Name: 利用定量成像在哺乳动物细胞中定位质膜和细胞内神经元的尼古丁乙酰胆碱受体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 了解利用pH敏感荧光标记和活细胞共聚焦显微镜在哺乳动物Neuro2a细胞中定量定位神经元尼古丁乙酰胆碱受体的方法。该技术可精确区分质膜与细胞内受体分布，支持受体转运、伴侣蛋白调控及药物筛选研究。

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作者感谢 James Janoso 在显微技术方面的专业支持，以及美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所（资助编号 P20GM130443）设立的代谢转化研究中心对阿拉斯加大学费尔班克斯分校显微成像核心设施的支持。LW 的工作部分得到了阿拉斯加州通过阿拉斯加大学提供的高等教育投资基金的资助。SMS 的工作得到了美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所通过机构发展奖（IDeA，资助编号 P20GM103395）的支持。本出版物所报道的研究工作得到了美国国立卫生研究院下属国家心理健康研究所（MMW，资助编号 R03MH135358）和国家普通医学科学研究所（MMW，资助编号 R16GM150455）的支持。

注意：以下步骤描述了已成功用于瞬时转染N2a细胞系中nAChR亚基的方法（图1）。通过活细胞共聚焦显微镜观察，可在24小时内实现稳定的质膜表达。
<img alt="使用α7-nAChR DNA和ImageJ分析的细胞转染过程示意图及荧光成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69371/69371fig1.jpg" data-altupdatedat="1779163243000" data-alt="图1"> 
图1：本实验方案中各步骤的示意图。细胞在成像培养皿中培养至70%-80%融合度。随后用转染试剂与DNA复合物处理细胞。（上图）转染24小时后，可加入荧光标记的配体处理细胞，以标记细胞质膜上表达的亚基，并使用共聚焦显微镜进行成像。（下图）或者，对于转染24小时后已通过基因改造而带有pH敏感蛋白标签的nAChR亚基基因，可直接对活细胞进行共聚焦显微镜成像以获取细胞的总荧光信号。随后将pH 7.4的成像缓冲液更换为pH 5.5的淬灭缓冲液，使位于细胞质膜上的nAChR亚基所标记的pH敏感蛋白荧光信号被淬灭，仅保留细胞内亚基的荧光信号。对同一细胞再次进行成像。使用ImageJ进行图像分析，以定量细胞内和细胞外亚基的表达水平。这些步骤可根据需要调整，以纳入分子伴侣蛋白和辅助蛋白的研究。图示使用BioRender制作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69371/69371fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. N2a nAChR 瞬时转染
注意：选择 N2a 细胞系是因为其表现出神经元表型且内源性表达烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）水平较低。α7-pHuji、α4-SEP 和 β2-pHuji 亚基基因分别独立克隆于哺乳动物表达载体 pcDNA3.1(+) 中。分子伴侣蛋白 NACHO 由 pREP9 载体表达（由美国东北大学 R. Loring 博士慷慨惠赠）。所有操作步骤均需采用无菌技术，并在生物安全柜内进行。实验时需穿戴洁净实验服、护目镜和手套。所有进出生物安全柜的物品均须用 70% 乙醇擦拭清洁。以下步骤描述的是在适用于成像的 35 mm 多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿中的转染操作，不同培养容器可根据需要相应调整体积。
<ol>
	<li>在含有Eagle最小必需培养基（EMEM）的T25（或类似）组织培养瓶中培养N2a细胞，培养基中添加10%胎牛血清（FBS），必要时加入100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。于37 °C、5% CO₂条件下孵育，直至细胞融合度达到约90%。使用4倍光学显微镜物镜观察。</li>
	<li>每日使用光学显微镜监测细胞融合度，并每1-2天更换一次培养基，以维持最佳培养条件。当细胞融合度达到约90%时，即可传代至成像培养皿中。</li>
	<li>将所有试剂在水浴中预热至37 °C。操作前用70%乙醇清洁生物安全柜及所有材料。 
	注意：70%乙醇为高度易燃液体和蒸气，可引起严重眼刺激。应远离热源、火花、明火及其他点火源。储存于通风良好处，容器保持密闭。操作时需佩戴防护手套及眼部/面部防护装备。若接触皮肤或眼睛，应立即用清水冲洗，若刺激持续，需就医。可选用其他消毒剂替代，如5%-10%次氯酸钠溶液。</li>
	<li>吸除培养瓶中的旧培养基，用5 mL PBS洗涤细胞。向瓶中加入1 mL胰蛋白酶，轻轻晃动。孵育至细胞脱落（&lt;5分钟）。为防止过度消化，立即加入4 mL EMEM生长培养基，并轻轻吹打形成单细胞悬液。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定细胞浓度，并计算所需EMEM生长培养基体积，调整悬液使每1 mL含0.5-2 × 10⁵个细胞。</li>
