得了 &#34;当前研究&#34; 由意大利卫生部资助支付出版费用。图表使用 GraphPad Prism 9 软件和 BioRender.com 制作。

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本方案概述了一种高效且可放大的平台，用于利用G-Rex培养系统从外周血单个核细胞（PBMCs）中生成两种不同的过继性细胞治疗（ACT）产品，即CAR-T细胞和CIK细胞。我们实施了概念验证性的功能与表型检测，以验证该方法的可扩展性。结果表明，在扩增过程中，细胞的表型和活性均得以维持，确保该系统适用于科研应用并可直接向临床转化。事实上，我们成功证明，无论是CAR-T细胞还是CIK细胞，均可在不同培养装置中实现高效扩增，获得高细胞得率，同时保持功能性效应表型以及强大的抗原特异性细胞毒性。
结合培养装置的透气膜技术，该扩增方案可实现更快的扩增动力学，减少人工操作，并在不同供体间获得稳定且高的细胞产量。与标准培养系统相比，该方案具有更高的可重复性且更省力，而标准培养系统通常需要多次更换培养基，且细胞丢失和污染的风险更高20,21。
此外，本方案可实现制造规模的无缝过渡：从小规模开放式系统（G-24，适用于临床前研究和筛选，例如CAR结构、细胞因子组合或供体差异性的筛选），到大规模开放式系统（G-6M，用于GMP前验证），最终过渡到大规模封闭式系统（用于GMP生产）。如本研究所述，从小规模向大规模开放式系统的过渡仅需根据设备尺寸按比例调整体积和细胞接种量，这具有显著的实用优势。同样，从开放式系统过渡到封闭式系统以实现GMP生产——即，将G-6M方案适配于大规模GMP生产——所需采取的唯一措施是使用相应的GMP级试剂和封闭式系统设备（G-10M-CS，表面积为10 cm2，对应单个G-6M孔；或G-100M-CS，表面积为100 cm²，对应G-100M开放式设备），而无需对方案本身进行任何其他修改。这些封闭式设备与其开放式对应设备的区别在于集成了无菌管路连接，可与液体处理泵（GatheRex）配合实现自动化培养基操作，从而构建完全封闭的环境。该封闭系统方法消除了人工换液步骤，降低了污染风险，因此特别适用于对无菌性和可重复性要求极高的GMP合规生产环境。值得注意的是，可扩展性是连接早期发现研究与临床转化的关键特征，尤其对于资源有限的学术机构或早期生物技术环境而言至关重要。
为实现本方案全面符合GMP要求，应考虑从含FBS的培养基过渡到无血清/无异源成分的培养基配方，以顺应美国FDA和欧洲EMA当前的监管趋势，从而消除批次间的差异性，降低潜在的异源污染风险，并提高监管合规性27。
此外，该扩增系统所需干预极少，可为实施多维表型分析28提供理想平台，减少制造过程中因操作引入的干扰因素，从而避免对表型分析造成混淆。另外，该系统不仅适用于CAR-T细胞和CIK细胞，还可广泛适用于其他淋巴细胞群体及工程化免疫细胞，从而拓展其在免疫治疗开发中的应用价值29,30。
尽管该实验方案具有较强的稳健性且无需修改，但某些步骤对成功尤为关键。对于CIK细胞的扩增，细胞因子添加的时间至关重要，以确保最佳的分化与扩增效果。对于CAR-T细胞，转导应发生在激活后24小时，以最大化转导效率，且慢病毒分装液仅可解冻一次，因为反复冻融会显著降低转导效率31。
不同原代细胞制备之间存在的生物学变异性自然会导致扩增速率和功能活性的差异，这反映了供体间的多样性。这种不可避免且固有的变异性可通过同时对多个供体来源的细胞进行平行扩增来有效管理，从而确保实验间结果的稳健性和可重复性。
综上所述，该方案能够直接从外周血单个核细胞（PBMCs）快速、可扩展且可靠地扩增功能性效应淋巴细胞，为早期研究和大规模临床转化提供了灵活性。该系统可轻松适用于多种细胞类型和基因修饰，为免疫治疗的开发提供了一个多功能的平台。

