利用哺乳动物细胞中的定量成像技术定位质膜及细胞内神经元型烟碱乙酰胆碱受体
2025年12月19日
本方案描述了利用哺乳动物 Neuro-2a 细胞系表达并定量神经元型烟碱乙酰胆碱受体亚基的方法。通过 pH 敏感性荧光标签结合共聚焦显微镜，可精确评估受体在质膜上的定位情况，以及在 pH 中性细胞内区室中的表达情况，从而促进对 nAChR 转运过程及药物学调控机制的研究。
了解烟碱型乙酰胆碱受体向哺乳动物细胞质膜的转运过程，对于研究分子伴侣介导的调控机制以及评估靶点选择性治疗药物至关重要。将pH敏感探针与活细胞共聚焦显微镜结合使用的主要优势在于能够高空间分辨率地确定亚基的位置。首先，将试剂预热至37摄氏度。
将nAChR亚基DNase完全解冻，并将转染试剂置于室温。将所有试剂用70%乙醇清洁后放入生物安全柜中。为表达α-7 nAChR，在微量离心管中，将α-7和NACHO质粒DNase加入低血清培养基中稀释。
加入DNA后，通过移液轻轻混匀。或者，为了表达α4β2受体，将每种亚基DNA各4微克稀释至总共250微升的低血清培养基中，并轻轻混匀。调整亚基比例以优化特定受体亚型的表达。
对于含有额外质粒的α4β2受体，加入等量的每种质粒DNA。接着，在新的微量离心管中，将8 µL转染试剂逐滴加入250 µL低血清培养基中。室温孵育5分钟后，将稀释后的DNA与稀释后的转染试剂逐滴混合于同一管中。
用移液器轻轻混匀，在室温下孵育20分钟。在复合物形成的同时，将培养皿中的培养基更换为1毫升无血清EMEM。将500微升DNA转染试剂复合物逐滴加入每皿中。
轻轻晃动培养板以使液体均匀分布，尤其注意覆盖玻底表面。将培养板置于37°C孵育24小时，并在4–6小时后更换培养基。用抽吸法移除旧培养基。
在室温下，用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养皿三次，每次10分钟。然后向培养皿中加入2毫升pH 7.4的成像缓冲液。将成像用培养皿插入共聚焦显微镜的载片架中，并将载片架放入预热的环境培养室中。
将蠕动泵管路连接到成像培养皿支架上，并关闭环境培养箱。接着启动成像软件，为感兴趣的荧光染料选择相应的激光器。使用10–60倍物镜扫描培养皿，定位待成像的细胞。
根据需要增加放大倍数，并调整焦深。选择所需的分辨率，使用选定的物镜拍摄单张图像。在培养皿图上记录成像位置，以便在更换缓冲液后重新定位相同的细胞。
使用相同的采集设置，对培养皿上的多个区域重复成像。仅保留连接至蠕动泵的出口管路，缓慢将 pH 7.4 缓冲液从培养皿中抽吸至废液容器中。随后将进口管路转移至 pH 5.5 淬灭缓冲液中。
打开蠕动泵，以每分钟1.5毫升的流速加入pH 5.5的缓冲液，确保细胞保持附着状态。20分钟后，关闭泵，并将细胞在缓冲液中继续孵育20分钟，以达到平衡。孵育结束后，对已保存的位置重复进行成像。
开始图像定量分析时，打开 ImageJ 并载入待分析的图像。图像将以堆栈形式显示，每个捕获的通道均在同一画框中呈现。导航至相差通道。
如果图像显得过亮，请选择“处理”并选择“增强对比度”，然后单击“确定”。使用放大镜工具放大单个细胞。使用自由选择工具在相位通道中勾勒出细胞的轮廓。然后切换到与目标荧光染料相对应的荧光通道。
通过选择“分析”并点击“设置测量”来设定所需的测量参数。确保勾选“面积”、“平均灰度值”和“积分密度”。要测量选定区域，请选择“分析”，然后点击“测量”。
通过追踪所选细胞附近的空白区域，进行三次背景测量。完成所有目标细胞的测量后，将测量数据复制并粘贴到 Excel 中进行分析。然后根据三次背景测量结果计算平均背景均值。
使用提供的公式计算每个细胞的校正后总细胞荧光值（CTCF）。采用相同的工作流程，分析缓冲液更换后获得的图像。将所有结果导出至数据分析软件进行统计处理。
在未转染的N2a细胞中观察到微弱的α-BTX AF647染色，而在转染了α-7 DNA的细胞中则检测到强烈的斑点状标记。定量分析证实，与未转染的对照组相比，转染α-7的N2a细胞中α-7 nAChRs在细胞膜上的表达显著升高。在pH 7.4条件下，可在细胞膜上观察到完整的α-7 pHuji荧光信号。