	<li>每35 mm培养皿接种1 mL细胞悬液，并加入EMEM生长培养基至总体积为2 mL。于37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。当细胞融合度达70%-80%时，即可进行转染。</li>
	<li>转染当天，将试剂预热至37 °C，完全解冻nAChR亚基DNA，并将转染试剂恢复至室温。将所有试剂外表面用70%乙醇擦拭后放入生物安全柜中。</li>
	<li>为表达α7 nAChR：在微量离心管中，将4 µg α7（1 µg/µL）和1 µg NACHO（1 µg/µL）质粒DNA逐滴加入无抗生素的低血清培养基中，终体积为250 µL。加完DNA后轻轻吹打混匀。
	<ol>
		<li>为表达α4β2 nAChR：将每个亚基DNA各4 µg溶于共250 µL的低血清培养基中，轻轻吹打混匀。可调整各亚基比例以优化特定受体亚型的表达。</li>
		<li>若需共表达额外质粒以表达α4β2 nAChR，则各质粒DNA等量加入。pcDNA3.1(+)载体中的蓝色荧光蛋白mTagBFP2³¹可作为对照质粒，亦可替换为任意α4β2分子伴侣。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前轻轻混匀转染试剂。另取一微量离心管，将8 µL转染试剂逐滴加入250 µL低血清培养基中，室温孵育5分钟。请在25分钟内进行下一步操作。</li>
	<li>5分钟后，将稀释后的DNA溶液与稀释后的转染试剂（总体积为500 µL）逐滴混合。轻轻吹打混匀，室温孵育20分钟。DNA-脂质复合物在6小时内保持稳定。</li>
	<li>复合物形成期间，从培养箱中取出培养皿，弃去原培养基，更换为1 mL无血清EMEM（不含抗生素）。</li>
	<li>将500 µL DNA-转染试剂复合物逐滴加入每皿中（终体积为1.5 mL）。轻轻摇动培养皿，确保液体均匀分布，尤其覆盖玻底表面。于37 °C孵育24小时，4-6小时后更换培养基以促进细胞健康。</li>
</ol>
2. 使用αBTX Alexa Fluor 647对质膜表达的α7 nAChR进行活细胞标记
注意：以下步骤通常在转染后 24 小时进行。需将 αBTX Alexa Fluor 647（αBTX-AF647）避光保存，以防止荧光染料发生光降解。
<ol>
	<li>将所有试剂预热至 37 °C，并解冻 αBTX-AF647 储存液（2.3 µM）。用 70% 乙醇清洁后置于生物安全柜中。</li>
	<li>从培养箱中取出转染了 α7 和 NACHO DNA 的细胞培养皿，用 70% 乙醇擦拭外表面，然后放入生物安全柜中。</li>
	<li>通过真空抽吸弃去旧培养基。加入 2 mL 新鲜 EMEM 生长培养基以洗涤细胞。</li>
	<li>再次通过真空抽吸去除洗涤用培养基。向培养皿中加入 2 mL EMEM 生长培养基。</li>
	<li>更换适量培养基并加入 αBTX-AF647，使终浓度达到 80 nM。于 37 °C 培养过夜。</li>
	<li>次日早晨，将 PBS 或选用的成像培养基预热，并用 70% 乙醇清洁后转移至生物安全柜中。</li>
	<li>将转染后的细胞从培养箱中取出，清洁后置于生物安全柜中。</li>
	<li>移除含有 αBTX-AF647 的旧培养基，并将其放入适当的废液容器中。</li>
	<li>用 2 mL PBS 在室温下洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。该冲洗步骤可去除未结合的配体和碎片，洗涤时间可根据研究人员需求调整。每次洗涤后均需移除 PBS。</li>
	<li>加入 2 mL PBS 或选用的成像培养基，随后使用共聚焦显微镜对细胞进行成像。</li>
</ol>
3. 全细胞与胞内 α7-pHuji nAChR 的活细胞成像
注意：以下实验步骤使用实验室自制的 α7-pHuji pcDNA3.1 质粒，并与 NACHO 分子伴侣共转染。在结果部分所述的实验中，采用类似方案将 α4-SEP 和 β2-pHuji 表达于 pcDNA3.1 载体中，并以对照质粒 mTagBFP2 pcDNA3.1 进行转染。整个操作过程中需避免样品暴露于光照，以防止荧光团发生光降解。
<ol>
	<li>按所述方法配制 pH 7.4 成像缓冲液（表1）和 pH 5.5 淬灭缓冲液（表2）23。</li>
	<li>将试剂预热至 37 °C，用 70% 乙醇清洁后转移至生物安全柜中。从培养箱中取出转染后的细胞，用 70% 乙醇清洁后放入生物安全柜内。</li>
	<li>用抽吸法移除旧培养基。在室温下用 2 mL PBS 漂洗培养皿 3 次，每次 10 分钟。加入 2 mL pH 7.4 成像缓冲液。</li>
	<li>将培养皿转移至共聚焦显微镜。将含 pH 7.4 成像缓冲液的培养皿插入载物片架，并将载物片架放入预热的共聚焦显微镜环境培养室中。</li>
	<li>将蠕动泵管路连接至成像培养皿架，并关闭培养室。</li>