过继性细胞治疗（adoptive cell therapy, ACT）已成为癌症治疗先进疗法的重要支柱。该方法基于输注 离体 扩增的细胞产品以实现抗肿瘤疗效1迄今为止，已有多种细胞类型被用于过继性细胞治疗（ACT），包括抗原非特异性方法，例如自然杀伤（NK）细胞2，细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）3,4自然杀伤T（NKT）5，或 γδ T 细胞6，到高度特异性和个性化的类型，例如肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）7 以及工程化细胞疗法，例如嵌合抗原受体（CAR）1,8 和T细胞受体（TCR）细胞9,10.
CAR-T细胞是通过基因改造生成的T细胞 离体 病毒转导以表达一种合成免疫受体，该受体被设计用于识别特定分子靶标。CAR 结构由抗原特异性的单链可变区片段（scFv）抗体与胞内信号结构域融合而成，后者包括 TCRζ 链和共刺激分子。当与抗原结合后，胞内结构域传递活化信号，促进 T 细胞增殖及抗肿瘤活性11.
CIK细胞是一群异质性的活化T淋巴细胞，在培养过程中获得CD56的表达 离体 从外周血单个核细胞（PBMCs）或脐带血（UCB）扩增12该扩增过程包括使用γ-干扰素（IFN-γ）、抗CD3单克隆抗体和白细胞介素-2（IL-2）进行刺激，随后在IL-2中培养14天。CIK细胞在功能上兼具自然杀伤（NK）细胞和T细胞的特性，通过主要组织相容性复合体（MHC）非依赖性和依赖性机制发挥抗肿瘤活性。13,14,15,16这些特性使得CIK细胞在异基因和自体治疗应用中均具有较低的移植物抗宿主病（GvHD）风险17.
在临床实践中，CAR-T细胞和CIK细胞治疗均需要输注大量细胞。每位患者接受的CAR-T细胞剂量通常为5000万至2亿个18。类似地，CIK细胞单次输注剂量通常可达100亿个细胞，根据治疗方案的不同，患者常需接受多次输注19。使用培养瓶或培养板的传统细胞培养方法效率低、耗时长，且需要频繁传代，难以实现大规模扩增，同时增加了污染风险。采用袋式培养或生物反应器的自动化或半自动化系统虽可实现大规模扩增，但仍存在局限性，例如剪切力影响、需要调整细胞密度以及频繁灌注培养基20,21，且每次只能处理一个批次，导致在学术研究和工业生产中成本较高。在此背景下，气体可渗透快速扩增（G-Rex）装置提供了一种替代方案。该系统是一种静态培养方法，其培养孔底部设有硅胶膜，可实现高效的氧气交换，并具有较高的容器高度，从而容纳更大体积的培养基。因此，该系统可在无需更换培养基或调整细胞密度的情况下支持细胞生长22,23。G-Rex-M系统已证明可扩展至5000 mL，并可与自动化收获系统兼容，提供一种无污染、封闭式的培养平台，便于从学术研究向临床应用转化，适用于先进治疗药物产品（ATMPs）的开发24。
在所述实验流程中，我们利用了G-Rex装置的优势和特性，以优化CAR-T细胞和CIK细胞的扩增方案。我们证明了这两种细胞均能高效扩增并实现规模化，同时在不同培养体系中保持一致的表型和功能特征。CIK细胞和CAR-T细胞扩增方案的示意图见图1。
<img alt="CAR-T 和 CIK 细胞实验方案示意图，显示 PBMCs 激活、慢病毒转导及细胞扩增过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 1"> 
图 1：使用 G-24 或 G-6M 培养装置进行 CAR-T 和 CIK 细胞扩增流程的概览。 CAR-T 和 CIK 细胞均从第 0 天分离的 PBMCs 开始扩增。在 CAR-T 细胞扩增过程中，PBMCs 于第 1 天用抗 CD3 和抗 CD28 抗体刺激，第 2 天进行基因工程改造，随后每隔 3–4 天补充人源 IL-7（hIL-7）和人源 IL-15（hIL-15），并在第 9 天收获细胞用于后续功能检测。在 G-6M 培养体系中，细胞因子仅在第 2 天添加一次，整个培养期间无需额外补充。在 CIK 细胞扩增过程中，PBMCs 于第 1 天用重组人 IFN-γ（rhIFN-γ）刺激，第 2 天加入抗 CD3 抗体和重组人 IL-2（rhIL-2），之后每隔 3–4 天补充 rhIL-2。在 G-24 培养体系中，每次补充细胞因子时需同时更换培养基。CIK 细胞于第 14 天收获，用于后续功能检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Brilliant 染色缓冲液</td><td>BD Biosciences</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD28 抗体，抗人</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-375</td><td>克隆 15E8</td></tr><tr><td>CD3 抗体，抗人</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-387</td><td>克隆 OKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>740147</td><td>克隆 UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>Biolegend</td><td>320808</td><td>克隆 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>563875</td><td>克隆 SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>563429</td><td>克隆 HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>Biolegend</td><td>318306</td><td>克隆 HCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555543</td><td>克隆 FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD Biosciences</td><td>562428</td><td>克隆 RPA-T8</td></tr><tr><td>CellTrace Violet 细胞增殖试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;prime;s 磷酸盐缓冲液 (D-PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>E-plate 16</td><td>Agilent</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)，经济型</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活力染料 780 (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 24 孔板&amp;nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6M 孔板&amp;nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Lonza</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>His 抗体</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白 20%</td><td>CSL Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人 IL-15 重组蛋白</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>人 IL-7 重组蛋白</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>乳腺癌细胞系&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>生理溶液 (0.9% 氯化钠)</td><td>Monico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Burkitt 淋巴瘤细胞系&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人 IFN-γ</td><td>R&amp;D Systems</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>重组 IL-2 (Proleukin)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-His</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>稳定型 L-谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence 实时细胞分析系统</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基</td><td>Lonza</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