在转染的N2a细胞中。在pH 5.5时，alpha-7 pHuji荧光减弱，显示出受体内化定位。细胞外的alpha-7 pHuji受体荧光占受体表达的大部分。
定量结果显示，82.6%的α-7 pHuji受体位于质膜上，而17.4%处于细胞内。当pH恢复至7.4时，荧光信号恢复，证实pHuji信号具有可逆性。在pH 7.4条件下，表达α-4 SEP和β-2 pHuji的N2a细胞中，两个亚基均显示出强烈的膜荧光。
在 pH 5.5 条件下，荧光被淬灭，表明部分 alpha-4 SEP 和 beta-2 pHuji 亚基定位于细胞内部。定量结果显示，76.5% 的 alpha-4 SEP 位于质膜，23.4% 位于细胞内。在三重转染细胞中，alpha-4 SEP 表现出 82.8% 的膜定位和 17.2% 的内部表达。
在同一细胞中，63.4%的beta-2 pHuji亚基定位于细胞膜上，而36.6%位于细胞内。利用本方案，我们表征了新型分子伴侣对烟碱型受体表达与转运的影响，并评估了新的靶向选择性治疗药物。本方案的优势在于可适用于同源和异源烟碱型受体，能够量化受体在细胞内的相对定位。
我们的方法能够实现烟碱型受体在质膜上的快速且稳定的表达，有助于分子伴侣介导的转运分析以及药物发现工作。
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概述
本文详细介绍了在哺乳动物 Neuro2a（N2a）细胞中表达并定量神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）表面与细胞内定位的可靠方法。通过采用pH敏感性荧光标记物和活细胞共聚焦显微镜技术，该方案可实现对同源和异源nAChR亚基的精确定位与定量，有助于研究受体转运、分子伴侣效应以及药理学调控。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞神经科学
- 受体生物学
- 荧光成像
背景
- nAChR 对突触传递至关重要，是药物开发的重要靶点。
- nAChR 的细胞表面表达与转运受到分子伴侣蛋白的调控。
- 定量分析位于质膜与细胞内的受体群体，对于理解受体生物学功能及药物靶向机制至关重要。
- 基于环境 pH 值的差异，pH 敏感性荧光蛋白可用于区分细胞表面与内化的受体。
研究目的
- 建立在 N2a 细胞中表达 nAChR 亚基的可靠方案。
- 定量分析 nAChR 亚基在质膜与细胞内区室之间的分布情况。
- 实现对分子伴侣介导的 nAChR 转运过程及其药物学调控的研究。
使用的方法
- 使用编码与pHuji或SEP荧光蛋白标记的nAChR亚基的质粒转染N2a细胞。
- 采用基于脂质的DNA转染试剂实现高效的质粒递送。
- 在中性（pH 7.4）和酸性（pH 5.5）条件下进行活细胞共聚焦显微镜观察，以区分细胞表面与内部受体。
- 利用ImageJ软件通过校正的总细胞荧光（CTCF）进行定量图像分析，并进行统计学处理。
主要结果
- 转染后24小时内，α7-pHuji和α4-SEP/β2-pHuji nAChR在细胞膜上实现了稳定的表达。
- 在pH 7.4条件下，观察到强烈的膜荧光信号；在pH 5.5条件下，荧光被淬灭，显示出受体内化定位。
- 定量分析显示，82.6%的α7-pHuji和76.5%的α4-SEP定位于细胞膜，其余部分为内化受体。
- 三重转染实验揭示了α4和β2亚基在细胞膜与细胞内定位上的差异。
结论
- 该方案可实现对活细胞中烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）亚基定位的快速且稳健的定量分析。
- 该方法适用于同源和异源nAChR的研究，也可用于研究分子伴侣和配体效应。
- 该技术可支持针对受体转运、药物调节以及nAChR表达在疾病相关变化中的研究。