	<li>打开成像软件，选择目标荧光染料对应的激光器（pHuji 566/598 nm，α4-SEP 499/520 nm，β2-pHuji 568/603 nm，以及 mTagBFP2 359/461 nm）。</li>
	<li>使用 10x–60x 物镜扫描培养皿以定位待成像细胞。如需更高放大倍数，可调高物镜倍数，并根据需要调整焦平面深度。</li>
	<li>调节激光强度和探测器灵敏度，以在无背景信号的情况下观察荧光。如需增强荧光信号，可调整孔径。</li>
	<li>选择合适的分辨率，并使用所需物镜（例如 60x）采集单张图像。</li>
	<li>记录培养皿上的成像位置，以便在更换为 pH 5.5 淬灭缓冲液后重新定位相同细胞。</li>
	<li>在培养皿多个区域重复成像过程，并记录每个新位置。所有图像（实验组与对照组）均需使用相同的采集参数，以确保结果具有可比性。</li>
	<li>仅保留出口管路与蠕动泵连接，缓慢将培养皿中的 pH 7.4 缓冲液抽入废液容器中。</li>
	<li>当大部分缓冲液已被移除（避免细胞干燥）时，将进样管路转移至 pH 5.5 淬灭缓冲液中。</li>
	<li>启动蠕动泵，缓慢向培养皿中加入 pH 5.5 缓冲液（1.5 mL/min），确保细胞保持贴壁状态。</li>
	<li>运行泵 20 分钟，观察缓冲液是否正确流入和流出培养皿。</li>
	<li>关闭泵，使细胞在 pH 5.5 淬灭缓冲液中继续孵育 20 分钟，以达到平衡。</li>
	<li>如需重复成像，加载上一次会话中保存的位置，返回相同区域进行成像。</li>
	<li>确认焦平面深度和位置准确，因缓冲液更换后可能发生偏移。</li>
	<li>在所有已保存位置下，使用 pH 淬灭条件重复成像。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-glucose</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>调节溶液至 pH 7.4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：成像缓冲液配方。 将以下试剂混合，并将溶液调节至pH 7.4。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>浓度 (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-glucose</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>调节溶液至 pH 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：淬灭缓冲液配方。 将以下试剂混合，将所得溶液调节至pH值为5.5。
4. 图像定量分析
注意：本实验步骤介绍如何使用 ImageJ（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州）和校正后的总细胞荧光（CTCF）方法32对细胞图像进行分析。
<ol>
	<li>打开 ImageJ 打开待分析的图像。该图像将显示为一个堆栈，其中每个捕获的通道在同一帧内分开显示。</li>
	<li>导航至 相 通道。如果图像过亮（常见于空白或背景区域），请选择 过程 &gt; 增强对比度，然后点击 好的.</li>
	<li>使用 放大镜工具，放大（+) 在一个细胞上。使用 自由选择工具在相位通道中描摹细胞的轮廓。</li>
	<li>切换到与目标荧光染料对应的荧光通道。通过选择设定所需的测量参数 分析 &gt; 设置测量参数确保 面积，平均灰度值，以及 积分密度 进行检查。</li>
	<li>要测量选定区域，请选择 分析 &gt; 测量 或按压 Command + M （Mac）/ Ctrl + M （Windows）</li>
	<li>在细胞附近的空白区域进行三次背景测量。对所需数量的细胞重复上述步骤。</li>
	<li>测量数据将显示在 ImageJ 的独立结果窗口中。 复制 和 请提供需要翻译的源文本内容。 这些数据到 Excel 用于分析。</li>
	<li>计算三次背景测量值的平均背景均值。</li>
	<li>使用以下公式计算每个细胞的 CTCF 值： 
	CTCF = 综合密度 −（细胞面积 × 平均背景荧光强度）</li>
	<li>对每个实验组（以及适用时的不同pH条件）的多个细胞和图像重复此过程。将所有结果导出至数据分析软件进行统计处理。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述在哺乳动物N2a细胞中表达和定量nAChR亚基的方法，解决了长期以来在药物发现、定位和运输研究中实现快速（约24小时）且高效（&#62; 60%）的nAChR质膜表达的难题。该系列实验方案的一个关键优势在于其适用于同源五聚体（α7）和异源五聚体（α4β2）nAChR，并且很可能也适用于其他nAChR亚型，以及分子伴侣蛋白的共表达。通过利用pH敏感性标签（如SEP和pHuji），该方法能够在活细胞中区分并定量位于质膜和细胞内的nAChR群体。这种区分至关重要，因为不同nAChR亚型的运输依赖多种分子伴侣和辅助蛋白（包括14-3-3、NACHO、RIC-3和lynx-1蛋白）以及配体（如尼古丁）17,18,35,36,37,38,<...