高效快速生成符合gmp可扩展设备的car-t细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

过继性细胞治疗（adoptive cell therapy, ACT）近年来发展迅速，在癌症免疫治疗中发挥着关键作用，并显著影响治疗效果。细胞治疗在临床前和临床阶段开发中的一个关键步骤是细胞制备工艺。传统的静态培养方法需要频繁操作细胞，且常因气体交换和营养供应受限，导致细胞产量和表型受到影响。本文介绍一种逐步、可重复且可放大的方案，用于 离体 使用透气性快速扩增（G-Rex）装置扩增两种过继性细胞治疗（ACT）产品，即嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）。G-Rex装置专为增强营养物质交换、支持高密度细胞培养并最大限度减少人工干预而设计。在多种ACT策略中，CAR-T细胞在治疗血液系统恶性肿瘤方面已展现出显著疗效，推动其从实验研究迅速进入临床应用。除CAR-T细胞外，CIK细胞也已广泛应用于&#160;由于其特征性表型以及缺乏治疗相关不良事件和移植物抗宿主病（Graft-versus-Host Disease, GvHD），在临床试验中具有应用前景。本方案概述了这两种细胞类型的关键技术步骤，起始于外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）的分离与接种。简言之，PBMCs通过抗CD3/CD28抗体刺激后，经慢病毒转导以扩增CAR-T细胞；或通过干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）、抗CD3抗体及白细胞介素2（Interleukin 2, IL-2）刺激以获得CIK细胞。采用流式细胞术监测细胞的存活率和表型，通过功能学检测验证细胞产品的治疗潜力及该方法的可扩展性。总体而言，本方案为临床前条件下大量效应细胞的制备提供了切实可行的解决方案，有助于多种免疫细胞群体的临床应用，并为高效能效应细胞的大规模生产提供了可扩展的技术路径。