常见问题
行业重要性概述
对哺乳动物细胞中神经元型烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）定位的定量成像，解决了神经药理学研发管线中靶点验证和作用机制去风险化的一项关键挑战。该方法可精确评估受体的转运过程及细胞表面表达水平，直接为早期治疗假设的验证和分子伴侣蛋白的评价提供依据。该技术有助于提高中枢神经系统靶向药物发现中先导化合物识别和项目组合筛选的预测可信度。
生物制药研发中的策略性应用
早期发现与靶点验证
- 可实现对nAChR转运及分子伴侣介导调控的定量研究。
- 通过区分细胞膜表面与细胞内受体群体，支持功能靶点的有效验证。
- 有助于揭示新型靶点选择性治疗药物的作用机制，降低研发风险。
- 提供可靠数据，用于优先筛选受体亚型及分子伴侣相互作用。
筛选与检测方法开发
- 为下游化合物筛选和药理学调控研究制备经过验证的细胞系统。
- 利用pH敏感型荧光标记和共聚焦成像，提供标准化、可重复的定量结果。
- 支持针对受体定位和转运终点的高内涵分析方法开发。
- 支持对化合物在受体表面表达方面作用的可靠评估。
转化与临床前研究
- 将受体定位数据与疾病相关模型对齐，以推动转化生物标志物的开发。
- 通过量化药理学和分子伴侣效应，确保从发现到临床前验证的连续性。
- 降低推进靶向中枢神经系统疾病相关nAChR亚型候选药物的生物学风险。
- 为基于风险评估的推进决策提供机制性见解。
流程与工作流整合
该定量成像工作流程贯穿早期发现、先导物识别及临床前研究，支持针对nAChR干预措施的假设验证和机制确认。
- 发现生物学：支持对受体转运和分子伴侣调控进行假设驱动的验证。
- 筛选：提供可重复的定量检测结果，用于检测方法的标准化和化合物评估。
- 分析：提供经校正的总细胞荧光（CTCF）测量值，以实现对受体定位的可靠统计比较。
- 转化研究：在实验背景支持下，将受体定位数据与疾病模型和生物标志物策略相关联。
- 企业级应用：提供一个灵活的平台，可适应其他受体亚型、分子伴侣及荧光配体。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，降低受体转运研究中的机制模糊性。
- 操作价值：标准化成像与定量工作流程，实现研发团队间的可重复性与可扩展性。
- 战略价值：通过在研发早期提供可操作的定位数据，提升决策效率与资本使用率。
- 项目组合影响：基于定量的nAChR转运与表面表达指标，实现风险调整后的项目优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备活细胞共聚焦成像和定量荧光分析的专业知识。
- 需要能够使用共聚焦显微镜及ImageJ等图像分析软件。
- 要求跨团队统一成像参数和数据分析工作流程。
- 可根据实验设计适配多种nAChR亚型、分子伴侣及荧光配体。
- 依赖高效的转染效率和良好的细胞状态，以获得可重复的实验结果。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:21
Transfection of Neuro2a Cells with Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunits Using Lipid-Based Delivery
2:33
Confocal Imaging of pH-Sensitive Fluorescent Signals in Transfected Neuro2a Cells Using Live Buffer Exchange
4:34
Quantitative Analysis of Fluorescent Cell Images Using ImageJ to Calculate Corrected Total Cell Fluorescence (CTCF)
6:20
Results
8:32
Conclusion