神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）是一类配体门控跨膜离子通道，表达于多种细胞类型的质膜上，包括神经元、胶质细胞和免疫细胞。这些受体由α（α2-α10）或β（β2-β4）亚基组成，可组装形成同源或异源亚型，其中α7和α4β2 nAChR是大脑中最丰富的亚型1,2。这些亚型的失调已与阿尔茨海默病、尼古丁使用障碍、睡眠相关性高运动性癫痫、帕金森病以及重度抑郁障碍等多种神经和精神疾病相关联3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。快速且可靠地表达和定量nAChRs的方法对于理解疾病机制以及开发靶点选择性治疗药物至关重要。然而，实现这些受体在质膜上的高效表达通常具有挑战性且耗时。本文所述方法可在DNA转染后约24小时内实现nAChRs的强效细胞表面表达，并可与调节受体转运的配体或分子伴侣蛋白联合使用。
表达nAChR的方法有多种，包括瞬时DNA转染或构建稳定表达特定亚型的细胞系。尽管构建稳定细胞系适用于长期研究同一种受体亚型，但该过程耗时耗力，可能需要数月时间。一旦建立，这些细胞系在不同传代过程中可能出现受体表达水平不一、随时间推移表达丢失，或筛选出受体功能或密度次优的克隆13。将孵育温度从37 °C降低至30 °C、添加尼古丁等分子伴侣，或延长孵育时间，均可促进受体在细胞表面的表达13,14,15。这些局限性在异源寡聚型nAChR中尤为显著，因其需要正确的亚基组装和转运，也对聚焦于分子伴侣辅助调控受体功能的研究构成挑战。因此，在使用稳定表达nAChR的细胞系时，必须常规验证不同传代过程中受体亚型的表达情况。
研究人员通常关注nAChR亚基变体以及分子伴侣或辅助蛋白亚基，因此需要快速连续地表达多种DNA，以便在实验中实现快速灵活的调整。在此方面，nAChR的瞬时表达具有优势，因为该过程可在较短时间内完成，使研究人员能够在无需等待数月建立稳定细胞系的情况下，研究多种受体亚型或不同的实验条件。即使采用瞬时表达，一个常见现象是：在37 °C诱导24小时后，许多nAChR仍滞留在细胞内，需要额外孵育&#62;48小时16,17。例如，在缺乏胆碱酯酶抑制剂抗性蛋白（resistant to inhibitors of cholinesterase, RIC）-3这一分子伴侣蛋白时，仅有约1%的α7 nAChR表达于哺乳动物SHE-P细胞的质膜上18；而当共表达RIC-3时，约有20%的α7 nAChR可在细胞表面检测到。尽管这已有所改善，但受体总丰度仍然较低。将α7 nAChR与NACHO共表达可进一步增强其表面表达，但转运至质膜的受体仍不足总受体群体的40%19。另一种策略是将转染后的细胞在30 °C下孵育，以提高质膜表达水平20,21。对于α4β2 nAChR而言，降低培养温度可使其表面受体密度增加五倍，而总亚基蛋白水平并未相应升高21。然而，该方法至少需要额外一天时间，并增加耗材、试剂和仪器的使用。 
本研究提供了一套优化的方法，可在转染后24小时内于哺乳动物N2a细胞中表达并定量特定的nAChR亚型，实现约83%的α7、77%的α4和56%的β2亚基定位于质膜。对于α7 nAChR，可通过α7选择性荧光标记的α-银环蛇毒素（αBTX）或重组荧光标签来定量其在质膜上的表达。为标记各个亚基，将pH敏感性荧光蛋白pHuji和超增强型pHluorin（SEP）22,23,24&#160;分别构建至各nAChR亚基的C末端25,26。pHuji和SEP分别为红色和绿色荧光蛋白的pH敏感变体，在pH 7.4时发出荧光，而在更酸性的条件下荧光被淬灭27,28。由于SEP和pHuji在pH &#60; 6时荧光受到抑制，因此任何观察到的细胞内信号均反映的是位于中性区室而非质膜上的荧光团。需要注意的是，某些细胞器（如高尔基体）具有酸性腔室，因此当亚基在分泌途径中转运时，连接在其C末端区域的荧光团无法被检测到29。在pH 7.5与pH &#60; 6条件下测得的总荧光信号之差，代表了位于质膜上的nAChR所产生的信号。利用活细胞共聚焦显微镜成像可提供高空间分辨率，从而实现对亚基定位的精确定量。此外，所有实验均在活细胞上进行，使得每个细胞可作为自身的对照，以校正同一处理组内不同细胞间蛋白表达的变异性30。该方法还可进一步拓展，用于引入额外的分子伴侣蛋白（如NACHO或其他蛋白），以研究nAChR的转运过程。其他应用包括药理学调控、辅助亚基的整合，以及分析与疾病相关的nAChR表达变化。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X)&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>α-银环蛇毒素 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>B35450</td><td>α-银环蛇毒素偶联物</td></tr><tr><td>BSL-1级生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>无菌细胞培养工作区</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9224</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>MilliPore Sigma&amp;nbsp;</td><td>G8270</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的EMEM培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>无内毒素DNA</td><td>使用Zymo试剂盒自行制备</td><td>不适用</td><td>用于细胞瞬时转染的nAChR DNA</td></tr><tr><td>无内毒素微量离心管，0.5 mL&amp;nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>89000-010</td><td>DNA与转染制备</td></tr><tr><td>无内毒素微量离心管，1.5 mL&amp;nbsp;</td><td>Aventor/VWR</td><td>20170-038</td><td>DNA与转染制备</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Aventor/VWR</td><td>97068-085</td><td>血清添加剂</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>MatTek玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>成像用培养皿</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v. 