本方案描述了一种高效且可靠的 workflow，用于 离体 从分离的外周血单个核细胞（PBMCs）扩增和改造效应细胞，即CAR-T细胞和CIK细胞。该方法所需的细胞操作步骤较少，并利用G-Rex装置的气体交换能力，相较于传统的静态培养系统，可提供更优的营养供应和氧合条件23,24该方案的一个关键优势在于其固有的可扩展性，可从适用于临床前研究的小规模24孔装置（G-24）扩展至满足转化研究或临床生产需求的较大规模6M装置（G-6M），除按比例放大外，无需对方案本身进行任何修改。
根据第2-4节所述，使用本方案可从健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）中平行扩增出CAR-T细胞和CIK细胞，且在G-24和G-6M两种培养格式下均获得成功。培养结束时，两种细胞均表现出较高的扩增倍数和细胞活力，且两种装置格式间的增殖能力相当（图2，补充表1、补充表2），表明该方案在不同培养规模下具有良好的可重复性。
为验证培养装置的可扩展性，进一步对效应细胞进行了表型和功能表征。对于CD19 CAR-T细胞，我们定量了CAR的表达水平，并评估了CD4+ 和 CD8+ 亚群，注意到CD19 CAR占主导地位+ CD8+ T 细胞（图3A- B, 补充表1对于CIK细胞，我们评估了T细胞（CD3+CD56-），NK（CD3-CD56+）和CIK（CD3+CD56+）群体（图3D），以及活化受体 NKG2D 的表达（图3E, 补充表 2此外，我们观察到在G-24和G-6M培养体系中，CAR-T细胞和CIK细胞在整体表型及特定细胞群标志物表达方面具有可比性。通过CD62L和CD45RA染色分析了CD19 CAR-T细胞和CIK细胞产物的分化状态（图3C-F, 补充表1，补充表2)，显示在G-24和G-6M培养体系中细胞具有相似的记忆表型和效应表型。这些结果表明，扩大培养规模不会影响扩增后效应细胞群体的表型完整性或分化状态。
最后，为了评估功能效价，我们采用了靶标特异性的细胞毒性检测方法。在两种装置中扩增的CD19 CAR-T细胞和CIK细胞均表现出强烈的细胞溶解活性，证实了其在不同规模扩增下功能特性的维持（图4）。总体而言，这些结果表明扩增产物适用于临床前模型中的后续应用，并具备用于临床测试的潜力。
<img alt="CD19 CAR-T 细胞与 CIK 细胞柱状图；免疫治疗研究中的扩增倍数及细胞活力分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 2"> 
图 2：CD19 CAR-T 细胞与 CIK 细胞的增殖与活力。 分别于扩增第 9 天和第 14 天收集在 G-24 和 G-6M 培养板中由外周血单个核细胞（PBMCs）扩增得到的 CAR-T 细胞（n = 5）和 CIK 细胞（n = 6），进行细胞计数，并评估（A-C）扩增倍数和（B-D）活细胞百分比。柱状图表示均值 ± 标准差（SD），圆点代表单个供体（个体数值见补充表 1和补充表 2）。数据采用双尾多重配对 t 检验（A-C）或双尾多重 Wilcoxon 配对符号秩和检验（B-D）进行分析，并对多重比较采用 Holm-Sidak 校正（*p &lt; 0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CD19 CAR-T 细胞分析；细胞亚群和表型的柱状图；G-24/G-6M 数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 3"> 