10</td><td>GraphPad Prism</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliPore Sigma&amp;nbsp;</td><td>H3375</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Thermo scientific</td><td>413410025</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>MES水合物</td><td>MilliPore Sigma&amp;nbsp;</td><td>M5287</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>mTagBFP2-pBAD</td><td>AddGene&amp;nbsp;</td><td>54572</td><td>用于细胞瞬时转染的对照DNA&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neuro 2a (N2a) 细胞</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>CCL-131</td><td>用于DNA转染和nAChR表达的细胞</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Aventor/VWR</td><td>K952-100mL</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>MiniPuls3</td><td>成像过程中缓冲液更换&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-131</td><td>生理盐水缓冲液</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond&amp;nbsp;</td><td>140084</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>移液吸头（无菌且无内毒素，1000 μL）</td><td>Rainin</td><td>30389216</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>移液吸头（无菌且无内毒素，20 μL）</td><td>Rainin</td><td>30389229</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>移液吸头（无菌且无内毒素，250 μL）</td><td>Rainin</td><td>30389246</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>移液器，P10</td><td>Rainin&amp;nbsp;</td><td>L-10XLS</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>移液器，P100</td><td>Rainin&amp;nbsp;</td><td>L-100XLS</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>移液器，P1000</td><td>Rainin&amp;nbsp;</td><td>L-1000XLS</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>MilliPore Sigma&amp;nbsp;</td><td>P3911</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>血清移液管（无菌且无内毒素，10 mL）</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-898</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>血清移液管（无菌且无内毒素，25 mL）</td><td>Aventor/VWR</td><td>89130-900</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>血清移液管（无菌且无内毒素，5 mL）</td><td>Aventor/VWR</td><td>76201-710</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>血清移液管（无菌且无内毒素，50 mL）</td><td>Aventor/VWR</td><td>75816-088</td><td>精确液体转移</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Aventor/VWR</td><td>BDH9286</td><td>缓冲液组分</td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>培养用器皿</td></tr><tr><td>ZymoPure II 质粒大提试剂盒</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>D4203-A + D4203-B</td><td>无内毒素DNA的制备</td></tr><tr><td>&amp;alpha;4-SEP&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific GeneArt 基因合成服务&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>定制基因合成服务</td></tr><tr><td>&amp;alpha;7-pHuji</td><td>Twist Bioscience</td><td>https://www.twistbioscience.com/</td><td>定制基因合成服务</td></tr><tr><td>&amp;beta;2-pHuji</td><td>ThermoFisher Scientific GeneArt 基因合成服务&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html</td><td>定制基因合成服务</td></tr></tbody></table>

利用哺乳动物细胞中的定量成像技术定位质膜及细胞内神经元型烟碱乙酰胆碱受体

Localization of Plasma Membrane and Intracellular Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors Using Quantitative Imaging in Mammalian Cells

定量分析表达在哺乳动物细胞质膜上的神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）对于开发新型靶点选择性治疗药物以及研究调控受体转运的分子伴侣蛋白具有重要意义。本研究提供了一套可靠的方法，用于在哺乳动物 Neuro2a（N2a）细胞中表达同源和异源 nAChRs，并利用 pH 敏感性荧光标签定量分析其在细胞表面与细胞内定位的分布情况。pHuji 和超嗜光性 pHluorin（SEP）是 pH 敏感性荧光蛋白，可被设计用于标记重组蛋白，从而实现对 nAChR 亚基空间分布的可视化。这些荧光标签在中性 pH 条件下可发射荧光，但在酸性环境中荧光被淬灭。为追踪 α7、α4 和 β2 nAChR 亚基在细胞内与质膜上的相对定位，可将 pHuji 或 SEP 连接到各 DNA 构建体的 C 末端。为在 N2a 细胞中共同表达 α7-pHuji 与其分子伴侣 NACHO，或共表达（α4-SEP；β2-pHuji），采用基于脂质的 DNA 转染试剂。转染试剂与质粒 DNA 分别在低血清培养基中室温孵育，随后混合形成脂质-DNA 复合物，以促进质粒进入细胞。转染后，利用活细胞共聚焦显微镜在高 pH 与低 pH 条件下，或在存在亚型选择性荧光配体的情况下对细胞进行成像。通过在相应荧光通道中计算校正后的总细胞荧光强度，对图像进行分析，从而获得荧光标记 nAChR 亚基在质膜与细胞内区室之间分布的定量信息。活细胞共聚焦成像可实时追踪 nAChR 亚基的定位，以区分细胞内与细胞表面受体群体之间的差异。在 37 °C 条件下孵育 24 小时内，即可实现 α7-pHuji 或（α4-SEP；β2-pHuji）在质膜上的稳定表达。该方法可进一步拓展，用于引入其他分子伴侣、辅助亚基或荧光配体，以研究 nAChR 的转运机制、药理学调控以及与疾病相关的 nAChR 表达改变。