图 3：在 G-24 和 G-6M 装置中扩增的 CD19 CAR-T 细胞和 CIK 细胞表型评估。 通过流式细胞术分析 CD19 CAR-T 细胞（n = 5）中 CAR 分子的表达，以评估（A）G-24 和 G-6M 扩增方案的转导效率，以及（B）CD4+/CD8+ 和（C）CD3+CAR+ 亚群中初始/记忆细胞亚群的表达。通过流式细胞术分析整体 CIK 细胞（n = 6）的表型，以研究（D）CIK（CD3+CD56+）、NK（CD3-CD56+）和 T 细胞（CD3+CD56-）的比例，以及（E）NKG2D 的表达和（F）CD3+CD56+ 亚群中初始/记忆细胞亚群的分布（G-24 n=5，G-6M n=6）。初始型（CD45RA+CD62L+）、中央记忆型（CM，CD45RA-CD62L+）、效应记忆型（EM，CD45RA-CD62L-）和效应记忆型 CD45RA 阳性（EMRA，CD45RA+CD62L-）。柱状图表示均值 ± 标准差（SD），圆点代表单个供体（个体数值见 补充表 1 和 补充表 2）。采用双尾多重配对 t 检验（B-C-D-F）或双尾 Wilcoxon 配对秩和检验（A-E）进行数据分析，并对多重比较采用 Holm-Sidak 校正（*p &lt; 0.05）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CAR-T细胞疗法疗效；柱状图与折线图；伯基特淋巴瘤、乳腺癌中的特异性裂解。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图4"> 
图4：CD19 CAR-T细胞与CIK细胞毒性的评估。（A）通过6小时基于流式细胞术的杀伤实验，检测CD19 CAR-T细胞（橙色，n = 5）或未转导（UTD）细胞（灰色，n = 5）对伯基特淋巴瘤Raji细胞系（作为悬浮细胞模型）的特异性裂解作用。结果以平均特异性裂解率 ± 标准差（SD）表示。（B）使用实时细胞分析仪，每15分钟监测一次在G-24（浅蓝色，n = 7）或G-6M（深蓝色，n = 6）培养基中培养的CIK细胞对乳腺癌MCF-7细胞系（作为贴壁细胞模型）的细胞毒性，持续24小时。结果以平均特异性裂解率 ± 标准误（SEM）表示。数据采用Mann-Whitney检验分析，并对多重比较进行Holm-Sidak校正（*p &lt; 0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：流式细胞术分析所用的设门策略。 代表性图示展示了以下分析的设门策略：（A）CAR-T细胞和（B）CIK细胞的表型鉴定，以及（C）基于荧光细胞染料的细胞毒性检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：不同供体来源的 CD19 CAR-T 细胞培养物的生长、活力及表型。 显示了每个供体在 G-24 和 G-6M 装置中培养第 9 天收获的 CD19-CAR T 细胞的总细胞数、扩增倍数、活力及表型特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：不同供体来源的 CIK 细胞培养物的生长情况、活力及表型。 显示了每个供体在 G-24 和 G-6M 培养装置中培养至第 14 天时收获的 CIK 细胞的总细胞数、扩增倍数、活力及表型特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种利用气体可渗透快速扩增（G-Rex）装置扩增过继性细胞治疗（ACT）产品（即嵌合抗原受体（CAR）-T细胞和细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞）的可扩展方法，可在具有临床相关性的条件下实现高效且稳定的细胞生长。