完成上述转染步骤后，α7 nAChRs 与 NACHO 分子伴侣蛋白在 N2a 细胞中共同表达。在转染 DNA 24 小时后，对未转染和已转染的细胞均使用 αBTX-AF647 进行标记。由于 αBTX 不具有细胞膜通透性，所有检测到的荧光信号均来源于细胞质膜上的受体。如预期所示，在未转染的 N2a 细胞中，图 2A、A′ 显示了微弱的 αBTX-AF647 染色信号。N2a 细胞内源性表达少量 α7 nAChRs，这解释了该微弱标记现象。相比之下，成功转染的细胞表现出强烈的 αBTX-AF647 标记信号（图 2B、B′）。荧光信号呈现为离散的斑点，通常与细胞质膜上的表达相关29。已知 nAChRs 在与配体结合后可发生内吞，进入循环内体。因此，部分胞内标记可能代表最初位于质膜上、随后被内化的受体。根据步骤 4 中所述的 CTCF 方法进行定量分析，证实转染了 α7 nAChR DNA 的细胞其质膜表达...

本方案描述了利用哺乳动物 Neuro-2a 细胞系表达并定量神经元型烟碱乙酰胆碱受体亚基的方法。通过 pH 敏感性荧光标签结合共聚焦显微镜，可精确评估受体在质膜上的定位情况，以及在 pH 中性细胞内区室中的表达情况，从而促进对 nAChR 转运过程及药物学调控机制的研究。