高效快速生成符合GMP可扩展设备的CAR-T细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞

过继性细胞疗法（ACT）近年来发展迅速，在癌症免疫治疗中发挥着关键作用，并显著影响了……

我们介绍一种G-Rex培养系统方案，用于高效且可放大的过继性细胞治疗产品（包括CAR-T细胞和CIK细胞）的扩增。核心挑战在于建立一种既能支持高密度培养，又能确保操作者干预最少并具备稳健临床可扩展性的实验流程。首先，将2 × 10⁶个 freshly isolated 外周血单个核细胞重悬于2 mL补充有5% FBS的完全培养基（称为CCMF）中。将悬液转移至24孔G-Rex培养装置的各孔中。直接向每孔加入4 µL抗CD3抗体和20 µL抗CD28抗体，以激活T细胞，并在37°C、5% CO₂条件下孵育。过夜刺激后，采用台盼蓝排斥法收集并计数活化的T细胞以评估其活力，计算出1×10⁶个活细胞，用于接种至每个G-Rex培养装置的孔中。将细胞转移至离心管中，在300 g条件下离心5分钟。随后，通过将所需量的慢病毒载体与5 µL浓度为8 mg/mL的硫酸鱼精蛋白储备液混合，为每孔制备转导培养基。使用添加5% FBS且不含青霉素或链霉素的CM培养基，将总体积调整至每孔0.8 mL。然后，将沉淀的细胞重悬于 0.8 毫升已配制好的转导培养基中，并将细胞悬液转移至 G-Rex 培养装置的新孔中。对于未转导的对照组，执行相同操作，但避免加入慢病毒载体。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下过夜培养。第2天，通过每孔加入7.2毫升添加了人白细胞介素-7和白细胞介素-15的新鲜CCMF，将培养体积增至每孔总共8毫升。接着在第5天，从每孔中移除6毫升条件培养基，注意不要扰动底部的细胞，以更新培养基。然后加入6毫升含有人白细胞介素-7和白细胞介素-15的新鲜CCMF进行替换。第9天，轻轻吸出并弃去每个孔中的5毫升条件培养基。使用1000微升移液器，将剩余3毫升培养基中的CAR-T细胞重悬，并转移至15毫升离心管中。用台盼蓝排斥法计数CAR-T细胞并检测其活力。将1 × 10⁶个 freshly isolated 外周血单个核细胞接种至G-24培养容器的每孔中，每孔加入8 mL补充有重组人干扰素-γ的CCM培养基。将培养容器置于37°C、含5%二氧化碳的环境中孵育。第1天（22至24小时后），直接向每孔加入4 µL抗-CD3抗体和4 µL重组人白细胞介素-2。将细胞再次于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。随后在第5、9和13天，从每个孔中移除6毫升条件培养基，注意不要扰动已贴壁的细胞。然后加入6毫升新鲜CCM，并补充重组人白细胞介素-2。第14天，轻柔地从每个孔中移除并弃去5毫升条件培养基。将剩余3毫升培养基中的细胞因子诱导的杀伤细胞重悬，并转移至15毫升离心管中。使用台盼蓝排斥法检测总细胞数量和细胞活力。进行CAR-T细胞扩增时，于第0天激活外周血单个核细胞，并于第1天进行慢病毒转导，操作如前所述。保持所有浓度和接种密度不变，但将所有体积按G-6M装置规格进行放大。第2天，使用CCMF培养基将每孔的总体积补至100毫升，计算并加入人白细胞介素-7和人白细胞介素-15，使其终浓度均为10纳克/毫升。第9天，使用刻度移液管从每个孔中移除约90毫升培养基。重悬CAR-T细胞及剩余的10毫升培养基，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中，用于后续检测。对于CIK细胞扩增，按照此前所述的CIK细胞扩增方案，在第0天进行外周血单个核细胞的接种。第1天，使用CCM将总体培养体积补至100毫升，并加入重组人白细胞介素-2和抗CD3抗体。每3至4天，向每孔补充重组人白细胞介素-2，使其终浓度为500国际单位/毫升，无需更换培养基。第14天，使用血清移液管从每孔中移除约90毫升培养基。最后，用剩余的10毫升培养基重悬细胞因子诱导的杀伤细胞，并将细胞转移至15毫升离心管中，用于后续检测。在G-24和G-6M装置中，由健康供体外周血单个核细胞平行扩增的CD19 CAR-T细胞和CIK细胞均表现出较高的扩增倍数和细胞活力，且两种装置格式间的增殖能力相当。对于CD19 CAR-T细胞，CAR表达水平以及CD4和CD8阳性亚群在G-24和G-6M装置中也相似。对于大规模CIK细胞群体，T细胞、NK细胞和CIK细胞群体的频率以及活化受体NKG2D的表达在不同培养规模间基本一致。CD19 CAR-T细胞和CIK细胞的分化特征（包括初始型、中央记忆型、效应记忆型以及CD45RA阳性的效应记忆型亚群）在G-24和G-6M扩增体系之间相似。在G-24和G-6M装置中扩增的CD19 CAR-T细胞均表现出对伯基特淋巴瘤靶细胞强大的细胞溶解活性，证实其功能在扩增过程中得以有效维持。在G-24和G-6M装置中培养的CIK细胞对MCF-7乳腺癌靶细胞均表现出强烈的细胞毒性，24小时内溶细胞曲线高度重叠。我们的G-Rex方案克服了复杂的扩增难题，实现了细胞产品从临床前到临床阶段生产的无缝且成比例的过渡。本方案具有高度可重复性，且比标准的临床前细胞培养系统更省力，可在不同供体间稳定获得高产量细胞。我们通过标准化方案并促进其更便捷的临床转化应用，推动过继性细胞治疗向临床应用发展。

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癌症研究

在GMP可扩展装置中高效快速生成CAR-T和细胞因子诱导杀伤细胞

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