定量哺乳动物细胞质膜上表达的神经元烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）对于药物研发……

了解烟碱型乙酰胆碱受体向哺乳动物细胞质膜的转运过程，对于研究分子伴侣介导的调控机制以及评估靶点选择性治疗药物至关重要。将pH敏感探针与活细胞共聚焦显微镜结合使用的主要优势在于能够高空间分辨率地确定亚基的位置。首先，将试剂预热至37摄氏度。将nAChR亚基DNase完全解冻，并将转染试剂置于室温。将所有试剂用70%乙醇清洁后放入生物安全柜中。为表达α-7 nAChR，在微量离心管中，将α-7和NACHO质粒DNase加入低血清培养基中稀释。加入DNA后，通过移液轻轻混匀。或者，为了表达α4β2受体，将每种亚基DNA各4微克稀释至总共250微升的低血清培养基中，并轻轻混匀。调整亚基比例以优化特定受体亚型的表达。对于含有额外质粒的α4β2受体，加入等量的每种质粒DNA。接着，在新的微量离心管中，将8 µL转染试剂逐滴加入250 µL低血清培养基中。室温孵育5分钟后，将稀释后的DNA与稀释后的转染试剂逐滴混合于同一管中。用移液器轻轻混匀，在室温下孵育20分钟。在复合物形成的同时，将培养皿中的培养基更换为1毫升无血清EMEM。将500微升DNA转染试剂复合物逐滴加入每皿中。轻轻晃动培养板以使液体均匀分布，尤其注意覆盖玻底表面。将培养板置于37°C孵育24小时，并在4–6小时后更换培养基。用抽吸法移除旧培养基。在室温下，用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养皿三次，每次10分钟。然后向培养皿中加入2毫升pH 7.4的成像缓冲液。将成像用培养皿插入共聚焦显微镜的载片架中，并将载片架放入预热的环境培养室中。将蠕动泵管路连接到成像培养皿支架上，并关闭环境培养箱。接着启动成像软件，为感兴趣的荧光染料选择相应的激光器。使用10–60倍物镜扫描培养皿，定位待成像的细胞。根据需要增加放大倍数，并调整焦深。选择所需的分辨率，使用选定的物镜拍摄单张图像。在培养皿图上记录成像位置，以便在更换缓冲液后重新定位相同的细胞。使用相同的采集设置，对培养皿上的多个区域重复成像。仅保留连接至蠕动泵的出口管路，缓慢将 pH 7.4 缓冲液从培养皿中抽吸至废液容器中。随后将进口管路转移至 pH 5.5 淬灭缓冲液中。打开蠕动泵，以每分钟1.5毫升的流速加入pH 5.5的缓冲液，确保细胞保持附着状态。20分钟后，关闭泵，并将细胞在缓冲液中继续孵育20分钟，以达到平衡。孵育结束后，对已保存的位置重复进行成像。开始图像定量分析时，打开 ImageJ 并载入待分析的图像。图像将以堆栈形式显示，每个捕获的通道均在同一画框中呈现。导航至相差通道。如果图像显得过亮，请选择“处理”并选择“增强对比度”，然后单击“确定”。使用放大镜工具放大单个细胞。使用自由选择工具在相位通道中勾勒出细胞的轮廓。然后切换到与目标荧光染料相对应的荧光通道。通过选择“分析”并点击“设置测量”来设定所需的测量参数。确保勾选“面积”、“平均灰度值”和“积分密度”。要测量选定区域，请选择“分析”，然后点击“测量”。通过追踪所选细胞附近的空白区域，进行三次背景测量。完成所有目标细胞的测量后，将测量数据复制并粘贴到 Excel 中进行分析。然后根据三次背景测量结果计算平均背景均值。使用提供的公式计算每个细胞的校正后总细胞荧光值（CTCF）。采用相同的工作流程，分析缓冲液更换后获得的图像。将所有结果导出至数据分析软件进行统计处理。在未转染的N2a细胞中观察到微弱的α-BTX AF647染色，而在转染了α-7 DNA的细胞中则检测到强烈的斑点状标记。定量分析证实，与未转染的对照组相比，转染α-7的N2a细胞中α-7 nAChRs在细胞膜上的表达显著升高。在pH 7.4条件下，可在细胞膜上观察到完整的α-7 pHuji荧光信号。在转染的N2a细胞中。在pH 5.5时，alpha-7 pHuji荧光减弱，显示出受体内化定位。细胞外的alpha-7 pHuji受体荧光占受体表达的大部分。定量结果显示，82.6%的α-7 pHuji受体位于质膜上，而17.4%处于细胞内。当pH恢复至7.4时，荧光信号恢复，证实pHuji信号具有可逆性。在pH 7.4条件下，表达α-4 SEP和β-2 pHuji的N2a细胞中，两个亚基均显示出强烈的膜荧光。在 pH 5.5 条件下，荧光被淬灭，表明部分 alpha-4 SEP 和 beta-2 pHuji 亚基定位于细胞内部。定量结果显示，76.5% 的 alpha-4 SEP 位于质膜，23.4% 位于细胞内。在三重转染细胞中，alpha-4 SEP 表现出 82.8% 的膜定位和 17.2% 的内部表达。在同一细胞中，63.4%的beta-2 pHuji亚基定位于细胞膜上，而36.6%位于细胞内。利用本方案，我们表征了新型分子伴侣对烟碱型受体表达与转运的影响，并评估了新的靶向选择性治疗药物。本方案的优势在于可适用于同源和异源烟碱型受体，能够量化受体在细胞内的相对定位。我们的方法能够实现烟碱型受体在质膜上的快速且稳定的表达，有助于分子伴侣介导的转运分析以及药物发现工作。

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来源：Zhang, J.，等。视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析。J. Vis. Exp.

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通过光激活型尼古丁的激光闪光光解法探查小鼠脑片中烟碱型乙酰胆碱受体功能

本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。...

使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

了解利用pH敏感荧光标记和活细胞共聚焦显微镜在哺乳动物Neuro2a细胞中定量定位神经元尼古丁乙酰胆碱受体的方法。该技术可精确区分质膜与细胞内受体分布，支持受体转运、伴侣蛋白调控及药物筛选研究。

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